7.仪器分析-色谱解析

氢气
氦气
2、进样系统
包括进样装置和汽化室。
进样通常用微量注射器和进样阀将样品 引入。液体样品引入后需要瞬间汽化。汽化在 汽化室进行。
气相色谱对载气的基本要求： （1）纯净
通过活性炭或分子筛净化器，除去载气中的 水分、氧等有害杂质。 （2）稳定
采用稳压阀或双气路方式：
载气
标准谱图调谐报告
质量数的峰宽 平滑对称的峰 低水峰及空气峰
正确的质量分配
适当的丰度值
合适的电子倍增器电压 合适的同位素比例
合适的相对丰度
（3）常用的载气：
氮气
(5)相对保留值
r 代表峰分开的程度，其不等于1是色谱分离的前提。 r=1 不能分开
（5）分配系数和分配比（容量因子） 分配系数K：一定温度与压力下两相达平衡后，组分 在固定相和流动相浓度的比值
分配比（容量因子）： 一定温度与压力下两相 达平衡后， 组分在固定相和流动相量的比值
固定相重量 流动相重量
。
组分的分量 =
。
。
第1级塔板：r = 1
。
。
组分的分量 =
。
。
组分在两级塔板上的量可表示为：
。
rn
由上表可以看出，经N次转移后，组分在各级 塔板上的量符合二相式分布，即
当N = 4时，组分分布在5级塔板上：
以A组分为例，5级塔板上的分量分别是：
任一级塔板上的分量为 ( p'q')N 的展开式对应的
柱温操作
恒温
在整个分析过程中，色谱炉温保持恒定。 用初始时间设定运行结束时间。 升温速率设为“0”。 后流出的峰展宽。
程序升温
当组分有较宽的沸点范围 (>100°C)时使用。 减少分析时间并使峰变窄。 增加柱流失，引起基线漂移。 可设多阶程序升温。 HP6890 可设“快速变化速率”至 120°C/min。
按分离效率分
经典液相色谱 高效液相色谱
微柱色谱 最新进展
毛细管电动色谱
三、基本概念与术语(掌握)
1、色谱流出曲线 （chromatogram）(色谱图) 指样品注入色谱柱后，信号随时间变化的曲线。
色谱流出曲线示意图
0.607h
2
W1/2
1/2h
Wb
色谱流出曲线
根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的 最少个数；
为了增大k值，可采用的方法： （1）GC: 增加固定液的用量，适当降低柱温 （2）LC: 适当采用极性较小一些的流动相 3、增大选择性因子r值: 由于r的微小变化，都对R有很大的影响，增大r值是改
善分离度的最有力的手段 为了增大r值，可采用的方法： （1）GC: 适当降低柱温 （2）LC: 通过控制固定相和流动相的性质来调整
1、选择性（相对保留值r）(重复ppt13)
相对保留值由两组分的热力学性质 决定，与色谱柱的长短粗细无关。
2、峰宽度
3、分离度(分辨率, 色谱峰分离度)
分离度考虑了保留时间和峰宽度，是一个综合指标：
R < 1.0
两峰有部分重叠
R = 1.0
两峰达98%分离，两峰基本分离
R 1.5
两峰达99.7%分离，完全分离的标准）
第七章 色谱分析法
Chromatography
第一节 概述 Introduction
色谱法是一种物理化学分离方法,利用不同物质在 两相（固定相和流动相）中具有 不同的分配系数 （或吸收系 数，渗透性等）,当两相做 相对运动时， 这种物质在两相中反复多次分配,从而使各物质得 到完全的分离。之后，通过检测器得以检测，进 行定性定量分析。
可知：
所以：
或： 根据： 所以：
n 称为色谱柱的理论塔板数。 因为tR是热力学常数，当色谱柱的长度一定，
理论板数目n越大，色谱峰越窄。
neff 与 n 的关系：
小结
1、从理论上得到了描述色谱流出曲线的方程， 通过该方程可以预测具有不同分配系数K的两 种物质在塔板数为n的色谱柱上分离的情况；
2、通过这一方程看出影响柱效率的因素是理论 板数n，其值越大，色谱峰越窄，分离效果越好；
存在的问题： r的变化不像n和k有规律可循
R 1 r2,1 1 k n 4 r2,1 1 k
2.载气及流速的选择
u 在上述方程各项中存在矛盾，因此，应求出最佳值：
Hmin
uopt
u
由图可见存在最佳流速（uopt）。实际流速通常稍大于最 佳流速，以缩短分析时间。
柱效与载气线速度
H
H=A+
B
+C m
3.柱温的选择
3.柱温的选择 (p226-227)
选择柱温要兼顾几方面的因素。一般原则 是：在使最难分离的组分有尽可能好的分 离前提下，采取适当低的柱温，但以保留 时间适宜，峰形不拖尾为度。具体操作条 件的选择应根据实际情况而定。
另外，柱温的选择还应考虑固定液的使用 温度，柱温不能高于固定液的最高使用温 度，否则固定液挥发流失，对分离不利。
分配系数 K（热力学性质）
K只与固定相和被分离物质的性质有关 K值的差别是分离的先决条件， 差别越大，
分离的可能性越大 K值大的组分后出峰
K与k的关系： （6）分配比(容量因子)k与保留值的关系
色谱基本保留方程
证明：
当组分一半流出色谱柱时
V0Cm VSCS
VRCm
色谱基本保留方程
四、分离效能指标
《中国药典》规定R应大于1.5，用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志
小结
色谱法研究的核心： 选择最适合的色谱体系和条件、在最
短的时间达到最佳的分离效果。
第二节 色谱理论
一、塔板理论
目的——从理论上得到描述色谱流出曲线 的方程，并通过这一方程各参数来研究影 响分离的因素。
塔板理论的四个假设
第三节 气相色谱仪
一、气相色谱仪
进 样
汽化室 净化器
放 空
检测器
载
气
记录器
流量计
色谱柱
柱箱
气相色谱仪流程图
典型的气相色谱
分子筛 脱水管
固定 限流器
稳压器
流量 控制器
进样口
检测器
色谱柱
电子部件 PC
载气 氢气 空气
管路和净化器
须使用GC 专用铜管或不锈钢管。
塑料管会渗透O2和其它污染物。还可能会释放其它 可被检测到的干扰物。
2、Van Deemter方程 1956年Van Deemter提出速率方程，指出了提高柱效率 的途径：
Van Deemter方程
式中 u——流动相流动的线速度
（1）A——涡流扩散项： 指固定相填充不均匀引起的扩散
——为填充的不 规则因子
dp——固定相颗 粒粒径
涡流扩散示意图
结论：细而均匀的颗粒，填充的越均匀， A↓，H↓，柱效n↑
根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析； 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析； 根据色谱峰的保留值及其区域宽度，可以评价色
谱柱分离效能； 根据色谱峰两峰间的距离，可以评价固定相（或
流动相）选择是否合适。
2、常用术语
（1）基线
无组分通过色谱柱时，检测器的噪音随时间变化 的曲线。
(2)峰高
Hale Waihona Puke (3)峰宽峰底宽 Wb 峰半宽W1/2
标准偏差
色谱参数示意图
2
0.607h
W1/2
1/2h
t0
Wb
tR
（4）保留值 保留时间tR——进样到出现色谱峰的时间 保留体积VR——进样到出现色谱峰时消耗 的流动相体积
死时间t0——流动相流过色谱柱的时间 死体积V0——色谱柱的空隙体积
F——流动相流动线速度
r0
r —— 塔板数
r1
N—— 转移次数
r2
。
设：有A、B两组分，kA = 2
。
kB = 1/2
当N=0 r=0
。
。
A组分在两相分配达平衡后：
。
。
流动相分量=
。
。
固定相分量=
rn
下表列出经过各级转移后组分在每一级塔板中的量：
若抽象成一个规律：
r0
当经过1次转移（N=1）以后：
r1
r2
第0级塔板：r = 0
▪使用程序升温改善后流出组分峰形。
@ 好的进样技术可以保障高柱效。进样应该紧凑快速，
以免峰展宽。
三、分离条件的选择
1.色谱分离的基本方程
综合塔板理论和速率理论，可获得影响色谱分离效率 的因素：
R 1 r2,1 1 k n 4 r2,1 1 k
提高分离度的途径
1、n 2、增大容量因子k：R 随 k 增大而增大，但是分析时间也随之延长
控制在固定液的最高使用温度（超过该温度固定液易流失）和最低使
用温度范围之内。
3.柱温的选择 (p226-227)
对于宽沸程的多组分混合物，可采用程序 升温法，即在分析过程中按一定速度提高 柱温，在程序开始时，柱温较低，低沸点 的组分得到分离，中等沸点的组分移动很 慢，高沸点的组分还停留于柱口附近；随 着温度上升，组分由低沸点到高沸点依次 分离出来。
1、在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅 速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。
2、流动相（如载气）进入色谱柱不是连续进行的， 而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（ΔVm）。
3、所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试 样沿轴（纵）向扩散可忽略。
4、分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一 塔板上的量无关。
列新的色谱分析方法。
分离对象 --植物色素 色谱柱 --- 玻璃管 固定相 --- 碳酸钙 流动相 --- 石油醚
s
t
二、分类
按流动相分
气相色谱（GC） 液相色谱（LC） 超临界流体色谱（SFC）
按机理分
吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 排阻色谱
二、分类
按固定相在 支持体中的 形状分
柱色谱
纸色谱 平板色谱 薄层色谱
高效液相色谱 HPLC和超高效液相色谱 UPLC
3、影响谱带展宽的其它因素 柱前展宽、柱后展宽、柱外效应
进样器死体积大、进样量大，进样速度慢 柱前后连接管道死体积大 检测器死体积大
如何提高柱效
▪使用内径更小的柱子。GC/MS要用o.25mm以下的柱子。 ▪减小固定相百分组成或固定相液膜厚度。 ▪减小进样量。 ▪选用更长的柱子。
一项，可用一个通式表示：
当求 最后一级塔板的组分的量时，r = n，以 作图，即得色谱流出曲线，因此上式称为流出曲 线方程。
C
Cmax
tR
t
对于两个组分A和B，如果k不同，则流出曲线 的形状不同：
由于所获得的流出曲线在N很大时呈正态分布， 因此可将流出曲线方程转化为正态分布方程形式：
将此方程与标准正态分布曲线方程比较：
管子使用前先用溶剂冲洗，载气吹干。
根据工厂的推荐，每用完3瓶气，应更换过滤器，以 防止发生气体的污染。
每隔一定时间，应对所有外加接头进检漏（大约每 隔 4-6个月。
5975 MSD 和 6890 GC
气相色谱仪主要包括四部分： 1、载气系统 2、进样系统 3、分离系统 4、检测系统
1、载气系统
载气由压缩气体钢瓶供给，经减压阀、稳压 阀控制压强和流速，由压强计指示气体压强，然后 进入检测器热导池的参考臂，继而进入色谱柱。最 后通过热导池、流量计而放入大气。
一、历史
1906 Tswett 研究植物色素分离，提出色谱法的概 念；
1941 Martin和Synge提出液-液色谱理论； 1952 James和Martin发展了气相色谱； 1956 Van Deemter提出速率理论； 1967 Kirkland等研制高效液相色谱法； 80年代以后 出现毛细管电泳和毛细管电动色谱等一系
3、既然色谱分离的依据是组分在两相中的分配 能力差异，因此，两相不限于液-固相，对气体成 分而言，亦可是气-固项或气-液相。
问题
怎样提高色谱柱的理论塔板数n， 从而提高色谱柱的效率？
二、速率理论
1、塔板理论的不足 塔板理论虽然指出了理论板数n或理论板高度
H对色谱柱效率的影响，但是没有指出影响塔板高度 的因素，因此无法在理论指导下从实验上提高色谱柱 的效率。
表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减 轻，色谱峰较窄。
（2）B/u ——纵向分子扩散项 指分子沿色谱柱轴向扩散引起的色谱谱带展宽
B = 2 r Dm
式中： r——弯曲因子，填充柱 r < 1 空心柱r = 1
Dm——组分在流动相中的扩散系数
由于组分在液相中的扩散系数只有气体中的1/105，因 此在液相色谱中B可以忽略。
（3）Cu——传质阻力项 指组分在流动相和固定相之间传质的阻力
固定相传质阻力 流动相传质阻力 q 和 为与两相的构型和性质有关的常数 dp 和 df 为固定相颗粒直径和固定液膜的厚度
综上所述，速率方程为：
问题： 1、怎样装柱才能使色谱柱的效率提高？ 2、空心柱是否能够用于色谱分离？ 3、如何获得色谱最佳流速？
m
柱效受载气线速度和流 量影响。
分子扩散项B {
} C 传质阻力项
} A 涡流项
m ( opt m)
曲线的最低点代表最小 板高 HETP (或最大每米 理论塔板数) 也就是最好 的柱效。 毛细管柱中不
存在“A”项。
H与线速度形成的曲线叫做Van Deemter曲线。 曲线最低点的线速度值即为可获得最好柱效的最佳线速度值。