银杏内生真菌的分离及抑菌活性研究

第一章 文献综述
农业生产过程中，化学农药成为控制农作物病虫草害的主要手段，对减少病 虫草危害，保证农作物丰产丰收，起到重大作用。

由于具有防治效果好，见效快， 成本低，使用方便等特点，化学农药发展迅猛。

过去人们对生态平衡规律的认识 不足， 过分依赖化学农药的毒杀作用， 导致一系列环境和健康问题， 主要表现有： 环境污中的农药残存，以及食物链的富集作用，引发药源性疾病，增加了人类健 康风险；杀伤有益生物，破坏生态平衡，引起病虫害再猖獗和次要危害加重；引 起防治对象的抗药性，使得化学农药的防治效力下降，迫使提高农药的施药量， 加剧了农药污染等问题；在农业出口创汇方面，农药残留也降低了我国农副产品 的竞争能力 [1] 。

目前化学防治的危害已被人广泛认知，研制安全高效、环保健康的新型农药 已成为发展的方向和研究的主题。

生物农药因使用安全，对环境友好，不易产生 抗性等优点，成为新型农药发展的热点和重点。

1.1 微生物农药
生物农药是指用于防治作物病、虫、草害的生物活性物质或具有类似作用的 生物制剂，包括生物杀虫剂、除草剂、农用抗生素等 [2] 。

其特点如下 [3] ：均是天 然存在的活体生物或代谢物，对环境安全，无残留；防治病虫草害专一性强且病 害难以产生抗性；对非靶标生物相对安全，避免生态平衡的破坏。

微生物源农药是应用微生物活体及其代谢产物作为防治作物病害的活性物 质，包括保护生物活体的助剂、保护剂和增效剂，以及模拟某些杀虫毒素和抗生 素的人工合成制剂 [4] ，被认为是无公害农药。

由于微生物种类繁多，资源丰富， 培养过程中条件易于控制，繁殖周期短，速度快，可通过育种手段及生物技术改 造菌种，进而工业化生产，使得微生物源农药的研究与开发富有广泛成效。

微生物是开发新型生物农药的资源宝库，已从中发现多种生物活性物质，在 此基础上成功开发出有价值的新型农药。

此前大部分具杀虫、杀菌及除草活性物 质的来源是从土壤微生物中分离得到，且多为放线菌。

近年来出现自植物内生真 菌中分离出抑菌活性物质的研究报道， 可见植物内生真菌亦是微生物农药开发的 重要对象。

1.2 植物内生菌
1.2.1 植物内生菌的定义
内生菌(Endophyte)的概念最早由De Bary（1866）提出，是指生活在植物体
内的微生物，用以区分那些生活在植物表面的表生菌(Epiphyte)，De Bary [5] 把生活在植物体内的一切微生物都定义为内生菌， 其中也包括植物致病菌和菌根 菌。

此后Petrini(1991) [6] 、Bills(1996) [7] 和Stone(2000) [8] 等先后将内生菌定义为不 同的概念。

现在普遍接受的内生菌定义是 Petrini(1991)提出的，指生活在植物组 织内或生活史中的某一阶段生活在植物组织内， 对植物组织不引起明显变化的一
，对 类菌群，包括那些生活史中某一阶段能营造表生生活的腐生菌（saprophyte）
宿主暂时没有伤害的潜伏性病原菌(Latent pathogens) 和菌根菌(Mycorhiza fungi)。

根据对寄主植物的作用，内生菌不仅包括了与宿主植物互惠共利和中性 的内共生微生物，也包括了一定时期内潜伏在宿主体内的病原微生物。

1.2.2 植物内生真菌的生物多样性和普遍性
植物内生真菌普遍存在于各种陆生及水生植物中，从低等的藻类、苔癣和蕨。

在目前所有研究过内生真菌的植物中， 类植物到高等的裸子门、被子门植物，
都正明了其存在。

内生真菌的数量、种类与植物的生长环境、气候条件、取样时 间及分离方法等因素有关。

每种植物或部位都有分离几率较高的种类，被称为优 势种群。

其中一些可能是其宿主植物或组织的专属型种群。

按照推算，目前已知 的25万种植物中，内生真菌总数可能达百万种之多。

可见内生真菌是自然界非常 丰富的资源库 [9­10] 。

1898年Guerin等人从黑麦草(Lolium temulentum)中首次分离到植物内生真 菌，开创了研究先河。

1993年，美国Montana大学的植物病理专家Stierle从短叶 红豆杉(Pacific Yew)的韧皮中分离出能产生紫杉醇(taxol)的内生真菌—安德鲁紫 杉菌(Taxomyces andreanae) [11] ，此类研究加深了对植物内生真菌的了解，掀起了 研究植物内生真菌的热潮。

自最早从禾本科植物（如牧草）中发现内生真菌以来，20世纪70年代里，内 生真菌在一些重要的经济林木如针叶类的各种冷杉(Abies mill)、云杉(Picea asperata)和松柏，以及阔叶的栎树(Quercus L.)、桤木(Alnus cremastogyne)、桉树 (Eucalyptus spp)等植物树皮、枝叶内相继被发现并得到研究 [12­14] 。

多种灌木和栽 培作物、果树中也都发现了大量内生真菌 [15] 。

据统计，近年来从55科108属153 种植物中分离得到内生真菌达171属。

热带森林被认为是内生真菌资源最丰富的 地方。

国外学者Anorld等分析了巴拿马中部雨林中2种植物叶片中的内生菌，结 果发现分离自83个健康叶片上的内生菌多达418个形态学种 [16] 。

Hyde等经过对 澳大利亚热带地区棕榈树(Trachycarpus fortunei)的研究，指出平均从每种棕榈树 内可以分离到约100种内生真菌 [17] 。

国内研究中，浙江农科院在2003至2005年间 从雷公藤(Tripterygiun wilfordii) 各组织中共分离到的内生真菌，细菌和放线菌共 614 株，其中从根中分离得到菌株307株，占总数的50%；茎中分离出270株，占
44%；叶中分离出37株，占6%。

从银杏（Ginkgo biloba L.）中分离出内生菌株159 株，其中根中分离出72株，占总数的45.3%；从茎中分离出55株，占34.6%；从 叶中分离出32株，占20.1% [18] 。

韦继光在分离罗汉松(Podocarpus macrophyllus)、 山茶(Camellia japonica)及云南红豆杉(Taxus wallichiana)等植物的内生真菌时， 仅 拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)就获得865株，其中包括3个新种、4个新组合，15个 种是首次报道 [19] 。

植物内生真菌广泛分布于植物的根、茎、叶和果实等器官组 织中，其种类、数量和分布都因植物种类不同而异，具有广泛的生物多样性和普 遍性。

1.2.3 植物内生真菌与宿主的关系
植物与周围环境生物的互作是一种普遍现象， 其中植物—微生物的相互作用 是重要形式之一。

内生真菌生活在植物体这一特殊的环境中，构成了植物体内的 微生态系统，与宿主协同进化，形成了互惠共生的关系 [20­22] 。

它在吸收植物为自 己提供的营养的同时，又对植物的生长发育和系统演化起着重要作用。

研究内生 真菌自身的生物学特性及其对植物初级代谢和次级代谢的调节有利于更好地阐 述植物受益的机制。

Carroll [23] 归纳了内生真菌与寄主互利共生的特性：（1）该内 生真菌在特定的宿主中普遍存在，宿主不表现明显的病症；（2）该真菌水平或垂 直传播的效率高；（3）内生真菌在整株植物组织内均能生长定殖，若只在某一组 织器官中生长，则在该组织器官中感染强度较高；（4）内生真菌能分泌毒物或抗 生物质；（5）该菌在与病原物拮抗菌在分类单位上类似。

已知内生真菌对其宿主 植物可产生如下几方面的有益作用。

提高宿主植物对生物胁迫的抗性：其能产生 多种生物碱和真菌毒素，这些次生代谢产物对昆虫和食草动物具有毒性，降低宿 主植物的适口性，阻抑采食，能够激活植物体内防御霉，如过氧化物霉，几丁质 霉等，诱导致病相关蛋白的产生，并且可以产生诸如黄灰霉素 A 和多种醌类抗 生素，抑制植物病原菌生长，提高植株的抗病性；提高宿主植物对非生物胁迫的 抗性：增强植株对干旱、高温环境条件的抗性和持久性；促进宿主的生长发育: 表现在种子发芽、幼苗存活、花序、生物量等多个方面；加速秸秆降解：内生真 菌生长在植物内部，其感染植物的过程本身就是水解木质素、纤维素的过程，对 秸秆有较好的降解能力，而且对后季作物生长没有危害，还能在一定程度上促进 作物的生长 [24­26] 。

1.3 植物内生真菌的开发与应用
内共生理论认为， 次生代谢过程中生化途径的连续演化会导致有益物质进入 共生体内，其基本的生化过程信息往往还会传递到其他生物中去。

在共生体内， 次生代谢中有用的生化途径， 可以被其他生物利用， 表现出相互作用和协同进化。

研究发现，特殊生态环境下的微生物与特殊的次生代谢产物有着密切的联系 [27­29] 。

因此可以将具有特殊生境的生物作为活性物质的筛选工作的关注点。

内生 真菌数量种类庞大，其宿主植物分布广泛，其代谢途径与代谢物和所处的微生态 系统环境息息相关。

从微生物中寻找并研制新型先导化合物是新药创制的重要途 径。

内生真菌作为其中重要的类群，是较新的研究领域 [27] 。

近年来，植物内生 真菌及其代谢产物在医学方面的多有研究， 在农业上的应用也逐渐开展并成为热 点。

1.3.1 内生真菌在医药方面的应用
从天然产物中筛选生物活性成分或先导化合物是研制新药的有效途径。

以往 20年有近一半的药物来源于天然产物或先导化合物，大约5%的药物直接来源于 天然化合物 [30] 。

药用植物是中药的主要来源，其内生真菌很可能产生与中药相 同或相似的具有生物活性的化合物。

一些种植数量有限的珍稀药用植物，可以通 过内生真菌的扩大培养，提取具有生理活性的次生代谢物作为药用 [31­33] 。

紫杉醇(taxol)是近年来发现的重要抗肿瘤药物，最早由美国Wani等人于1971 年分离自短叶红豆杉( Taxus brevifolia) 的树皮中，是一种以极低含量存在于各种 紫杉属植物树皮和树叶中的萜类化合物，是治疗乳腺癌、子宫癌、卵巢癌和多种 恶性肿瘤的良效药物，自1992年被美国食品与药物管理局（FDA）正式批准用于 临床以来，取得了临床疗效和市场效益的巨大成功 [34] 。

随着紫杉醇需求量的日 益增大，人们开始多方寻求其来源途径。

1993年，Stierle从短叶红豆杉的韧皮中 分离出能产生紫杉醇的内生真菌—安德鲁紫杉菌(Taxomyces andreanae)。

他的发 现为解决紫杉醇药源问题提供了新的研究途径。

受此启发，我国学者也相继展开 了药用植物内生真菌的研究。

中山大学王伟等 [35] 从南方红豆杉（Taxus chinensis V ar）体内分离到多株内生真菌，检测得出6株菌株能够产生紫杉烷类化合物。

Guo等 [36] 又从南方红豆杉找到了一株新的产生紫杉醇的内生真菌BT2，该菌不仅 能够产生紫杉醇，还可以产生合成紫杉醇的中间体化合物taxane baccatin III。

现 今已从南方红豆杉 [37­41] 、短叶红豆杉、落羽杉和榧树 [42­44] 等红豆杉科植物中分 离到了多个能产生紫杉醇的内生真菌。

长春花(Catharanthus roseus L.)全草可入药，是珍贵的药用资源。

目前已经从 长春花中分离出了 70 多种生物碱，具较强的抗肿瘤活性成分主要是二聚吲哚类 化合物长春碱(VLB)和长春新碱(VCR)。

长春新碱（Vincristine）是从长春花中发 现的一类双吲哚型生物碱，作为新型的抗肿瘤药物，可用于治疗何杰金氏病、 恶性淋巴肿瘤等疾病，其硫酸盐已广泛用于临床。

云南大学张玲琪 [45] 、 杨显志 [46] 和郭波 [47] 分别从长春花树皮和叶组织中分离到多株内生真菌，用 TLC 和 HPLC技术分析菌丝体和发酵液提取物，检测到几种长春新碱成分及类似物的存
在。

此外张玲琪 [48] 等人还从桃儿七、南方山荷叶和川八角莲的地下茎韧皮部分 离出内生真菌 90 余株，其中 6 株具有产生鬼臼毒素或类似木脂素类化合物的能 力。

鬼臼毒素（Podophyllotoxin）是杂环类烯酮化合物，通过抑制细胞的有丝 分裂起到抗肿瘤、抗病毒作用，并对心脑血管疾病有一定疗效。

张玲琪 [49] 从云 南美登木中分离到一株球毛壳菌（Chaetomium globosum）,可以分泌产生球毛壳 甲素 （Chaetoglobosin A）。

倪志伟 [50] 从云南美登木分离筛选到一株球毛壳菌Ly50, 利用活性追踪法在其发酵产物中发现两个活性化合物， 经鉴定为球毛壳甲素和球 毛壳乙素。

前者于 1983 年被发现，通过抑制细胞分裂的作用达到抗癌效果，其 衍生物正用于临床研究。

球毛壳菌与美登木产生结构类型完全不同的抗肿瘤活性 物质,说明了植物内生微生物中可以产生与宿主植物活性相似的化合物。

也有研究者从银杏(Ginkgo biloba L.)内生球毛壳菌的菌丝提取物中检测到球 毛壳甲素的存在 [51] 。

此外，成都中医药大学严铸云等人 [52] 从银杏中筛选出 7 株 能够产生银杏内酯类或其结构类似物的内生菌株。

银杏内酯（ginkgolide）属于 二萜类化合物，包括白果内酯和银杏内酯A、B和 C等，是血小板活化因子PAF 强有力的拮抗物，具有改善血液流变状态，保护心脑血管，防治冠心病、脑血栓， 抗炎、抗过敏等良好的药理作用。

黄酮（flavone）是一类以苯色酮环为基础的酚 类化合物，具有改善血液循环，降低胆固醇，从而减少心脑血管疾病发病率 的药用和保健作用。

赵庆云 [53] 从银杏的根和茎中分离得到的 120 余株内生真 菌， 经摇瓶培养后用 HPLC­UV 分析各菌株产黄酮类化合物的能力， 7 株具备。

陈双林 [54] 从银杏叶片中获得 EG4 内生真菌，经形态分类学鉴定为茨盘孢属， 分析培养液发现该菌株可产生黄酮类化合物，经过培养条件的改良，明显促 进其酮类物质的合成。

此类菌株开发为解决银杏药用产物在植株体含量低，分 离纯化和人工合成难度较大的问题提供一条可操作性途径。

1.3.2 生物防治
自然环境下真菌与植物之间经过长期的共同生殖和进化，形成了“寄生—偏 利共生—互利共生”的一系列相互作用类型，其中病原真菌与菌根真菌因为与农 牧业和林业的密切关系，很早就受到重视。

上世纪 80 年代以来，内生真菌对共 生的高等植物的有益影响也逐渐为研究者所认知 [55­57] 。

植物体内存在特殊的内生 真菌，作为生防菌能有效地抑制植物病原菌的生长繁殖，提高植株的抗病能力。

早期植物内生菌的抗病活性功能是在禾本科植物中发现的。

1985 年 White [58] 发 现禾本科植物内生真菌中的枝顶孢（Acremonium coenophilum）对多种体外培养 的农作物病原真菌有抑制作用。

后经研究发现，许多木本及其它种类植物的内生 真菌同样具有抗病抑菌活性 [59] 。

Findlay [60] 从黑云杉中分离到一株内生真菌，在 其液体发酵产物中分离出两个新的苯并吡咯类活性成分， 对由丝核菌和镰刀菌引
起的水稻病害有较好的防效。

Strobel [61] 从雷公藤茎中分离得到一株内生真菌， 能产生两种抗菌素—多肽类化合物和新酰胺生物碱， 前者对白色念珠菌等人体病 原真菌有强烈的抑杀作用,后者对水稻稻瘟病菌有明显抑制作用。

Merritt [62] 从智 利香花树中分离出一种胶球菌，可产生挥发性杀菌物，包括 1­正丁醇、3­甲基­ 苯乙醇和醋酸，对终极腐霉和轮枝菌等病原真菌起到致死作用。

国内的研究中，香港城市大学 Vrijmoed [63] 从中国南海红树中分离的内生真 菌能产生灰黄霉素和醌类抗生素，对几种酵母菌和霉菌均有抑制作用。

西北农林 科技大学顾爱国等人 [64] 从苦皮藤内生的镰刀菌中分离到环肽类抗生素恩镰孢菌 素(eniatinns)类化合物，其对番茄早疫、烟草赤星、小麦根腐和玉米大斑 4 种植 物病原真菌的菌丝生长和孢子萌发抑制率均在 80%以上。

邓振山 [65] 等采集三处 的银杏叶和茎，从中分离出9株能够抑制苹果腐烂病菌生长的内生真菌，观察其 中作用显著的4株，发现有溶解病原菌菌丝的分泌物生成。

抑菌机制研究表明生防菌防治病害的主要机制在于分泌生物活性物， 使得病 原菌菌丝萎缩、溶解，抑制其孢子的产生和萌发，或是主动进入植株内生定殖， 影响植株的新陈代谢或是诱导寄主植物产生过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶(CAF))等参与植物的抗病害反应 [66­68] 。

1.4 论文研究的目的及意义
宿主植物构建了内生真菌特殊的生长环境， 使其体内的真菌在长期的共生过 程中，能够产生与自身一致或类似的结构新颖、生理活性独特的代谢产物，为新 型农药及其先导化合物的研究和应用开拓了美好前景 [69] 。

上述研究充分表明了 植物内生真菌能产生新型的抑菌活性物质。

当前，利用内生真菌获得生理活性物 质已成为研究热点。

银杏素有裸子植物“活化石”和“植物界熊猫”之称，是中国特 有的珍贵树种，在漫长的生长期中几乎不感染病虫害，寿命极长。

根据共生理论 推断，银杏中很有可能存在着特殊的内生真菌，通过产生特殊的次生代谢产物增 强银杏的抗病害能力 [70] 。

作者查阅国内外大量文献， 较少有关于银杏内生真菌在抑制植物病原菌方面 的研究。

本试验以银杏的根、茎、叶组织为材料分离内生真菌，以几种重要的果 蔬病原菌示菌，筛选得到为指抑菌活性菌株，对活性菌株进行鉴定并测定其生物 学特性，初步研究内生菌株代谢产物的抑菌作用，为银杏内生真菌的研究及开发 其活性成分提供了一定的科学依据。

第二章 内生真菌的分离筛选
2.1 材料
2.1.1 菌种分离材料
树龄大约为40年的银杏(Ginkgo biloba L.)根、茎、叶组织，2009年10月上 旬采自安徽农业大学校园内。

2.1.2 供试病原菌
选用6种植物病原真菌：辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici,PC)，番茄枯萎 病菌 (Fusarium oxysporum,FO)，苹果腐烂病菌(Cytospora mandshurica,CM)，苹 果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides,CG)，梨黑星病菌(V enturia pirina,VP)，。

由安徽农业大学植保学院植物病理教 小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum,FG）
研室提供。

2.1.3 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水 1000ml；pH自然。

2.1.4 主要试剂
乙醇、次氯酸钠(上海振兴化工一厂)
2.1.5 主要仪器设备
LS­B50L型立式压力蒸汽灭菌器 江阴滨江医疗设备厂
超净工作台苏州 安泰空气技术有限公司
电热恒稳培养箱 上海一恒科学仪器有限公司
电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司 2.2 方法
2.2.1 样品采集
选取树龄大约在 40 年的银杏树，随机取其根皮、茎、叶健康组织，经 70% 酒精表面擦洗消毒后，标号，放于无菌纸袋中，运回实验室进行菌株分离。

2.2.2 内生真菌分离方法
将样品切成 0.5 cm×0.5 cm大小左右的小片，依次用70%酒精和0.2%次氯 酸钠溶液各浸泡1 min和 2min，无菌水冲洗3 次，阴干，后置于PDA培养基平 板上， 28±1℃黑暗培养。

培养3d左右，样品表面或边缘出现菌丝，挑取菌丝转
接到不含抗生素的 PDA 平板上培养，观察记录菌落的生长情况及特征，待纯化 后制成斜面，4℃保存 [71] 。

2.2.3 消毒效果的验证
本实验采用两种方法对消毒效果进行验证 [72] 。

方法1：将最后一次冲洗组织材料的无菌水涂抹于PDA平板上作为对照。

方法2: 采用组织印迹法，取消毒好待处理的样品组织块放在未使用的PDA 平板上轻轻滚动或紧贴培养基放置5min后移走作为对照。

对照各重复5次， 28±1℃避光恒温培养。

如对照有培养物生成，表明表面消毒不彻底，分离结果无效。

2.2.4 菌株筛选
采用平板对峙法，取活化好的内生真菌和供试病原菌，用打孔器沿菌落外缘 制成直径6mm 的菌饼，分别接种到 PDA 平板上，二者圆心相距2.5cm，以只接 病原菌的作为对照（处理和对照均设3次重复）
，置于28±1℃下恒温避光培养，观 察记录病原菌菌落的生长状况及抑菌作用，测量菌丝扩展直径，计算抑菌率，筛 选出对病原菌菌丝生长具有抑制作用的内生真菌 [73­74] 。

菌丝生长抑制率(%)= 对照菌落直径－处理菌落直径
对照菌落直径
×100
2.3 结果与分析
2.3.1 内生真菌分离与纯化
采用组织法，从银杏组织器官中分离得到 26 株内生真菌，已初步通过显微 镜观察将形态相似的菌株排除。

表面消毒效果验证试验的对照平板上无菌物长 出，证明表面消毒彻底，结果可信。

表 2­1 银杏各组织内生真菌的分离结果
Table 2­1 Isolation of endophytic fungi from Ginkgo biloba L in different tissues 分离部位 样本数 数量/株 占总菌株数的比率% 菌株
茎 叶片 根皮 20
20
20
6
13
7
23.1
50.0
26.9
Z­1­Z­6
L­1­L­13
T­1­T­7
2.3.2 活性菌株的筛选
采用平板对峙法，测试了内生真菌各菌株对6种供试病原真菌的拮抗作用， 结果见表2­2。

对峙试验结果表明，来源于根皮的5株，叶片中的9株，茎中的3株
内生真菌表现活性，分别占各自分离总数的71.4%，69.2%和50.0%。

T­4、T­7、 L­4和Z­4菌株对苹果腐烂病菌(Cytospora mandshurica）等6种植物病原真菌的抑 制作用都达到了50%以上，其中菌株T­4和T­7活性表现突出。

二者对苹果腐烂病 菌的抑制率均达到90%以上；对梨黑星病菌分别达到78.9%和81.5%；T­4对番茄 枯萎病菌抑制率为85.7%；T­7对辣椒疫霉病菌的抑制作用也在90%以上，对小麦 赤霉病菌达75%。

表 2­2 银杏内生真菌的拮抗作用
Table2­2Antagonistic activities of endophyte isolates of Ginkgo biloba L 菌 株
抑制活性（%）/Antagonistic activities（%） Strains CM CG FO PC VP FG T­1 74.00 55.56 61.90 60.00 No 8.33 T­2 No No No No No No T­3 No No No No No No T­4 94.00 66.67 85.71 68.57 78.95 66.67 T­5 86.21 No 35.71 45.83 40.00 25.00 T­6 72.41 11.11 28.57 66.67 30.00 16.67 T­7 94.00 66.67 52.86 94.29 81.58 75.00 L­1 No No No No No No L­2 77.59 11.11 21.43 66.67 35.00 33.33 L­3 No No No No No No L­4 86.00 55.56 71.43 77.14 65.79 54.17 L­5 No No No No No No L­6 70.69 No 28.57 33.33 45.00 33.33 L­7 66.00 55.56 38.10 82.86 52.63 75.00 L­8 76.00 44.44 42.86 65.71 60.53 79.17 L­9 67.24 11.11 14.29 45.83 20.00 33.33 L­10 72.00 50.00 33.33 88.57 57.89 62.50 L­11 No No No No No No L­12 70.69 11.11 35.71 66.67 30.00 25.00 L­13 81.03 No 28.57 50.00 35.00 33.33 Z­1 No No No No No No Z­2 No No No No No No Z­3 54.00 27.78 57.14 48.57 52.63 41.67 Z­4 60.00 61.11 52.38 60.00 55.26 58.33 Z­5 No No No No No No Z­6 68.97 11.11 7.14 66.67 20.00 25.00
注：No 表示无颉抗作用；所有结果均为三次数据的平均值
Notes：No，no antagonism. All data are averages of three times data
2.4 小结与讨论
2.4.1 银杏内生真菌的分离
试验选取健康的银杏组织，共分离得到 26 株内生真菌。

根皮、茎和叶组织 的菌株数目各占总数的26.9%、23.1%和50.0%，与目前已有报道的结果一致 [75] 。

本试验分离所得的内生真菌数量与相关文献相比偏少。

采用组织分离法分离内生 真菌的技术要点在于分离材料表面消毒的效果， 消毒不彻底影响分离结果的准确 性，而消毒时间过长则可能杀死内生菌株。

消毒试剂选用了 70%酒精和 0.2%次 氯酸钠溶液，叶片质地柔嫩，相应缩短了消毒时间；根皮组织表面粗糙、纹理深， 杂菌容易隐藏其中，故在实际操作中延长了消毒时间。

日后可对消毒条件和时间 上进行反复尝试，寻找较优的分离程序 [76] 。

分离选用的培养基可有多种选择。

内生真菌处在植物体内的特殊环境中，培养条件难以确定，增加其离体培养的难 度。

试验过程中只采用了 PDA 培养基及特定的培养条件对银杏组织中的内生真 菌进行分离培养， 造成了一些培养条件较特殊的菌株被疏漏。

此外， 银杏的树龄， 生长环境和季节等因素也会制约其内生真菌的生长和分布情况，影响分离结果 [77­79] 。

从分离结果看，银杏不同部位内生真菌的分布存在明显差异，表现出植物 内生真菌生物多样性的特点。

植物不同部位内生真菌数量及种群存在差异的原 因，可能在于不同部位的微环境如通气状况、酶和其他化学成分不同，适合不同 内生真菌类群侵入、生长。

银杏内生真菌大多分布在茎的韧皮部，叶片中内生菌 较少，这可能与韧皮部质地疏松，营养物含量丰富有关 [80­81] 。

2.4.2 活性菌株的筛选
从平板对峙结果看，T­4、T­7、L­4 和 Z­4 菌株表现出良好的抑菌活性。

前 两者表现最好，对辣椒疫霉和苹果腐烂病菌的抑制率高达90%以上。

为本文的后 续工作提供了良好素材。

经研究报道，拮抗菌发挥抑制作用的机制多有不同，有 的产生抑菌物质，形成抑菌带而抑制病原菌生长，有的与病菌接触产生竞争作用 或者重寄生作用而达到抑制效果 [82] 。

经显微镜观察，处于对峙面的病原菌边缘 气生菌丝表现粗不同程度的分布杂乱、畸形，基质菌丝出现萎缩、稀疏、颜色变 深，乃至溶解现象。

筛选所得的活性菌株与供试病原菌之间有明显的抑菌带，病 原菌对峙面菌丝生长明显异常，推测活性菌株可能代谢产生抑菌活性物，为其次 生代谢产物的研究提供了可靠依据 [83] 。

内生真菌的生理活动与其宿主的内部环境有着必然的联系， 其代谢途径的选 择和代谢产物的产生会受到生长环境的影响。

离体培养条件下，生存环境发生改 变，内生菌株的代谢生理可能会有所变化。

通过对其生长特性的研究，以期达到 培养条件的控制与优化 [84­85] 。