倍他米松对变应性鼻炎小鼠嗅觉障碍的干预作用

倍他米松对变应性鼻炎小鼠嗅觉障碍的干预作用
王晓巍;倪道凤;朱莹莹;亓放;高志强;陈晓巍
【摘要】目的观察变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)对嗅觉功能的影响及倍他米松对AR嗅觉障碍的干预效果.方法应用卵清蛋白致敏并激发BALB/C小鼠,建立AR
小鼠模型.应用埋藏小球实验(buried food test,BFT)评估AR小鼠嗅觉功能,HE染
色及免疫组化方法观察AR小鼠嗅黏膜组织形态学变化及嗅觉标记蛋白(olfactory marker protein,OMP)表达的变化.腹腔内注射复方倍他米松,分别在干预后第7及14天应用免疫组化方法检测AR小鼠嗅黏膜OMP表达的变化.结果对成功建模的AR小鼠进行嗅觉功能评估,74.55%的AR小鼠伴有嗅觉障碍.AR小鼠嗅黏膜上皮
层较对照组明显变薄,嗅感受神经元(olfactory receptor neurons,ORNs)层数减少、排列紊乱.AR小鼠嗅黏膜OMP表达亦较对照组减少,其中AR伴嗅觉障碍组嗅上皮OMP染色阳性细胞数为39.77±2.012,与对照组66.38±1.517比较,差异有统计学意义(P＜0.05);但AR不伴嗅觉障碍组嗅上皮OMP染色阳性细胞数为
59.50±0.558,与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).复方倍他米松干预1组小鼠嗅黏膜OMP表达增加,已接近对照组水平,为62.04±1.227,与不用药组
47.34±1.809比较差异有统计学意义(P＜0.05).复方倍他米松干预2组OMP表达与复方倍他米松干预1组相似,两组OMP染色阳性细胞数比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 AR引起嗅觉障碍的作用机制除鼻腔气道阻塞原因外,嗅黏膜本身因炎症发生变化也是重要原因.全身应用糖皮质激素可对嗅黏膜产生影响,是治疗AR
引发嗅觉障碍的有效方法.
【期刊名称】《协和医学杂志》
【年(卷),期】2012(003)002
【总页数】8页(P154-161)
【关键词】变应性鼻炎;嗅觉;糖皮质激素;嗅觉标记蛋白;动物模型
【作者】王晓巍;倪道凤;朱莹莹;亓放;高志强;陈晓巍
【作者单位】中国医学科学院,北京协和医学院,北京协和医院耳鼻咽喉科,北
京,100730;中国医学科学院,北京协和医学院,北京协和医院耳鼻咽喉科,北
京,100730;中国医学科学院,北京协和医学院,北京协和医院耳鼻咽喉科,北
京,100730;中国医学科学院,北京协和医学院,北京协和医院耳鼻咽喉科,北
京,100730;中国医学科学院,北京协和医学院,北京协和医院耳鼻咽喉科,北
京,100730;中国医学科学院,北京协和医学院,北京协和医院耳鼻咽喉科,北
京,100730
【正文语种】中文
【中图分类】R593.1;R765.4;R453
嗅觉作为人体的重要感觉之一，在人类社会生活中发挥着重要的作用。

嗅觉的主要功能包括辨别气味、识别环境、引起食欲及情绪调节等,人的嗅觉敏感与否对生活、学习和工作能力影响很大。

鼻是嗅觉的感觉器官，嗅觉感受器位于嗅裂顶部的嗅上皮(olfactory epithelium，OE)，用以接受气味分子的刺激。

通过呼吸，气味分子溶于OE黏液，引起嗅感受神经元(olfactory receptor neurons，ORNs)去极化，产生动作电位；动作电位沿轴突传向嗅球(olfactory bulb，OB)，进而传向嗅觉中枢，引起嗅觉。

嗅觉障碍在人群中并不少见，有研究曾对150万人进行嗅觉调查，其中1.2%有永久性嗅觉丧失，62.4%有暂时性嗅觉丧失[1]。

引起嗅觉障碍的常见原因有上呼吸道感染、鼻窦疾病、鼻部手术、脑肿瘤、鼻肿瘤、内分泌紊乱、头部外伤、年龄、放射线、有毒化学物质、精神性因素、药物性因素、先天性因素和神
经变性疾病等[2]。

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是常见的耳鼻咽喉科疾患，也是临床上引起嗅
觉障碍的主要原因之一。

目前各项流行病学研究均趋向于认为，人群中AR的发病率约为10%～30%[3]。

嗅觉障碍是AR的常见伴随症状，文献中常记录嗅觉丧失
或减退与鼻部变态反应相关[4]。

Cowart等[5]调查显示23.1%的AR患者存在嗅
觉减退，Rombaux等[6]报道AR引起嗅觉减退的发病率为15%～20%。

AR引起嗅觉障碍的机制尚未完全明了。

既往认为鼻腔炎症导致气味分子到达鼻腔顶部嗅觉感受器的通道受阻是导致嗅觉障碍的主要原因，即传导性嗅觉障碍。

近年来的研究表明，因变态反应引起嗅上皮组织病理学变化，即感觉性嗅觉障碍，可能是AR患者产生嗅觉障碍的直接原因之一[7]。

无论是AR，还是其他原因导致的嗅觉障碍，目前尚无理想的治疗药物。

临床上常用糖皮质激素(glucocorticoid，GC)治疗嗅觉障碍。

Faulcon等[8]用GC治疗41
例病毒感染后嗅觉障碍患者，发现治疗效果良好。

Heilmann等[9]对55例患者的临床研究发现，口服泼尼松龙可以改善上呼吸道感染、鼻窦炎、特发性嗅觉障碍等各种原因引起的嗅觉障碍。

Stevens[10]指出对鼻息肉鼻内镜术后已解除阻塞但仍有嗅觉障碍的患者，每天口服40 mg泼尼松(逐渐减量)有助于嗅觉的改善。

笔者
在临床上应用局部气动喷射雾化吸入GC治疗嗅觉障碍，也取得较好疗效[11-12]。

目前尚缺乏GC针对AR引发嗅觉障碍进行治疗的临床研究，但GC作为AR的一线选择用药，已在临床上广泛应用。

本实验采用卵清蛋白致敏小鼠，建立AR小鼠模型，观察AR小鼠鼻腔嗅上皮组织病理学变化；并通过腹腔内注射复方倍他米松，对小鼠嗅黏膜嗅觉标记蛋白(olfactory marker protein，OMP)的表达水平进行定量分析，探讨GC治疗AR嗅觉障碍的作用。

材料
实验动物：清洁级BALB/C小鼠70只，由维通利华公司提供，雄性，8周龄，体
重(25±1)g，在本院实验动物中心饲养。

70只小鼠随机分为模型组(60只)及对照
组(10只)。

主要试剂：卵清蛋白(ovalbumin, OVA)(Sigma公司)；Al(OH)3(Sigma公司)；
戊巴比妥钠(Gene公司)；多聚甲醛(北京鼎国生物技术有限责任公司)；EDTA(北
京中杉金桥生物技术有限公司)；pH 8.0 Tris-EDTA抗原修复液(Dako公司)；山
羊抗人嗅标记蛋白单克隆抗体(Wako公司)；辣根酶标记兔抗山羊抗体，非生物素二步法免疫组化检测试剂(PV-6003，北京中杉金桥生物技术有限公司)；非生物素抗体稀释液(Dako公司)；复方倍他米松注射液(得宝松，规格为1 ml，含二丙酸
倍他米松5 mg及倍他米松磷酸钠2 mg，上海先灵葆雅制药有限公司)。

造模
致敏阶段：模型组小鼠腹腔注射卵清蛋白Al(OH)3溶液(浓度40 μg/ml)200 μl(约300 μg/kg)，隔天1次，连续7次。

卵清蛋白Al(OH)3溶液以20 mg 卵清蛋白
加2 mg Al(OH)3佐剂、生理盐水定容500 ml配制，于临用前配制。

对照组以等量生理盐水代替卵清蛋白溶液。

激发阶段：于致敏阶段结束7 d后，以戊巴比妥腹腔内注射麻醉，以移液器吸取
卵清蛋白溶液(浓度50 μg/ml)40 μl(约80 μg/kg)，缓慢均匀滴入小鼠双侧前鼻孔，随呼吸进入鼻腔。

每天激发1次，连续激发7 d。

对照组以等量生理盐水代替卵清蛋白溶液。

造模评估：采用症状行为学叠加量化计分法对模型进行评估[13]。

于末次鼻腔激发致敏后立即观察30 min，记录小鼠鼻分泌量、喷嚏次数及搔鼻情况，采用叠加量化计分法计分(表1)，总计分﹥5分为造模成功。

嗅觉功能评估：嗅觉障碍检查采用埋藏小球实验(buried food test，BFT)。

将食
物小球埋藏在垫料中，位置随机选择，深度为1～2 cm。

将受试小鼠放入实验场
所中，300 s(取5次测试平均值)内未找到食物小球的小鼠定为存在嗅觉功能障碍。

以此为标准将模型组小鼠分为AR伴嗅觉障碍组和AR不伴嗅觉障碍组，同时对对照组小鼠进行BFT测试，并与模型组结果进行对照。

组织取材：于建模成功后第3天，选取全部对照组小鼠及AR不伴嗅觉障碍组小鼠、AR伴嗅觉障碍组小鼠各9只，断髓处死，去除头部毛皮，暴露头颅标本。

进一步修剪头颅标本，保留鼻腔上部，包括鼻中隔、鼻腔外侧壁及筛板。

将标本浸于4%多聚甲醛溶液中约48 h，取出后浸入10% EDTA溶液中脱钙14 d，每天更换脱
钙液；14 d后，标本以自来水冲洗24 h，重新浸入4%多聚甲醛溶液固定约24 h。

药物干预实验
将1 ml复方倍他米松(得宝松)加生理盐水稀释成8 ml溶液备用。

将剩余的32只AR伴嗅觉障碍组小鼠随机分为不用药组10只、复方倍他米松干预1组及复方倍
他米松干预2组各11只。

药物干预组小鼠予腹腔注射100 μl(约3.5 mg/kg)复方倍他米松溶液1次，不用药组不给予药物干预。

于给药后第7天处死复方倍他米
松干预1组及不用药组小鼠，于给药后第14天处死复方倍他米松干预2组小鼠，同上法取材。

鼻黏膜组织形态学检测
HE染色：对照组、AR不伴嗅觉障碍组及AR伴嗅觉障碍组各随机选取3个标本，乙醇梯度脱水，常规石蜡包埋，4～5 μm连续切片。

每个标本随机选取切片做HE 染色。

免疫组化：对照组、AR不伴嗅觉障碍组及AR伴嗅觉障碍组各随机选取3个标本，每个标本随机选取切片。

于60℃烤片机上烘烤1～2 h，60℃二甲苯脱蜡10 min，室温二甲苯脱蜡7 min，100%、95%、80%、75%系列乙醇依次脱水2 min。

切片用蒸馏水洗3 min至玻片清洁透明，3%过氧化氢甲醇液室温浸泡10 min。

0.01 mol/L PBS漂洗切片3次，每次5 min。

加入一抗(1∶8000山羊抗人OMP
单克隆抗体)，4℃过夜，0.01 mol/L PBS漂洗5 min，3次。

加二抗，37℃湿盒
中孵育30～60 min，0.01 mol/L PBS漂洗5 min，3次。

DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。

光镜下观察。

每个标本各5张切片，在统一放大倍数(×400)下，用图像分析仪随机检测并计数5个高倍镜视野(×400)下全部OMP阳性细胞。

统计学处理
采用SPSS 11.0统计分析软件，各组数据比较应用配对t检验，数值以±s表示，P<0.05表示差异有统计学意义。

一般观察
鼻内滴液激发阶段后，模型组小鼠死亡5只，对照组小鼠死亡2只。

两组存活小鼠均毛色光泽，摄食饮水正常，反应灵敏，活动正常、活跃。

模型组小鼠较对照组小鼠鼻口部可见清亮分泌物，挠鼻动作增加。

两组小鼠体重均无明显变化，AR模型组小鼠体重(25.25±0.507)g，与对照组(25.34±0.593)g比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

造模评估结果
症状行为学叠加量化计分法观察结果显示，模型组小鼠频频用前爪搔抓鼻端两侧，并伴有发作性喷嚏动作，鼻分泌物流出量从鼻端两道湿痕至鼻口周围大量清亮液体不等(表2)；而对照组小鼠无明显症状。

AR模型组平均计分6.3分，对照组小鼠0分，两组比较差异有显著统计学意义(P<0.01)，表明本实验采用卵清蛋白致敏激发小鼠建立AR小鼠模型的方法成功。

嗅觉功能变化
埋藏小球实验结果显示，对照组8只小鼠均于300 s内找到埋藏的食物小球，平均时间(122±4)s。

而AR模型组小鼠中14只于300 s内找到食物小球，平均时间(161±7)s，为AR不伴嗅觉障碍组；其余41只均无法在300 s内寻找到埋藏的食物小球，为AR伴嗅觉障碍组，AR伴嗅觉障碍模型小鼠占全部模型组小鼠数量的
74.55%。

鼻黏膜组织形态学变化
HE染色：对照组小鼠嗅区黏膜由上皮层和固有层构成(图1)，嗅上皮可见ORN、支持细胞(supporting cells，SCs)和基底细胞(basal cells，BCs)。

ORNs细胞核
为类圆形、深蓝色，位于嗅上皮中部，呈多层排列，约7～8层；SCs细胞核为椭圆形、淡蓝色，位于嗅上皮近表层；BCs细胞核较小、扁圆形，位于嗅上皮底层，靠近基底膜；固有层中可见嗅神经和血管(图2)。

嗅黏膜上皮各层细胞排列整齐，极性明显(图3A)。

AR不伴嗅觉障碍组及伴嗅觉障碍组小鼠嗅黏膜上皮层变薄，ORNs层数减少、排列紊乱，两组形态学比较无明显差别，但与对照组比较有明显差别(图3A～C)。

免疫组化：对照组小鼠嗅黏膜OMP免疫阳性细胞为棕褐色，分布于上皮层和固有层，嗅黏膜表面纤毛也可见OMP阳性反应(图4，5A)，OMP染色阳性细胞数为66.38±1.517。

AR不伴嗅觉障碍组小鼠嗅黏膜上皮层变薄，染色变淡；OMP染色阳性细胞数为59.50±0.558，较对照组减少(图5B)，但与对照组比较差异无统计学意义
(P>0.05)。

AR伴嗅觉障碍组小鼠嗅黏膜上皮层变薄，染色变淡，OMP表达明显
减少，表面纤毛层无OMP棕黄色阳性反应(图5C)；OMP染色阳性细胞数为
39.77±2.012，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

不用药组小鼠嗅黏膜上皮层厚度有所增加，细胞排列仍较紊乱；OMP表达稍增多(图5D)，OMP染色阳性细胞数为47.34±1.809，与AR伴嗅觉障碍组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

复方倍他米松干预1组小鼠嗅黏膜上皮层厚度有所增加；OMP表达增多(图5E)，OMP染色阳性细胞数为62.04±1.227，与AR伴嗅觉障碍组比较差异有统计学意
义(P<0.05)，但与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

复方倍他米松干预2组小鼠嗅黏膜厚度有所增加；OMP表达增多(图5F)，OMP
染色阳性细胞数为63.82±1.254，与复方倍他米松干预1组比较差异无统计学意
义(P>0.05)。

AR是特应性个体接触致敏原后由IgE介导的介质(主要是组胺)释放、并有多种免
疫活性细胞和细胞因子等参与的鼻黏膜慢性炎症反应性疾病，主要临床表现有鼻塞、流鼻涕、鼻痒、打喷嚏及嗅觉功能障碍等。

AR在人群中发病率高，且发病率有逐年增加的趋势[14-15]，特别是其可损伤患者嗅觉引发嗅觉障碍[16-17]，因此是临床上引起嗅觉障碍的主要因素之一。

建立动物模型是研究AR发病机制及病理生理基础的手段。

造模原则是力求可靠、特异性地反映AR的临床特点和病理改变，具有良好的重复性，便于开展更深入的研究工作。

在建立AR动物模型实验中，常用的致敏原主要是甲苯二异氰酸酯(toluene diisocyanate, TDI)和卵清蛋白[18-19]。

TDI于1988年即被用于AR动物模型的建立[20]，但由于其对黏膜有刺激和炎性损伤作用，故未能广泛使用；而卵清蛋白的刺激性很小且致敏性较好，所以目前应用卵清蛋白造模较普遍[21-22]。

在建模动物选择上，小鼠性情温和、攻击性小、生长期短、繁殖力强，且小鼠淋巴系统发达，对外来刺激敏感，是研究变应性疾病的先天有利因素。

此外，小鼠基因图谱已经绘制完整，对小鼠免疫系统有了深入的了解，加上现代基因工程的应用，可以利用基因重组和基因敲除小鼠某种表达产物的改变研究其分子作用机制，因此本实验选择BALB/C小鼠作为建模动物。

制备小鼠AR模型的技巧主要是多次致敏和反复激发。

本实验利用卵清蛋白加佐剂Al(OH)3先使动物机体致敏，再滴鼻维
持致敏状态，方法简单，复制了临床体征和病程均与人AR近似的动物疾病模型，经症状行为学测试符合建模成功的标准。

该模型的复制为后续研究小鼠嗅上皮OMP的表达变化及研究GC对AR所致嗅觉障碍的干预作用提供了基础。

以实验动物行为学改变评估其嗅觉功能是目前广泛应用的实验方法。

埋藏小球实验是Edwards早在1972年研究小鼠嗅觉障碍行为时即已应用的嗅觉评估方法，此后该方法不断得到改进[23-24]。

进行埋藏小球实验所需实验装置花费低，操作比较容易，具有良好的可行性及可重复性。

本实验分组前对所有小鼠进行了埋藏小球实验预评估，所有小鼠均在300 s内找到食物小球，表明嗅觉行为学实验以300 s 为分组标准合理可行。

本实验检测结果显示，约74.55% AR小鼠表现出嗅觉功能障碍，证实嗅觉障碍是AR常见的症状。

AR引起嗅觉障碍的机制尚未完全明了。

既往认为嗅觉损失是传导性的，因气味分子到达鼻腔顶部嗅觉感受器的通道受阻，嗅上皮是完好的[25]。

近年来的研究则倾向于认为鼻腔阻塞程度与AR引起嗅觉障碍并无直接关联。

用肾上腺素鼻黏膜减充血剂，并不能使AR患者嗅功能恢复正常。

Cowart等[5]研究也表明即使鼻腔下部通道完全阻塞，也不足以导致明显的嗅敏感度降低。

提示与变态反应相关的某些机制所导致的嗅黏膜本身的组织病理学改变可能是AR引起嗅觉障碍的主要原因。

本实验显示，AR模型动物的嗅黏膜上皮层变薄，各层细胞排列不整齐，层数明显减少，极性消失，说明AR模型小鼠的嗅黏膜发生了明显的病理改变，其ORNs本身存在病理损伤。

在嗅觉相关研究中，OMP是近年来颇受关注的热点。

OMP是与嗅觉密切相关的一种蛋白质，其特异性地表达于成熟的ORNs。

ORNs是嗅黏膜内唯一的神经元，其功能是感受空气中的气味分子，将化学信号转化为电信号，向嗅球和嗅觉高级中枢传递嗅觉信息[26-28]。

本实验通过免疫组化方法，对嗅上皮中OMP表达进行定位、定性及定量分析。

结果显示，AR小鼠嗅黏膜OMP表达较对照组减低，其中伴有嗅觉障碍AR小鼠嗅黏膜的OMP表达水平显著低于对照组，进一步说明AR伴有嗅觉障碍小鼠的嗅黏膜发生了病理改变。

针对嗅觉障碍的治疗，目前尚无理想且规范的方法。

近来有报道采用短期系统性接
触多种特异气味的方法提高嗅觉敏感度[29]，以及使用磁力反复刺激大脑额叶皮质以提高嗅觉敏感度的尝试[30]。

这些新的努力在临床应用方面尚无确切效果。

目前对于嗅觉障碍的治疗，仍以应用GC作为临床一线选择。

GC治疗嗅觉障碍的相关报道很多，早在1956年Hotchkiss就报道了口服GC可以改善因鼻息肉所致的嗅觉障碍[31]。

1999年Fukazawa等[32]给102例不同病因嗅觉障碍患者鼻中隔黏膜局部注射醋酸地塞米松(dexamethasone, DXM)，结果63.7%的患者嗅觉有所改善。

倪道凤[11]及关静等[12]应用鼻内气动喷射雾化吸入布地奈德混悬液对不同病因的嗅觉障碍患者进行治疗，取得了较好的治疗效果。

同时，有研究认为GC联合银杏叶提取物可以得到更好的治疗效果[33-34]。

GC治疗嗅觉障碍的作用机制尚不完全清楚。

目前已知GC通过抑制炎性细胞因子的产生，诱导抗炎因子的合成而减轻嗅黏膜炎症反应，减轻其充血和肿胀，以增加空气中的气味分子与嗅区黏膜的接触面积，促进气味分子与ORNs结合，改善嗅觉。

此外，GC对嗅黏膜本身也发挥着直接的作用。

研究发现嗅黏膜中存在GC受体[35]，GC可直接诱导基底细胞增殖，产生新生的ORNs以取代老化失活的ORNs[36]。

同时，GC可以上调环核苷酸门控通道蛋白mRNA的表达水平，强化嗅觉信号转导过程中腺苷酸环化酶-环磷酸腺苷通路，促进嗅觉信号传导，从而提高嗅觉功能[37]。

本实验发现AR小鼠腹腔注射复方倍他米松7 d后，嗅黏膜OMP表达既显著高于用药前水平，也高于同期不用药小鼠，且与对照组小鼠OMP表达水平相当，表明全身应用GC可以增加嗅上皮中ORNs的数量。

使用GC 14 d的AR小鼠嗅黏膜OMP表达与用药7 d的结果相当，均与对照组OMP 表达无明显差异，提示全身应用GC对增加嗅上皮ORNs数量、改善嗅觉功能的作用可以持续较长时间。

全身应用GC是治疗AR引起嗅觉障碍的有效方法。

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