7第三章 色谱知识导论09 26

以上两张谱图 k，, α值完全相同，仅仅由于柱效高低不同使得它们具有不同的分离度。 直观的看，峰的尖锐程度代表了柱效高低，峰越尖锐，其柱效越高，通常使用理论塔板数（n）的大小衡 量柱效的高低。 色谱柱的总分离效能指标—分离度 R。
R
t R ( 2 ) t R (1) 1 (W1 W2 ) 2
Ci %
mi mi 100 100 m m1 m 2 m n Ai f i
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Ci %
A1 f 1 A2 f 2 An f n
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100
f i Ai 100% f’ i Ai
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归一化法优点：不必知道进样量；此法较准确，仪器及操作条件稍变对结果影响不大；比内标法方便， 特别是需分析多组分时；如 fi’相近或相同时，可简化为面积归一化法。 面积归一化法
分离度 R 越大，两组分的分离程度越高。R=1.0 时，分离效率达 98%。R<1.0 时两峰部分重叠。R=1.5 时，分离程度达 99.7%。
4
R>1.5 可以得到基线分离 分离度 R 反映的是相邻两个峰的分开程度 R 太小，两个峰无法彻底分离 R 太大，分离时间过长，工作效率低下 一般要求 R>1.5，也可遵循行业特殊规定 3.4 色谱的定性、定量分析 3.4.1 色谱定性分析 一般不能从色谱图中给出定性结果，而需要与已知物对照，或利用色谱文献数据或其它分析方法配合 才能给出定性结果。 ①利用已知物定性。 利用已知物定性包含 3 个方面：用保留时间或保留体积定性；利用峰高增加法定性；利用双柱或双系 统定性。 ②与其它分析仪器结合定性。 实现联机的条件有：样品池体积足够小，分析速度足够快，分析的灵敏度足够高，检测限低。 目前常见的色谱与其他分析仪器连接的技术主要有：色谱-质谱联用，色谱-红外光谱联用。 3.4.2 色谱定量分析 色谱定量分析是基于被测物质的量与峰面积成正比。在一定色谱条件下有 mi= fi’•Ai，其中 fi’是绝对质量校正因子，Ai 是峰面积。 定量要解决的问题有：峰面积的测量和计算；校正因子的测量与计算；色谱定量方法及其应用。 ①校正归一化法
从柱头向柱尾连续冲洗 柱色谱
从一端向另一端扩 散 薄层色谱
按分离过程的物理化学原理分： 名称 原理 吸附色谱 利用吸附剂对不同 分配色谱 利用固定液对不同
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离子交换色谱 利用离子交换剂对
凝胶色谱 利用凝胶对不同组
组分吸附性能的差 别 平衡常数 流动相为液体 流动相为气体 吸附系数 KA 液固吸附色谱 气固吸附色谱
Ci %
Ai 100% Ai
②内标法 将一定量的纯物质作为内标物，加入到准‘ ms f s As
③外标法（标准曲线法） 用于常规分析
’
m f Ai m s 1 A m C i % i 100 i ’ 100 i s f‘i , s 100 m m As m f s As
1
（或分配）作用的差别，被分离的各组分在固定相中的滞留时间不同，使不同的组分按一定的先后顺序从 固定相中被流动相洗脱出来，从而实现不同组分的分离，再进行定性定量分析。色谱分析操作时，不会损 失混合物中的各个组分，不改变原有组分的存在形态，也不会生成新物质。
3.1.3 色谱法的分类 按两相的状态可分为： 流动相 固定相 名称 总称 按固定相的性质可分为： 固定相性质 固定相形式 柱 填充柱 在管内填充固体吸 附剂 操作方式 名称 开口管柱 吸附在内壁的毛细 管 纸 具有多孔和强渗透 能力的滤纸或纤维 素薄膜 从滤纸中央向四周 扩散 纸色谱 薄层板 玻璃板 固体 液固色谱 液相色谱 液体 液体 液液色谱 固体 气固色谱 气相色谱 气体 液体 气液色谱
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③保留比 Rs 与分配比 k 的关系 组分在柱内的平均线速率 uL 与相同条件下流动相在该柱内的平均线速率的比值为保留比。 Rs=uL/u， 而 uL=柱长/tR=L/tR ，u=柱长/tm=L/tm 故 Rs= tm /tR 用组分在流动相中的质量分配比例系数表示时，保留比 Rs 为 Rs= （组分在柱内流动相中的总质量） / （组分在柱内流动相和固定相中的总质量） = mm/( mm+ ms)=1/(1+k) 可得出：tR= tm •（1+k） ④分配比 k，分配系数 K 与选择因子α的关系： α= tR2’/ tR1’= VR2’/ VR1’= k2/ k1= K2/ K1 3.3.2 色谱柱的总分离性能
通过实验，茨维特成功的分离了树叶的石油醚萃取液中的各种色素，得到了不同因素的谱带。所得的 谱带中最下面的色谱带呈黄色，经分析为胡萝卜素。随后是另一黄色的叶黄素谱带，上面两层是呈棕色和 黄绿色的叶绿素 a 、叶绿素 b 谱带。由于不同色谱带有不同的颜色，故此分离方法称为色谱法色层法 （chromatography） 。虽然后来色谱的发展不限于分离有色物质，更多用于无色物质的分离及测定，由于习 惯，现在仍沿用色谱这个名称。 在茨维特经典实验里，溶于流动相(石油醚)中的样品(植物色素)各组分经过固定相 (CaCO3)时，其与 固定相发生吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和等相互作用，且其作用的大小、强弱不同，导致在固定相 中滞留的时间也不同，从而先后从固定相中流出，实现了不同组分的分离。当分离后的组分由流动相携带 进入检测器时，就得到了一个一个的色谱峰。 茨维特经典色谱分离速度慢，分离效率低，一直没有引起足够的重视。1941 年 Martin 和 Synge 把氨 基酸的混合液注入到以硅胶做固定相的柱中，用氯仿做流动相，将各个氨基酸的组分分开，这才引起了化 学家的重视。1944 年 Martin 和 Synge 用滤纸代替硅胶，不用色谱柱，固定相是滤纸中含有水分的纤维素， 流动相用有机溶剂，也成功的分离了氨基酸，从而建立了纸色谱法(paper chromatography)。1952 年，Martin 等又提出了给挥发性化合物的分离测定带来划时代变革的气相色谱法(gas chromatography)，因而获得了当 年 的 诺 贝 尔 化 学 奖 。 20 世 纪 50 年 年 代 又 出 现 了 将 固 定 相 涂 在 玻 璃 板 上 的 薄 层 色 谱 法 （ thin-layer chromatography） 。现在，高效液相色谱及计算机技术的发展，使现代色谱进入了一个迅速发展的新时代智能色谱 （chromatography with artifical intelligence） 。 是色谱法在现代分离分析技术中占用极其重要的地位。 3.1.2 色谱的定义 由茨维特经典实验可知：色谱法是一种物理的分离方法。其利用固定相与被分离的各组分产生的吸附
‘
④单点校正 当被测试样中各组分的浓度变化范围不大时而用单点校正法。即配制一个与被测组分含量十分接近的 标准溶液，定量进样，计算被测物的含量。
Ci %
Ai C s 100% As
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组分分配性能的差 别 分配系数 KP 液液分配色谱 气液分配色谱
不同离子亲和能力 的差别 选择性系数 KS 液相离子交换色谱
分分子的阻滞作用 的差别 渗透系数 KPF 液相凝胶色谱
3.2 色谱图及相关术语 3.2.1 色谱图 色谱图是指色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或流动相流出体积的曲线图。 3.2.2 色谱相关术语 ①基线：在实验操作条件下，只有纯流动相通过检测器时记录下的信号-时间曲线，它反应了仪器噪声随 时间的变化。稳定的基线应是一直线，若是斜线则称为基线漂移，如基线上下波动则称为噪声。 ②色谱峰 色谱图中曲线突起的部分称为色谱峰，每个色谱峰代表样品中的一种组分，理想的色谱峰应为对称的正态 分布曲线。 ③峰高和峰面积 峰高 h：峰顶到基线的距离。 峰面积 A：组分流出曲线与基线间所包围的面积。 ④峰拐点：二阶导数为零的点。 ⑤峰宽和半峰宽 峰宽 Wb：两侧拐点处所做的切线与峰底相交两点之间的距离。 半峰宽：在峰高为 h/2 处的峰宽。 ⑥保留值 死时间 tm：是不被固定相滞留组分（即惰性组分）从进样制出现浓度极大点时的时间，也是流动相流过色 谱系统所需的时间。 死体积 Vm：对应于死时间所需的流动相体积。Vm=tm•Fco Fco—流动相体积流速（ml•min-1） 保留时间 tR：组分从进样到出现色谱峰顶点时所需的时间。 保留体积 VR：对应于保留时间所消耗的流动相体积。VR=tR•Fco 调整保留时间 tR’：tR’=tR-tm 调整保留体积 VR’：VR’=VR-Vm= tR•Fco-tm•Fco=（tR –tm）•Fco= tR’•Fco 相对保留值 r21：r21= tR2’/ tR1’= VR2’/ VR1’。相对保留值越大，选择性越好，越易分开。 选择因子α：选择前一个峰的调整保留值 tRs’为基准，求其它后出峰组分 i 对基准峰的香桂保留值。 α= tRi’/ tRs’= VRi’/ VRs’ 3.3 色谱分析的基本理论 3.3.1 分配平衡 ①分配系数 K 在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间的分配达平衡时的浓度之比。 K=（溶质在固定相的浓度）/（溶质在流动相的浓度）=Cs/Cm ②分配比 k 在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间的分配达平衡时的质量之比。 k=（溶质在固定相的质量）/（溶质在流动相的质量）= ms/mm =（ Cs••••Vs）/ （Cm•Vm）=K•Vs/Vm= K / β β= Vm / Vs 称为相率比，是柱型特点参数。
第三章 色谱知识导论
色谱分析是从分离技术发展而成为分离-分析技术的一门综合性学科， 是一种物理化学的分析方法。 它 是将待分析的混合各组分在两相中进行分离，然后顺序检测各组分含量的方法。 3.1 色谱分析的历史、定义及分类 3.1.1 历史 1906 年，俄国植物学家茨维特（M. Tswett）首先提出了色谱法，茨维特经典实验如下：