课题_大鼠冰冻切片

+ 未经固定的组织切片时冰晶较多，这是公
认的事实，即使固定后的组织切片仍然会 有一定的冰晶，为防止冰晶的形成，常可 采取如下方法： 1.速冻法：将组织置入低 温环境，使组织骤然降温。2.利用高渗溶液 吸收组织分子：将组织置于20% ——30%的 蔗糖溶液中， 置4摄氏度冰箱足够时间，观 察组织快，待其沉底后，取出切片。这样 即可大大减少冰晶的形成。
+ 冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的
固定液固定1分钟后即可染色。以往，为了防止切 片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹 干后再固定。根据实验对比认为这种做法欠妥未 经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核 内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后 镜下分辨不出核内的各种物质。冰冻切片附贴于 载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这 样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变 化的情况下被固定起来，经一年多来1000例冰冻 切片的制作实践认为这样制作固定切片好，核染 色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存。
+ 破碎的组织切片必然丢失实验信息，切片的完整性对研究结果的分析
无疑十分重要。切片破碎不全、有缺损的常见原因有： 1组织固定不 完全； 2温度设置不当。组织块过冷、过硬，则切片就容易破碎。组 织块冷冻不够，硬度和韧度达不到，切片也同样易粘、易碎；3组织 块带有皮肤、包膜、过大或冰晶过多；4 切片刀钝或较脏，切片出现 刮痕，使切片不完整；5操作手法不当，如速度不适宜，切片也可能 不完整。遇到上述情况，应有针对性的采取相应的措施。如注意组织 固定充分、尽量减少冰晶的形成，保持刀片的清洁与锋利，冷冻温度 要适宜，不同的组织应设置不同的温度，如较大组织块或含有较多脂 肪的组织应设置温度相对较低 ，冷冻时间稍长些。而脑、脊髓等温度 设置相对高些有作者采用“边冻边切”法制作切片，同样也取得较好 的效果。若组织带有不必要的皮肤或包膜，应尽量去除干净；如必须 保留皮肤或包膜，应注意采取相应的切片技术，如最好将皮肤或包膜 的平面与刀面垂直。此外，在切片时，应注意速度均匀。当然，要做 好这些，必须有一定的实践经验。
+ 封入气泡注意通过挤压盖玻片将气泡排除。
+ 滴蛋白甘油过多封片时滴过多的蛋白甘油，
就使整个片子显得不干净，影响观察，因 此，应注意适量，万一过量，可先用滤纸 沾干，片子晾干后，可用绸布蘸二甲苯擦 除。
+ 优点43; + +
脱水、透明、包埋等手续即可 进行切片，减少了一些中间环 节。 快速，用时短。 组织变化不大。 能很好保存脂肪，类脂等成分。 能够比较完好地保存各种抗原 活性及酶类，特别是对于那些 对有机溶剂或热的温度耐受能 力较差的细胞膜表面抗原和水 解酶保存较好。
+ 切片固定30秒－1分钟。
+ 水洗。 + 染苏木素3－5分钟。
+ 分化。
+ 于碱水中返蓝20秒。
+ 伊红染色10－20秒。
+ 脱水，透明，中性树胶封固。
+ 标本经固定或不固定均可，但经过固定的组织切片冰晶少，
细胞挤压变形小，切片完整，染色清晰，而未固定的组织 冰晶多，细胞挤压变形大，甚至会影响观察结果。因此， 除特别需要外，一般较多采用组织固定后再行切片。固定 方法有浸入法和灌注法，浸入法主要用于活检和手术标本， 以及其它不能进行灌注的组织固定。灌注法适用于动物实 验研究。用于组织固定的固定剂种类很多，包括醛类、非 醛类、丙酮及醇类等，其中以中性缓冲液配制多种聚甲醛 较为常用2’，- 3组织固定时，一方面固定液要有足够的 量，另一方面还要保持一定时间，一般在快速灌注固定取 材后，多用相同的固定剂再固定! % " ，以使组织充分固定， 这对保持切片的完整性尤为重要。
+ 切片卷缩是指切片不进入防卷板与刀台之间或当掀起防卷
板时切片卷起。常见原因有：切片刀钝或粘有组织碎屑、 防卷板位置不正确或防卷板较脏、静电或者气流作用、防 卷板温度高、室温高等。可采取以下对策： 1保持防卷板 干净、平整、无缺损、无刮伤，与切片接触面应为磨面， 其边缘应于切片刀边缘平行。2采取相应措施去除静电， 操作者应尽可能戴口罩，以避免呼出的气流直接吹到防卷 板。3切片时间过长时，应注意间隔一会儿，盖上冷冻室 盖，降低防卷板温度。4 开放式冰冻切片机，切片时暴露 空气中，温度不易控制，在高温季节，切片非常容易卷缩， 切片技术难度大，采用冻刀加冻台法效果好些。
及免疫组织化学方法等。
+ 用于证明脂肪及类脂和神经组织髓鞘的染
色时的切片。 + 用于临床手术的快速病理诊断。
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近年来随冰冻切片技术的发展, 冰冻切片质量明显提高, 但与石蜡切片相比仍 有一定的差距。石蜡切片由于组织受福尔马林的作用, 固定迅速而完全, 且组 织经脱水透明及浸蜡多道步骤后, 使游离在组织中一些小分子物质被洗脱, 组 织再经过充分的脱脂后非常容易与染色剂亲合。故石蜡切片中细胞界限明确。 染色分明, 背景清晰。 由于冰冻切片的制作原则与石蜡切片不同, 制作一张质量高的冰冻切片不 仅要做到组织速冻完全, 防止冰晶产生, 并需注意切片染色的各个操作环节, 而 且冰冻切片固定完全与否也会对切片质量产生很大的影响。实验组冰冻切片 先经HS 固定液, 使其具有与石蜡切片相类似的环境, 组织固定彻底, 经流水冲 洗, 将多余的固定液和切片中溶于固定液的小分子物质洗去, 这就消除了切片 被遮盖以至染色模糊的缺点。切片再经第二液Clarke 固定液的再固定及酒精 脱脂作用,使染色剂与组织亲合性增强染色鲜明。还消除了因细胞核固定不良, 所致染色对比不分明的缺陷。对照组切片未经HS 固定液及流水冲洗而直接入 Clarke 固定液, 固定效果不如双重固定法, 与实验组切片相比较则显染色不甚 清晰, 背景模糊。 通过使用两种不同固定方法结果的比较, 我们认为双重 固定液法在冰冻切片中应用良好, 明显优于Clarke 氏单液固定法, 值得推广应 用。
+ 冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬
度, 然后进行切片的一种方法。因其制作过程较石蜡切片 相对简便、快捷, 都应用于手术中快速病理诊断。我科于 1975 年开展术中冰冻切片检查, 1995 年采用快速恒冷式切 片机(德国LE2ICACM1850) , 作冰冻切片1100 余例, 其中包括 乳腺、肺、喉、甲状腺、淋巴结、消化道、泌尿道、卵巢、 子宫、皮肤等组织。结果显示, 切片顺利, + 制作效果满意, 为病理诊断提供了可靠的依据。既免除了 患者多次手术带来的巨大痛苦, 又节约了患者的住院费用, 深受广大临床医生及患者的欢迎及好评。
+ 冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻
切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环 制冷冰冻切片法等。这些方法，随着时代 的变迁，科技的发展，许多年前被认为是 非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。 当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法， 正在受到青睐。
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取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完 整，最好为24×24×2mm。 取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。 小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上 细小组织，滴上包埋剂。 将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将 组织修平。 调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多 细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。 调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要 细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第 一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便 可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。 应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同 的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时， 冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- -15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等 组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含 大量的脂肪时，应调至-30℃。
+ 缺点： + 不容易做连续切片。 + 切取的组织不能过大，组
织过大不容易冻结或者组 织冻结不均，影响切片及 染色效果。 + 不容易制作较薄的切片。 + 组织块在冻结过程中容易 产生水的结晶而影响细胞 的形态结构及抗原物质的 定位，并且组织结构也不 如石蜡切片清晰。
+ 用于有些水解酶的定位的组织化学方法以
+ 载玻片粘不上切片。此情况多见于准备片
染的载玻片温度过低，只要使载玻片与切 片间有一定温度差，切片即可贴到载玻片 上，一般将载玻片置于常温即可。’, ( 贴 片时切片易碎。排除固定不充分等因素外， 漂片处理贴片时应注意动作轻、稳、准。 根据切片大小，选用笔尖软硬适中、大小 合适的毛笔，将笔尖伸入片下水中，往上 轻轻将切片挑起，并展开。
+ 临床病理工作中经常遇到一些微小组织做冰冻切片,我们体
会到,异体脏器组织包埋法中的异体脏器组织存留在载玻片 上,不易擦除干净,留有背景对切片外观有影响,时有微小组 织与异体脏器组织间包埋时易产生间隙,给切片带来不便。 石蜡包埋托法往往因包埋托有一定厚度影响冷冻时间,而且 仍然需要OCT 包埋剂。合成胶水水溶性好,与组织结合紧密, 二者形成完整整体,而且冷冻后硬度相当,利于切片,切片上 的胶膜水洗后完全溶解,不会造成污染和遗留背景色。合成 胶水用量少,冷冻时间短,组织不会形成冰晶 ,因此镜检时细 胞形态完整,染色清晰。合成胶水来源简便、经济、冷冻快 速。实为一种实用的替代方法。