蛋白质工程的定点突变

20世纪80年代以来，基因克隆技术与DNA化学合成方法相结合，建立和发展了定点突变技术。

可以按照预定设计，在已知的DNA序列中增删或转换核苷酸，精确地是靶基因在特定位点发生碱基序列的变化，进而使基因表达及调控，基因产物发生相应改变。

这种快速精确的基因突变已经被广泛地应用与基因工程和蛋白质工程之中。

定点突变有多种方法，有的改变特定核苷酸，有的则是对一段最可能影响蛋白质功能的基因序列进行随机突变，产生一系列突变蛋白质。

寡核苷酸诱导的定点突变基本上分两类：一类是用单链噬菌体M13作载体的寡核苷酸介导的单链模板定点突变；另一类用双链质粒作载体，双引物法定点突变。

为了在体外导入特定的点突变，小的限制性片段可以切除，并被包含所需要突变的合成接头所替代（称为盒式诱变）。

如果不行，插入片段可以克隆到产生单链DNA的噬菌粒载体中，由所设计的错配引物知道DNA复制，产生异源双链的复制型，并在下面的复制循环中产生野生型和突变的复制型。

(图）
单链噬菌体作载体的定点突变的基本原理是，用已知序列的环状DNA变性后为模板，人工合成一段引物，将所要设计的定点突变寡核苷酸置于引物中，也就是说人工所合成的引
物不是完全和模板互补，而是在某个位点有意识地让碱基突变，和模板上的碱基不能配对，由于其他的碱基是互补的，所以任然可以通过复性，使引物和模板特异性结合。

在M13单链环状模板上杂交一段寡核苷酸引物，利用DNA聚合酶和连接酶的作用，从引物延伸合成链，得到一个闭合环状的异源双链分子。

由于预先在寡核苷酸引物中人为地引入碱基的错配对，插入或缺失，然后在将杂合双环DNA转化到细菌中，因此异源双链DNA经转化和筛选就可以分离到带有相应突变的DNA克隆。

由于复制是半保留复制，经克隆后将有一半的后代环状DNA产生了定点突变，另一半和正常的亲代链一样。

环状双链质粒DNA作为载体进行基因的改造有它的优点。

待改造基因中如有两个适当的限制性内切酶切点，可以用人工合成双链DNA片段置换两切点之间原有序列，在人工合成的双链DNA片段中包含有突变的序列。

但是这种置换方法收到限制酶酶切位点的限制。

1.用M13DNA进行的寡核苷酸引物介导的定点突变：寡核苷酸引物介导的定点突变的步骤是用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。

主要过程是：（1）将待突变基因克隆到突变载体上；
2.制备含突变基因的M13DNA单链模板；
3.引物与模板与模
板退火，5/端磷酸化的突变寡核苷酸引物与待突变的寡核苷酸引物与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的DNA 4.合成突变链，在DNA聚合酶的催化下，引物以单链DNA为模板合成全长的互补连，而后由连接酶封闭缺口，产生闭环的异源双链的DNA分子；5.转化和初步筛选异源双链DNA分子转化大肠杆菌后，产生野生型，突变型的同源双链DNA分子，可以用限制性酶切法，斑点杂交法和生物来初步筛选突变的基因；6.对突变体基因进行序列分析。

改进型双引物诱变原理是将目的基因克隆到M13噬菌体载体中，提取M13单链DNA，作为PCR的模板；设计两个引物，这两个引物分别与M13同一条单链的不同DNA片段互补，其中一个引物（引物1）与目的基因的一部分互补，但是含有一个核苷酸的突变；另一个引物（引物2）中含有一个酶切位点，但该酶切位点的一个核苷酸被诱变。

对引物1的5/端进行磷酸化，引物2的新生链的3/端与引物1的磷酸化后5/端相遇，两端DNA在T4DNA连接酶的作用下连接。

这样引物1的磷酸二酯键起到封接作用，保护引物1不会被新生连所替换。

用未被引物2诱变时的限制性内切酶位点所对应的限制性酶解PCR产物，然后用该酶解产物转化修复缺陷型大肠杆菌。

由于不含有引物2诱变的DNA都被切割成线性，不能在大肠杆菌中稳定存在，所以得到的转化子
都是同时含有1.2两个突变位点的。

通常引物2选择在抗性基因中，这样除用限制煤排除非突变体外，还可以抗性变化来进行进一步筛选。

这种方法较为简便易行，且得到突变体的机会较高，因此是现在较常用的一种获得突变体的方法。

PCR介导的定点突变法
利用PCR技术进行定点突变，不仅可以使突变体大量扩增，还可以提高突变率。

以PCR为介导的定点突变为基因修饰和改造提供了另一条途径，例如通过改变引物中某些碱基而改变基因序列，达到有目的的改造蛋白质结构，研究蛋白质的结构与功能之间的关系的目的。

还可以在所设计的引物5/端加入合适的限制型内切酶酶位点，为PCR 扩增产物后续得分克隆提供方便。

寡核苷酸介导的PCR突变的一种常用方法是将目的基因克隆到质粒载体上，质粒分置于两管中，每管各加入两个特顶的PCR引物，一个引物与基因内部或其附近的一段序列完全互补，另一引物和另一段序列互补，但有一个核苷酸发生了突变；两管中不完全配对的引物与两条相反的链结合，两个突变引物是互补的。

由于两个反应中引物的位置不同，所以PCR扩增后，产物有不同的末端。

将两管PCR产物混合，变性，复性，则每条链会与另一管中的互补退火，形成有两个切口的环状DNA
转入大肠杆菌后，这两个切口均可修复。

若同一管中的两条DNA链结合，会形成线性DNA分子，它不能在大肠杆菌中稳定存在。

只有环状DNA才能在大肠杆菌中稳定存在，而绝大多数的环状分子都含有突变基因。

这种方法不用将基因克隆到M13载体上，也不用特殊的载体系统，而且不用将M13上的突变基因在亚克隆到表达载体上，方法简单实用。

PCR介导的定点突变法，需要4种扩增引物，进行3次PCR反应。

前两次PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有碱基突变的内侧引物，扩增形成两条双链DNA 片段，其中一段可以彼此重叠，去除未反应的多余引物之后，这两条双链DNA片段经过变性和退火可以形成具有3/凹末端的异源双链分子，在TaqDNA聚合酶的作用下，产生含有重叠序列的双链DNA分子。

这种DNA分子再用两个外侧寡核苷酸引物进行第三次PCR扩增，便产生突变体DNA.
3.盒式突变
盒式突变1985年Wells提出的一种基因修饰技术——盒式突变，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析。

利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧造成两个原载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶消化基因，再用合成的发生不同变化的双链DNA片段替代被消化的部分。

这
样一次处理就可以得到多种突变型基因。

盒式突变具体是利用一段人工合成的含有基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中相应序列。

这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成的，当他们退火时，按设计要求产生克隆需要的粘性末端，由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体。

如果将简并的突变寡核苷酸插入到质粒载体分子上，在一次的实验中便可以获得数量众多的突变体，大大减少了突变需要的次数。

这种方法适合研究蛋白质分子中不同位点的氨基酸作用。

其方法是合成两套分别与靶DNA的两条链互补的寡核苷酸，其中一套由单一的与野生型靶DNA一条链的序列精确互补的寡核苷酸组成，另一套则由一系列互补于另一条链同一位置带有目标突变的寡核苷酸组成，这样在有利于形成错在片段的两端设计合适的突变末端，直接插入到重组质粒中置换同源的野生型序列，如果在重组质粒中目的序列两端无合适的限制性内切酶位点，可用前述定点突变的方法引入，要求引入酶切位点对载体质粒是单一的，而且对目的基因编码没有影响。

这样含有目的突变的一系列盒式双链片段可以按需要在目的基因上任意置换，引入需要的突变。

三种方法的比较：
1.核苷酸引物介导的定点突变法，优点是保真度比PRC
突变法高，经过改进后使该方法突变成功率大大提高；缺
点是操作过程环节复杂，周期长，而且在克隆突变基因时会受到限制酶酶切位点的限制。

2.PCR介导定点突变其优点是操作比较简单，突变的成功
率高，缺点是：后续工作较复杂，PCR扩增产物通常需要连接到载体分子上，然后才对突变基因进行转录，转译等方面的研究；TaqDNA聚合酶的保真性偏低。

3.盒式突变比前两者简单易行，突变效率高等优点，同时
在一对限制酶酶切位点内一次性突变多个位点；缺点是合成多条引物的成本较高。

而且一般情况下，在靶DNA片段的两侧往往难以满足存在一对限制酶酶切位点的要求。

融合蛋白质的构建：
重组DNA技术允许在体外进行不同基因或基因片段之间的融合，并通过融合基因产生融合蛋白。

最近融合蛋白已经被广泛用于生物研究，它可以被用于蛋白质的表达，检测，和纯化。

在两个不同的蛋白质融合时，一个蛋白质的融合位置可以是它的C端或者是N端，但是不同的融合方案可能导致融合蛋白质的性质不同。

融合蛋白的基因融合可根据需要采取如下方式：
1.最常见和最简单的基因融合方式是将重组基因
直接剪切于适当的信号序列之后，其优点在于如
果在转用中信号肽被正确加工，那么产生的重组
蛋白就可具备天然的N端。

但是应该指出的是并
非任何外源基因加上信号肽序列后都可以分泌
表达。

2.将外源基因本身按可读框架自我融合，这种方式
对一些小肽的稳定高效表达尤为重要。

3.目标蛋白质和其伙伴蛋白直接融合在C端或者N
端。

C端的优点是：启动子和翻译起始信号都处
于基因的5/末端，因此3/末端所进行的不同基
因片段的融合并不改变院启动子和翻译起始信
号的原设计，目标基因的表达水平相对稳定。

N
端融合的缺点是目标基因产物特异性的转录和
翻译其实原件必须在目标基因的5/末端。

4.分泌-亲和融合，此种设计就是将分泌和纯化的
优点结合起来，即N端为信号肽，然后是融合肽，
再连接目标基因。

产物能分泌到培养基中，可以
为以后的纯化，连续发酵和收集表达产物提供方
便。

5.双亲和融合，将目的基因X同两个分别对不同配
基有特异性亲和的异源结构域A,B以A-X-B的形
式进行融合，为以后选择利用亲和层析进行纯化
提供方便。

这一设计适用于表达对蛋白质水解酶
高度敏感的蛋白质，通过两次连续的亲和分析，
对即使表达量不高的蛋白质也可以很好地回收。

6.分泌-插入融合：将目的基因插入到信号肽序列
和插入序列之间，次插入序列是为一种可插入到
细胞膜或者细胞壁的蛋白质编码。

这种设计的目
的是用以将受体或着抗原定位于细菌的外表面
或装配成融合蛋白质进入类病毒颗粒。

系统适用
于开发疫苗或者产生具有免疫原的复合物。

融合蛋白的应用集中表现在抗体领域。