一种治疗肿瘤的小牛脾提取物[发明专利]

(10)申请公布号 CN 102210702 A
(43)申请公布日 2011.10.12C N 102210702 A
*CN102210702A*
(21)申请号 201110134051.X
(22)申请日 2010.08.19
201010257796.0 2010.08.19
A61K 35/28(2006.01)
A61K 9/08(2006.01)
A61P 35/00(2006.01)
A61P 35/02(2006.01)
A61P 7/00(2006.01)
A61K 31/675(2006.01)
(71)申请人吉林敖东洮南药业股份有限公司
地址137100 吉林省白城市洮南市团结东路
16号
(72)发明人杨振军 邹兆鹏 王银叶 王国栋
(74)专利代理机构北京太兆天元知识产权代理
有限责任公司 11108
代理人刘伟
(54)发明名称
一种治疗肿瘤的小牛脾提取物
(57)摘要
本发明公开了一种治疗肿瘤的小牛脾提取
物，其中小牛脾提取物中含5-15重量份多肽、
0.4-1重量份核糖。

该提取物制剂可明显抑制肿
瘤，显著拮抗化疗药环磷酰胺所致小鼠白细胞减
少、逆转环磷酰胺对骨髓细胞的抑制，并且该提取
物能够治疗急性早幼粒细胞白血病。

(62)分案原申请数据(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 13 页
1.一种治疗肿瘤的小牛脾提取物，其特征在于小牛脾提取物中多肽与核糖的重量比为：5-15∶0.4-1。

2.如权利要求1所述的小牛脾提取物，其特征在于小牛脾提取物中多肽与核糖的重量比为：6.2∶0.475。

3.一种治疗肿瘤的药物组合物制剂，其特征在于该制剂由临床日用剂量的小牛脾提取物制剂和临床日用剂量的环磷酰胺制剂组成，其中小牛脾提取物制剂中多肽与核糖的重量比为：5-15∶0.4-1。

4.如权利要求3所述的药物组合物制剂，其特征在于该制剂由临床日用剂量的小牛脾提取物制剂和临床日用剂量的环磷酰胺制剂组成，其中小牛脾提取物制剂中多肽与核糖的重量比为：6.2∶0.475。

5.如权利要求1或2所述的小牛脾提取物的制备方法，其特征在于：取乳牛的脾脏，用0.9％氯化钠溶液清洗，加入1-5倍量的生理盐水进行匀浆1～5次，胶体磨粒度为2～8μm；将匀浆液-10℃～-30℃深冻，达到完全冻结后，取出放入20℃～50℃以下水浴中解冻，完全融化后继续-10℃～-30℃条件下深冻，如此反复进行三次；将冻融后的药液60℃～100℃保温30-40分钟，速降温至10℃～20℃；将上述溶液离心，离心速度为3000-4000转/分，温度0～10℃以下，离心15-30分钟，收集上清液；分别用100000～50000道尔顿、10000～9000道尔顿、8000～5000道尔顿的膜超滤。

6.如权利要求3或4所述的药物组合物制剂，其特征在于该制剂中小牛脾提取物由如下方法制备：取乳牛的脾脏，用0.9％氯化钠溶液清洗，加入1-5倍量的生理盐水进行匀浆1～5次，胶体磨粒度为2～8μm；将匀浆液-10℃～-30℃深冻，达到完全冻结后，取出放入20℃～50℃以下水浴中解冻，完全融化后继续-10℃～-30℃条件下深冻，如此反复进行三次；将冻融后的药液60℃～100℃保温30-40分钟，速降温至10℃～20℃；将上述溶液离心，离心速度为3000-4000转/分，温度0～10℃以下，离心15-30分钟，收集上清液；分别用100000～50000道尔顿、10000～9000道尔顿、8000～5000道尔顿的膜超滤。

7.如权利要求1或2所述的小牛脾提取物在制备治疗急性早幼粒细胞白血病药物中的应用。

8.如权利要求1或2所述的小牛脾提取物在制备拮抗环磷酰胺副作用药物中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于拮抗环磷酰胺所致白细胞减少、骨髓抑制的副作用。

10.一种抗肿瘤用药剂盒，其特征在于由置于包装单位中的许多独立包装且各自可取出的7个日剂量单位组成，其中第一个日剂量单位包含4-12g环磷酰胺注射剂和4-12ml小牛脾提取物注射液，其余六个日剂量单位仅包含小牛脾提取物注射液4-12ml。

一种治疗肿瘤的小牛脾提取物
[0001] 本发明为分案申请，原案申请号为201010257796.0，原案申请日为2010年8月19日，原案名称为一种治疗肿瘤的小牛脾提取物。

技术领域
[0002] 本发明涉及一种提取物，特别涉及一种治疗肿瘤的小牛脾提取物。

技术背景
[0003] 癌症发病率和死亡率逐年上升，严重威胁人类健康，已成为人类死亡的主要原因之一。

西医治疗多以手术、放疗、化疗为主，但是应用化疗或放疗，往往引起恶心，食欲不振，血象变化，机体免疫功能损害等毒副作用，在癌细胞受到抑制或部分杀灭的同时，人体正常组织细胞也相应的受到极大地摧残和伤害，因此导致许多患者无法坚持完成放、化疗疗程，失去有效治疗机会。

[0004] 本发明提供的小牛脾提取物注射液，是由健康乳牛(出生24h以内)脾脏为原料提取而成的无菌水溶液。

其既能抑制肿瘤细胞，同时可以拮抗化疗药的副作用，提高患者体质，使患者能坚持完成放、化疗疗程，延长生存期。

发明内容
[0005] 本发明一个目的在于提供一种治疗肿瘤的小牛脾提取物；本发明的另一个目的在于提供小牛脾提取物在制备治疗急性早幼粒细胞白血病药物中的应用。

[0006] 本发明目的在于提供一种治疗肿瘤的小牛脾提取物注射液，其中2～6体积份小牛脾提取物注射液中含5-15重量份多肽、0.4-1重量份核糖；所述小牛脾提取物注射液是由如下方法制备：领取乳牛的脾脏(出生24小时以内)，除去掉结缔组织和脂肪，用0.9％氯化钠溶液清洗，加入1-5倍量的生理盐水进行匀浆1～5次，胶体磨粒度为2～8μm；将匀浆液-10℃～-30℃深冻，达到完全冻结后，取出放入20℃～50℃以下水浴中解冻，完全融化后继续-10℃～-30℃条件下深冻，如此反复进行三次；将冻融后的药液60℃～100℃保温30-40分钟，速降温至10℃～20℃；将上述溶液离心，离心速度为3000-4000转/分，温度0～10℃以下，离心15-30分钟，收集上清液；分别用100000～50000道尔顿、10000～9000道尔顿、8000～5000道尔顿的膜超滤；0.20μm滤芯无菌过滤分装，即得注射液。

所述重量份与体积份的关系为mg/ml的关系。

[0007] 上述治疗肿瘤的小牛脾提取物注射液，其中2.5体积份小牛脾提取物注射液中优选含6.25重量份多肽、0.475重量份核糖。

[0008] 上述治疗肿瘤的小牛脾提取物注射液，其中2.5体积份小牛脾提取物注射液中优选含10.5重量份多肽、0.95重量份核糖。

[0009] 上述治疗肿瘤的小牛脾提取物注射液，其中2.5体积份小牛脾提取物注射液中优选含9重量份多肽、0.6重量份核糖。

[0010] 本发明目的在于提供一种治疗肿瘤的制剂，该制剂由临床日用剂量的小牛脾提取
物制剂和临床日用剂量的环磷酰胺制剂组成，其中小牛脾提取物制剂中多肽与核糖的重量比为：5-15∶0.4-1。

[0011] 上述治疗肿瘤的制剂，该制剂由临床日用剂量的小牛脾提取物制剂和临床日用剂量的环磷酰胺制剂组成，其中小牛脾提取物制剂中多肽与核糖的重量比为：6.25∶0.475。

[0012] 上述治疗肿瘤的制剂，该制剂由临床日用剂量的小牛脾提取物制剂和临床日用剂量的环磷酰胺制剂组成，其中小牛脾提取物制剂中多肽与核糖的重量比为：9∶0.6。

[0013] 上述治疗肿瘤的制剂，该制剂由临床日用剂量的小牛脾提取物制剂和临床日用剂量的环磷酰胺制剂组成，其中小牛脾提取物制剂中多肽与核糖的重量比为：10.5∶0.95。

[0014] 所述小牛脾提取物制剂优选注射制剂。

[0015] 小牛脾提取物及其注射制剂在制备治疗急性早幼粒细胞白血病药物中的应用。

[0016] 小牛脾提取物及其注射制剂在制备拮抗环磷酰胺副作用中的应用。

[0017] 本发明提取一种抗肿瘤用药剂盒，由置于包装单位中的许多独立包装且各自可取出的7个日剂量单位组成，其中第一个日剂量单位包含4-12g环磷酰胺注射剂和4-12ml小牛脾提取物注射液，其余六个日剂量单位包含小牛脾提取物注射液4-12ml。

[0018] 上述小牛脾提取物可以通过现有技术制备，小牛脾提取物注射制剂优选如下方法制备：
[0019] 领取乳牛的脾脏(出生24小时以内)，除去掉结缔组织和脂肪，用0.9％氯化钠溶液清洗，加入1-5倍量的生理盐水进行匀浆1～5次，胶体磨粒度为2～8μm；将匀浆液-10℃～-30℃深冻，达到完全冻结后，取出放入20℃～50℃以下水浴中解冻，完全融化后继续-10℃～-30℃条件下深冻，如此反复进行三次；将冻融后的药液60℃～100℃保温30-40分钟，速降温至10℃～20℃；将上述溶液离心，离心速度为3000-4000转/分，温度0～10℃以下，离心15-30分钟，收集上清液；分别用100000～50000道尔顿、10000～9000道尔顿、8000～5000道尔顿的膜超滤；0.20μm滤芯无菌过滤分装，即得注射液。

[0020] 小牛脾提取物制剂可显著拮抗化疗药环磷酰胺(CTX)所致小鼠白细胞减少；可逆转环磷酰胺对骨髓细胞的抑制，刺激骨髓细胞的增殖，使骨髓细胞的数量增加；小牛脾提取物均可以显著抑制HL60细胞的增殖，用于治疗急性早幼粒细胞白血病。

[0021] 下述实验用于进一步说明本发明，但是对本发明范围的限制。

[0022] 实验例1拮抗环磷酰胺副作用研究
[0023] 1.小牛脾提取物注射液对化疗药环磷酰胺(CTX)所致小鼠白细胞减少的作用[0024] 1.1摘要
[0025] ICR小鼠腹腔注射小牛脾提取物注射液9天。

第7天开始给予CTX，连续3天以建立白细胞减少症动物模型，末次给CTX后24h眼眶取血，通过血常规分析评价小牛脾提取物注射液对白细胞数量的影响。

结果表明：低剂量(2.5ml/kg)和中剂量(5ml/kg)的小牛脾提取物注射液有升高白细胞的趋势，但与模型相比无显著性差异，高剂量(10ml/kg)小牛脾提取物注射液可以显著升高白细胞数量。

[0026] 1.2实验材料
[0027] (1)实验动物：18-22g的ICR小鼠60只，雌雄各半。

动物生产合格证号：scxk京2006-0008
[0028] (2)实验药物：
[0029] a.小牛脾提取物注射液(实施例1方法制备)：吉林敖东洮南药业股份有限公司提供，产品批号：20090505135，为淡黄色澄明液体。

有效成分含量：2.5mg多肽/ml，190μg 核糖/ml。

临用时用灭菌生理盐水稀释。

[0030] b.环磷酰胺(CTX)：江苏恒瑞医药股份有限公司生产，产品批号09081521，为白色粉末。

临用前用灭菌生理盐水配制，需现用现配。

[0031] c.重组人粒细胞刺激因子注射液(rhG-CSF)：华北制药金坦生物技术股份有限公司生产，产品批号：200909Y22，为无色透明液体。

临用时用用灭菌生理盐水稀释。

[0032] (3)实验仪器：血液分析仪，型号MEK-6318K，日本光电工业株式会社生产。

[0033] 1.3实验方法与步骤
[0034] ICR小鼠(18-22g)60只，雌雄各半，动物生产合格证号：scxk京2006-0008。

购自北京大学医学部动物科学部，随机分成6组：正常对照组、模型组、阳性药rhG-CSF(40μg/ kg)组、小牛脾提取物低(2.5ml/kg，相当于6.25mg多肽/kg，475μg核糖/kg)、中(5.0ml/ kg，相当于12.5mg多肽/kg，950μg核糖/kg)、高剂量组(10.0ml/kg，相当于25mg多肽/ kg，1900μg核糖/kg)。

[0035] 小鼠给连续予小牛脾提取物注射液9天，2次/天。

第7天开始小牛脾提取物注射液减为1次/天，同时给予CTX 80mg/kg，连续3天以制备模型，末次给CTX后24h眼眶取血，测定白细胞数量。

[0036] 1.4实验结果
[0037] 结果显示：模型组动物的白细胞数明显低于正常对照组，表明模型成功。

小牛脾提取物注射液高剂量组的白细胞数量明显高于模型组，说明该剂量下小牛脾提取物注射液可以抑制白细胞数下降，与阳性对照GM-CSF组药效相当。

中剂量有升高白细胞数量的趋势，但模型组相比无显著性差异，低剂量无效(见表1)。

同时分析白细胞分类计数结果后，发现小牛脾提取物高剂量组和GM-CSF组的淋巴细胞数量均较模型组有显著性升高(见表2)。

说明小牛脾提取物注射液高剂量和GM-CSF主要升高白细胞中的淋巴细胞数量。

提示小牛脾提取物注射液可以提高小鼠机体免疫力。

[0038] 表1小牛脾提取物对环磷酰胺诱导的白细胞减少症的影响(n＝10)
[0039]
[0040] 正常组比较：^^P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01
[0041] 表2小牛脾提取物对环磷酰胺诱导的淋巴细胞减少的影响(n＝10)
[0042]
[0043] 与正常组比较：^^P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01
[0044] 2.小鼠血清中GM-CSF含量测定
[0045] 2.1摘要
[0046] ICR小鼠腹腔注射小牛脾提取物注射液9天。

第7天开始给予CTX，连续3天以建立白细胞减少症动物模型，末次给CTX后24h眼眶取血，测定血样中GM-CSF的含量，评价小牛脾提取物注射液对机体生成GM-CSF的影响，以反映骨髓造血系统的功能。

结果表明：模型组中的GM-CSF含量较正常组显著升高，提示化疗药引起骨髓抑制，反馈性刺激机体生成过量的GM-CSF。

小牛脾提取物显著减少GM-CSF含量，使之接近正常组。

表明提取物改善了骨髓细胞功能，减轻了骨髓抑制对GM-CSF的反馈性刺激。

[0047] 2.2实验材料
[0048] (1)测定试剂盒：小鼠GM-CSF Elisa检测试剂盒，美国RB公司产品产品批；[0049] (2)血清样品：末次给予环磷酰胺24h后摘眼球取血，离心(3000r/min，10min)所得血清，-20℃冻存备用。

[0050] 2.3实验仪器
[0051] 550型酶标仪，美国BIO-RAD产品；MCO-15AC二氧化碳培养箱，日本SANYO产品[0052] 2.4实验方法与结果
[0053] ICR小鼠(18-22g)60只，雌雄各半，动物生产合格证号：scxk京2006-0008。

购自北京大学医学部动物科学部，随机分成6组：正常对照组、模型组、阳性药rhG-CSF(40μg/ kg)组、小牛脾提取物低(2.5ml/kg，相当于6.25mg多肽/kg，475μg核糖/kg)、中(5.0ml/ kg，相当于12.5mg多肽/kg，950μg核糖/kg)、高剂量组(10.0ml/kg，相当于25mg多肽/ kg，1900μg核糖/kg)。

[0054] 小鼠连续给予小牛脾提取物注射液9天，2次/天。

第7天开始小牛脾提取物注射液减为1次/天，同时给予CTX 80mg/kg，连续3天以制备模型，末次给CTX后24h眼眶取血，按试剂盒步骤测定血样中GM-CSF的含量。

结果显示：模型组中的GM-CSF含量较正常组显著升高，提示因骨髓抑制反馈性刺激机体生成过量的GM-CSF。

小牛脾提取物显著减少GM-CSF含量，使之接近正常组(见表3)。

表明提取物改善了骨髓细胞功能，减轻了骨髓抑制对GM-CSF的反馈性刺激。

[0055] 表3小牛脾提取物对小鼠血清中GM-CSF含量的影响(n＝10)
[0056]
[0057] 与正常组比较：^^P＜0.01；与模型组比较：**P＜0.01
[0058] 3.小牛脾提取物注射液对骨髓细胞体外增殖的作用
[0059] 3.1摘要
[0060] 无菌条件下取白细胞减少症小鼠的股骨骨髓，用10％ RPMI 1640培养基制备成细胞悬液，用MTT法测定小牛脾提取物注射液在体外对骨髓细胞增殖的影响，以评价小牛脾提取物注射液是否通过刺激骨髓细胞的增殖来升高白细胞数量。

结果表明：小牛脾提取物注射液各个浓度组的OD值与生理盐水组相比均显著升高。

表明小牛脾提取物注射液在体外可逆转环磷酰胺对骨髓细胞的抑制，刺激骨髓细胞的增殖，使骨髓细胞的数量增加。

[0061] 3.2实验材料
[0062] (1)实验动物：18-22g的ICR小鼠4只，雄性。

生产合格证号：scxk京2006-0008 [0063] (2)实验药物：
[0064] a.小牛脾提取物注射液(实施例1方法制备)：吉林敖东洮南药业股份有限公司提供，产品批号：20090505 135，为淡黄色澄明液体。

临用时用灭菌生理盐水稀释；[0065] b.环磷酰胺(CTX)：江苏恒瑞医药股份有限公司生产，产品批号09081521，为白色粉末。

临用前用灭菌生理盐水配制，需现用现配；
[0066] c.重组人粒细胞刺激因子注射液(rhG-CSF)：华北制药金坦生物技术股份有限公司生产，产品批号：200909Y22，为无色透明液体。

临用时用用灭菌生理盐水稀释。

[0067] (3)实验仪器：550型酶标仪，美国BIO-RAD产品；3K15台式离板机，Sigma产品；Anke TDL-40B离心机，上海安亭科学仪器厂产品。

[0068] (4)实验试剂：RPMI 1640培养基为美国GIBCOBRL公司产品，噻唑兰(MTT)为美国GIBCOBRL公司产品，PAA实验室胎牛血清，二甲基亚砜为天津化工厂产品。

[0069] 3.3实验方法
[0070] 连续3天给予小鼠腹腔注射环磷酰胺80mg/kg以制备骨髓抑制模型，末次给药24h 后无菌取小鼠双侧股骨，用6号针头插入股骨，连接已吸入5ml不完全RPMI-1640培养基的注射器用于冲取骨髓细胞，将细胞冲入烧杯中，连续冲洗三次，总量为8ml，将冲出的骨髓细胞于4号半针头过滤以制成单细胞悬液，然后离心(1000r/min×10min)，弃上清，用含10％FBS的RPMI-1640培养基制备成5×105/ml的细胞悬液。

于96孔板中每孔加入细胞悬液100μl，设为五组，每组6个复孔，分组情况为：
[0071] a.生理盐水组：每孔加入无菌生理盐水100μl；
[0072] b.rhG-CSF组：每孔加入浓度为2μg/ml的G-CSF溶液100μl，rhG-CSF终浓度为
1μg/ml；
[0073] c.小牛脾提取物注射液高剂量组：每孔加入注射液100μl，终浓度为500μl/ ml；
[0074] d.小牛脾提取物注射液中剂量组：每孔加入用无菌生理盐水稀释4倍的注射液100μl，终浓度为125μl/ml；
[0075] e.小牛脾提取物注射液低剂量组：每孔加入用无菌生理盐水稀释16倍的注射液100μl，终浓度为31.2μl/ml。

[0076] 然后置96孔板于5％CO2，37℃饱和湿度培养箱中培养，24h后每孔加入0.5％(5mg/ml)噻唑蓝(MTT)20μl，继续反应4h，1000r/min离心15min，弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)200μl，充分混匀后静置数分钟，置酶标仪于570nm处测定吸光度(OD)值，以代表骨髓细胞的数量。

[0077] 3.4实验结果
[0078] 小牛脾提取物注射液各个浓度组的OD值与生理盐水组相比均显著升高(见表4)，表明小牛脾提取物注射液在体外可逆转环磷酰胺对骨髓细胞的抑制，刺激骨髓细胞的增殖，使骨髓细胞的数量增加。

[0079] 表4小牛脾提取物对骨髓细胞体外增殖的影响(n＝4)
[0080]
[0081] 与生理盐水组相比：*P＜0.05；**P＜0.01
[0082] 实验例2小牛脾提取物注射液治疗急性早幼粒细胞白血病的研究
[0083] 1.小牛脾提取物注射液对HL60细胞生长的影响
[0084] 1.1摘要
[0085] 将HL60细胞在含有不同浓度的小牛脾提取物的培养液中培养不同的时间，用MTT 法测定其在570nm处的吸光度以评价细胞的增殖程度。

结果表明：与生理盐水组相比，各个浓度的小牛脾提取物均可以显著抑制HL60细胞的增殖，并随时间延长作用增强。

[0086] 1.2实验材料
[0087] (1)细胞系：HL60细胞，为急性早幼粒细胞白血病细胞系
[0088] (2)实验药物：小牛脾提取物注射液(实施例1方法制备)：吉林敖东洮南药业股份有限公司提供，产品批号：20100101133，为淡黄色澄明液体，临用前用灭菌生理盐水稀释。

[0089] (3)实验仪器：550型酶标仪，美国BIO-RAD产品；3K15台式离板机，Sigma产品；Anke TDL-40B离心机，上海安亭科学仪器厂；MCO-15AC二氧化塘培养箱，日本SANYO产品；DL-CJ-1N高性能无菌实验台哈尔滨东联电子技术开发有限公司北京分公司产品；HH-W420
数显三用恒温水浴箱，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司
[0090] (4)实验试剂：RPMI 1640培养基：美国GIBCO产品；噻唑兰(MTT)：美国GIBCO产品；胎牛血清：PAA产品；DMSO：天津化工厂产品。

[0091] 1.3实验方法
[0092] (1)配制RPMI 1640高糖培养基：精确称取250mg葡萄糖，用10ml的10％FBS RPMI1640培养基溶解，然后用0.22μm滤膜过滤于一个100ml的玻璃瓶中，再补加90ml的10％FBS 1640培养基即可配制成葡萄糖浓度达4.5g/l的高糖培养基，仅用于实验，以刺激HL60细胞的糖酵解。

平时培养仍使用含糖量正常的10％FBS RPMI 1640培养基(下同)；[0093] (2)收集处于对数生长期，状态良好的HL60细胞，离心(4℃，1000rpm×8min)，然后用高糖培养基重悬，计数，然后稀释至2×105/ml；
[0094] (3)加入100μl细胞悬液至96孔板，分为生理盐水组、小牛脾提取物注射液高、中、低浓度组。

每组4个复孔，然后分别加入生理盐水和不同浓度的小牛脾提取物各100μl 至对应的孔中，使小牛脾提取物的终浓度分别达到：0，31.2，125和500μl/ml。

振摇孔板数
次以使细胞混匀，然后放入CO
2培养箱(5％CO
2
，37℃)中培养，分别在开始培养后2h，4h，
8h三个时间点各取出一块96孔板，每孔加入0.5％(5mg/ml)MTT 20μl，继续培养4h，使用离板机离心(1000rpm×15min)，弃上清，每孔加入DMSO 200μl，充分混匀后静置数分钟，置酶标仪于570nm处测定吸光度，以反映HL60细胞的生长情况。

[0095] 1.4实验结果
[0096] 统计结果表明：与各时间点生理盐水对照组相比，各个浓度的小牛脾提取物均可以显著抑制HL60细胞的增殖，并随时间延长作用增强(见表5)。

[0097] 表5小牛脾提取物对HL60细胞体外增殖的影响(n＝4)
[0098]
[0099] 与生理盐水组相比：*P＜0.05，**P＜0.01
[0100] 2.小牛脾提取物注射液对HL60细胞乳酸生成的作用研究
[0101] 2.1摘要
[0102] 将HL60细胞与不同浓度的小牛脾提取物共培养8h，然后离心取上清，脱蛋白后测定上清中乳酸的含量。

结果表明：与生理盐水组相比，31.2，125和500μl/ml三个浓度的小牛脾提取物注射液均可以显著的抑制HL60细胞产生乳酸，尤其是较高的两个浓度。

[0103] 2.2实验材料
[0104] (1)细胞系：HL60细胞
[0105] (2)实验药物：小牛脾提取物注射液(实施例1方法制备)：吉林敖东洮南药业股份有限公司提供，产品批号：20100101 133，为淡黄色澄明液体，临用前用灭菌生理盐水稀
释。

[0106] 2.3实验仪器
[0107] UV-1100型紫外可见分光光度计，北京普瑞分析仪器公司产品；Anke TGL-16G-A 高速离心机，上海安亭科学仪器厂；MCO-15AC二氧化塘培养箱，日本SANYO产品；DL-CJ-1N 高性能无菌实验台，哈尔滨东联电子技术开发有限公司北京分公司产品；HH-W420数显三用恒温水浴箱，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。

[0108] 2.4实验试剂
[0109] 乳酸检测试剂盒：南京建成生物工程研究所产品，批号：20100324；70.0％高氯酸：分析纯，天津市鑫源化工有限公司产品；氯化钠：分析纯，北京北化精细化学品有限责任公司；RPMI 1640培养基：美国GIBCO产品；胎牛血清：PAA产品；G250考马斯亮蓝：北京鼎国生物技术有限公司产品
[0110] 2.5实验方法
[0111] (1)收集处于对数生长期、状态良好的HL60细胞，离心(4℃、1000rpm、8min)，然后用高糖培养基重悬，计数，约为15×105/ml；
[0112] (2)加入6孔板，330μl细胞悬液/孔，再加670μl的高糖培养基/孔(序贯法加液)，分为：生理盐水和不同浓度给药组。

每组3个复孔，然后分别加入生理盐水和不同浓度的小牛脾提取物各1000μl至对应的孔中，使小牛脾提取物的终浓度分别达到：0，31.2，
培养箱中，培养8h。

将细胞125和500μl/ml。

振摇孔板数次，以使细胞混匀，然后放入CO
2
收集于2ml EP管中，离心(4℃，1000rpm×8min)，吸取上清置于另一2ml EP管中，用于测定上清中的乳酸含量；细胞用于测定总蛋白含量(所有EP管均需标明1，2，3等序号，以保证乳酸测定数据和蛋白测定数据可以准确对应)；
[0113] (4)上清液预处理：分别转移3份体积的上清液或乳酸标准品溶液于1份体积的20％冰高氯酸中，然后冰上孵育至少30min，离心(4℃，13000rpm，6min)，转移上清于另一个EP管中，-20℃冻存备用。

剩余操作严格按照试剂盒要求进行；
[0114] (5)细胞总蛋白提取及含量测定：每管加入细胞裂解液200μl，用涡旋混合器震荡30s以使细胞充分裂解，离心(4℃，10000rpm×5min)，吸取上清，-20℃冻存备用。

然后采用BCA法测定样品中蛋白含量；
[0115] (6)乳酸浓度校正：用细胞总蛋白校正，单位换算为μmol/mg蛋白。

[0116] 2.6实验结果
[0117] 统计结果标明：小牛脾提取物与HL60细胞共培养8h后，各个浓度的小牛脾提取物组乳酸含量均明显下降，表明它抑制了HL60细胞的糖酵解过程，因而乳酸生成减少(见表6)。

[0118] 表6小牛脾提取物对HL60细胞乳酸含量的影响(n＝3)
[0119]
[0120] 与生理盐水组相比：*P＜0.05，**P＜0.01
[0121] 3.小牛脾提取物注射液对HL60细胞ATP含量的作用研究
[0122] 3.1摘要
[0123] 将HL60细胞在含不同浓度的小牛脾提取物的高糖培养液中培养8h，离心去除上清，裂解细胞，利用生物发光法检测胞内ATP水平。

结果表明：与生理盐水组相比，31.2，125和500μl/ml三个浓度的小牛脾提取物均可显著降低HL60细胞的ATP水平，提示小牛脾提取物可能抑制HL60细胞的糖酵解。

[0124] 3.2实验材料
[0125] (1)细胞系：HL60细胞
[0126] (2)实验药物：小牛脾提取物注射液(实施例1方法制备)：吉林敖东洮南药业股份有限公司提供，产品批号：20100101 133，为淡黄色澄明液体，临用前用灭菌生理盐水稀释。

[0127] (3)实验仪器：20/20n Luminometer，Turner BioSystems产品；550型酶标仪，美国BIO-RAD产品；Anke TDL-40B离心机，上海安亭科学仪器厂；MCO-15AC二氧化塘培养箱，日本SANYO产品；DL-CJ-1N高性能无菌实验台哈尔滨东联电子技术开发有限公司北京分公司产品；HH-W420数显三用恒温水浴箱，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司
[0128] (4)实验试剂：ATP生物发光检测试剂盒，威格拉斯生物技术(北京)有限公司产品；氯化钠：分析纯，北京北化精细化学品有限责任公司；RPMI 1640培养基：美国GIBCO产品；胎牛血清：PAA产品；G250考马斯亮蓝：北京鼎国生物技术有限公司产品。

[0129] 3.3实验方法
[0130] (1)收集处于对数生长期、状态良好的HL60细胞，离心(4℃、1000rpm、8min)，然后用高糖培养基重悬，计数，约为15×105/ml。

[0131] (2)加入6孔板，330μl细胞悬液/孔，再加670μl的高糖培养基/孔(序贯法加液)，分为：生理盐水和不同浓度给药组。

每组3个复孔，然后分别加入生理盐水和不同浓度的小牛脾提取物各1000μl至对应的孔中，使小牛脾提取物的终浓度分别达到：0，31.2，125和500μl/ml。

振摇孔板数次，以使细胞混匀，然后放入CO
培养箱中，培养8h；
2
[0132] (3)测定样品ATP浓度：将细胞收集于2ml EP管中，离心(4℃，1000rpm，8min)，弃上清，每管加入1ml冰PBS清洗细胞，离心，弃上清，每管加入150μl裂解液(EP管应始终置于冰上，因为细胞裂解后释放的ATP酶可以降解ATP)，涡旋震荡30s以使其充分裂解，然后上机检测(由于发光液不稳定，尽量在配置好2h内用完；同时，应保持每个样品的操作时间一致)。

其余操作严格按试剂盒要求进行；
[0133] (4)测定样品总蛋白：测定ATP浓度的剩余样品用于测定细胞总蛋白含量，采用。