分子印迹固相萃取-紫外分光光度法测定阿司匹林的研究

分子印迹固相萃取-紫外分光光度法测定阿司匹林的研究胡小刚;汤又文
【摘要】合成了阿司匹林分子印迹聚合物作为固相萃取填料, 并对分子印迹固相萃取中样品溶剂、洗脱溶剂、洗脱次数及真空进样压力进行了优化选择.以丙酮为载样及清洗溶剂, 乙醇为洗脱溶剂, 进样压力为1200 Pa, 对阿司匹林药片中的阿司匹林分子进行固相萃取, 洗脱液采用紫外光度进行测定, 测得含量为7.12%.测定精密度RSD为4.0%, 回收率为107.3%.
【期刊名称】《华南师范大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2006(000)004
【总页数】5页(P88-92)
【关键词】分子印迹;固相萃取;阿司匹林;紫外光度法
【作者】胡小刚;汤又文
【作者单位】华南师范大学化学与环境学院,广东广州,510631;华南师范大学化学与环境学院,广东广州,510631
【正文语种】中文
【中图分类】O656
对复杂基体中药物进行分析时, 样品预处理通常是最耗时和不易自动化的步骤, 也是目前公认的最为关键的步骤. 近几年来, 固相萃取(Solid-Phase Extraction, SPE)技术由于具有低成本、易自动化、节省溶剂、形式多样等优点而成为样品预处理的
有力手段, 被广泛用于药物分析[1]、生物分析[2]、食品分析[3]和环境分析[4]等各方面. 目前, SPE的填充剂主要有氧化铝[5]、硅藻土[6]、活性炭[7]、C18[8]、离子交换树脂[9]等, 这些填充剂的选择性不够高, 在富集待测物的同时大量基体和干扰
物质也被富集, 干扰最后的分析. 近来出现一种利用抗体自身选择性的免疫吸附剂[10], 选择性高, 但制备复杂、耗时且可供选择的抗体种类少, 机械强度和稳定性较差.
分子印迹技术的发展, 可望解决以上问题. 分子印迹聚合物(Molecular Imprinted Polymers, MIP)是以某种化合物分子为模板合成的聚合物. 在适当的介质中, 将模
板分子与一定量的功能单体混合, 两者间发生分子间相互作用, 功能单体在模板分
子周围作一定的取向和排列, 形成分子集合体; 然后加入交联剂及引发剂引发聚合, 形成高度交联的聚合物; 最后, 除去模板分子, 聚合物中就形成了与原模板分子空间结构互补并具有多重作用位点的“空穴”. 所以MIP对模板分子具有较高的特异性识别能力, 类似于酶-底物的“钥匙-锁”相互作用原理, 能够高选择性识别复杂样品中的印迹分子, 制备简单, 能够反复使用, 机械强度高, 稳定性好. 因此它非常适合用作SPE的填充剂来分离富集复杂样品中的分析物, 以达到分离净化和富集的目的,
能够降低检测限, 提高分析的精度和准确性. 自1994年Sellergren首次报道在SPE中使用MIP材料以来[11], 分子印迹固相萃取技术(Molecularly Imprinted Solid-Phase Extraction, MI-SPE)引起了广泛的关注, 为复杂基体如生物、环境、医药中各种药物和中间体分离与富集提供了强有力的手段.
阿司匹林是一种全世界普遍使用的消炎、解热、止痛和抗菌消炎药, 主要用于治疗腹泻、风湿病、皮肤病等, 目前还广泛用于防止手术后血栓形成、冠心病、高血压、高血脂、糖尿病等疾病的治疗中. 但近代医学研究表明, 阿司匹林有较强的副作用, 如抑制血小板功能, 引起出血倾向, 有较强的胃肠道反应等, 最近加拿大一项临床研究更是表明, 长期小剂量服用阿司匹林, 可能增加三至四成的人患心脏病及中风的
危险. 目前文献报道的阿司匹林测定方法主要是高效液相色谱法[12]及紫外光度法[13], 但两种方法都易受其它物质的干扰, 导致灵敏度不够高. 对阿司匹林的进一步研究须有一种快速、准确、简便测定样品中阿司匹林的有效方法. 本文以阿司匹林为模板分子, 采用封管聚合法合成MIP作为固相萃取材料, 对MI-SPE条件进行了优化选择, 最后通过紫外光度法测定洗脱液中阿司匹林含量. 方法简单快速, 灵敏度高, 结果令人满意.
1 仪器与试剂
十二管防交叉污染固相萃取装置(美国Supercol公司), GM-0.33型隔膜真空泵(美国Supercol公司), 756MC紫外可见分光光度计, HZ24恒温回转振荡器(旅顺电子仪器厂), 电热恒温水浴锅(上海悦丰仪器仪表有限公司).
阿司匹林(美国sigma-aldrich公司), 阿司匹林肠溶片(辽源市迪康药业有限责任公司), 丙烯酰胺(汕头市光华化工厂), 乙二醇二甲基丙烯酸酯(上海珊瑚化工厂), 偶氮二异丁腈(上海试四赫维化工有限公司), 水为去离子水, 其它试剂均为分析纯.
2 实验部分
2.1 MIP的制备
称取0.1820 g阿司匹林标准品和0.2843 g丙烯酰胺于磨口锥形瓶中, 加入16 mL 氯仿溶液, 置于恒温振荡器中25℃振荡12 h. 上述溶液加入3.78 mL乙二醇二甲基丙烯酸酯及40 mg偶氮二异丁腈, 摇匀后转入20 mL玻璃安培瓶中, 通氮气除氧, 真空封管. 将封好的玻璃安培瓶在60℃恒温水浴中聚合48 h, 得到白色块状聚合物. 取出聚合物, 置于真空干燥器中抽干溶剂, 粉碎后过200目筛(75μm), 用丙酮沉降法除去过细颗粒. 用索氏提取器以甲醇为溶剂洗脱聚合物中阿司匹林模板分子, 直至回流提取液中检测不出阿司匹林分子.聚合物取出后置于真空干燥器中干燥, 然后转入密闭容器中待用.
2.2 MI-SPE柱的准备
称取500 mg制备好的阿司匹林MIP, 紧密填入自制注射器式固相萃取柱中, 两端以玻璃棉封口, 先以10 mL氯仿洗柱, 重复3次, 用真空泵抽干. 使用前用5 mL氯仿浸润.
2.3 吸附量测定方法
配置一定浓度的阿司匹林丙酮标准溶液, 测定其在紫外光区的吸收曲线, 可知阿司匹林在紫外区278 nm处有强烈吸收, 选择此波长作为阿司匹林测定波长.
测定不同浓度的阿司匹林标准溶液的吸光度, 绘制工作曲线. 回归方程Y=187X-1.12, 相关系数R=0.9999.取900 mg/L的阿司匹林标准溶液5.0 mL进样, 收集洗脱液, 定容到一定体积, 在278 nm波长下测扣除试剂空白的吸光度值, 根据标准曲线方程算出吸附量Q(μmol).
2.4 样品的准备
用研钵将阿司匹林肠溶片磨成粉状. 称取324.0 mg药片粉末, 用丙酮超声溶解30 min, 过滤多次, 合并滤液, 配制成100 mL的丙酮溶液.
3 结果与讨论
3.1 MI-SPE条件优化
与其它SPE装置一样, MI-SPE整个萃取过程也由柱活化、上样、去除杂质和洗脱4个步骤组成, 如图1所示. 在此过程中, 除真空泵的压力外, 最主要的条件是各种溶剂的选择. 目前大多数用来制备MIP的模板分子主要以氢键与功能单体相结合, 因此, 所选择的样品溶剂应保证底物能与MIP中的识别位点形成氢键; 相反, 洗脱溶剂应能破坏底物与识别位点所形成的氢键; 而清洗溶剂则必须在保证不影响底物与识别位点所形成的氢键的前提下, 能够破坏干扰物质与MIP之间形成的各种分子间作用力, 从而将干扰物质、基质清洗干净, 而底物依然吸附在MIP当中, 常直接使用样品溶剂作为清洗溶剂.
图1 分子印迹固相萃取(MI-SPE)的4个步骤
3.1.1 真空进样压力的选择本文考察了不同真空进样压力对吸附量的影响, 氯仿为样品及清洗溶剂, 乙醇为洗脱溶剂, 结果如图2所示, 当真空压力为1 200 Pa时, 吸附量最大. MIP结合模板分子是一个热力学平衡过程, 进样压力越小, 样品流速越慢, MIP与模板分子的能够有更长的时间发生分子间相互作用, 萃取效率理论上应更好, 但由于固相萃取柱在装填时存在的不均一性, 某些部分的间隙要大于其它部分, 故在真空压力较小时大部分样品都是通过间隙大的地方流过萃取柱, 而间隙小的地方流过的样品少, 导致吸附量较小. 进样压力大时, 样品能够完全通过萃取柱中所有的间隙, 吸附量增加; 但真空压力再提高时, 流速过快, 阿司匹林与印迹聚合物接触时间太短, 没有足够的时间结合, 吸附量反而下降. 故选择1200 Pa为最佳的真空进样压力.
图2 真空进样压力对MI-SPE吸附量的影响
图3 洗脱溶剂及洗脱次数对MI-SPE回收率的影响
3.1.2 洗脱溶剂及洗脱次数的选择洗脱剂一般选择甲醇、乙醇、乙酸等极性溶剂以破坏底物与识别位点所形成的氢键作用. 阿司匹林为酯类化合物, 在水或乙酸存在时易发生水解反应, 因此不能用酸性或碱性溶剂作洗脱溶剂. 本文对甲醇、乙醇的洗脱效果进行了对比, 并研究了洗脱次数对回收率的影响. 单次洗脱溶剂体积为2 mL, 丙酮为样品溶剂, 真空进样压力为1200 Pa, 测定每次洗脱对阿司匹林的回收率. 实验结果表明, 在相同条件下, 甲醇的单次洗脱回收率为79.9%, 乙醇为82.3%. 将阿司匹林洗脱完全, 乙醇只需4次洗脱, 而甲醇需要7次. 经过4次洗脱后, 使用乙醇为洗脱溶剂累计回收率为8
4.5%, 而使用甲醇累计回收率为83.1%. 综合考虑两种洗脱溶剂的洗脱效果及成本, 选择乙醇为最佳的洗脱溶剂.
3.1.3 样品溶剂的选择分别选用氯仿、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙腈、四氢呋喃、二甲基甲酰胺(DMF)和甲苯为样品溶剂, 以乙醇为洗脱剂, 洗脱次数为4次，进样真空压力为1200 Pa, 考察样品溶剂对MI-SPE吸附量的影响, 结果如图3所示. 使
用极性较大的甲醇、乙腈等为样品溶剂时吸附量较低, 而使用低极性的丙酮、甲苯为样品溶剂时吸附量大大提高. 这是因为随着样品溶剂极性的增加, 溶剂在和MIP
竞争印迹分子时的优势也在增加, 保留在萃取柱中的阿司匹林的量将会减少, 从而
乙醇洗脱出来的阿司匹林也会相应减少. 本文选择吸附量最大的丙酮作为样品溶剂及清洗溶剂.
图4 样品溶剂对MI-SPE吸附量的影响
3.2 紫外光度法定量分析
3.2.1 线性范围及检出限实验配制0.18、0.90、1.8、9.0、18、90、180、900、1800 mg/L阿司匹林丙酮标准溶液. 取2 mL标准溶液, 在进样真空压力为1200 Pa的条件下进样, 用2 mL丙酮清洗MI-SPE柱, 最后用8 mL乙醇分4次洗脱(每
次 2 mL), 洗脱液定容至10 mL. 分别测定其吸光度, 绘制标准曲线.在1.8～180
mg/L质量浓度范围内有良好的线性关系, 回归方程为Y=225X-1.12，相关系数R 为0.9993，检出限为0.32 mg/L.
3.2.2 样品测定及加标回收率实验准确移取2 mL样品溶液, 用MI-SPE进行处理，测定洗脱液吸光度值，根据上述回归方程计算含量. 测得阿司匹林药片中阿司匹林含量为7.12%(重量百分比). 样品重复测定5次，RSD为
4.0%;精密称取样品5份, 分别加入标样0.090 mg, 按上述方法进行测定. 测得加标平均回收率为107.3%, RSD为3.7%.
4 结论
本文合成阿司匹林MIP作为SPE的萃取材料, 并研究了进样压力、样品溶剂、洗
脱溶剂及洗脱次数对阿司匹林MI-SPE萃取性能的影响. 最佳的真空泵压力为
1200 Pa, 样品溶剂为丙酮, 洗脱溶剂为乙醇, 洗脱次数为4次. 在上述实验条件下, 对阿司匹林药片中进行MI-SPE处理, 并应用紫外光度法进行定量分析. 测得含量
为7.12%, 精密度为4.0%, 加标平均回收率为107.3%. 实验结果表明, MIP-SPE-
UV联用技术用于测定阿司匹林, 方法简单快速, 不需要昂贵的色谱类仪器, 灵敏度高, 对于实现阿司匹林的快速、高选择性分析具有较好的应用价值.
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