EPO受体介导白血病细胞系KOCL233细胞增殖信号转导

EPO受体介导白血病细胞系K OCL233细胞增殖信号转导
樊　华 杉田完尔1 翟　明 中泽真平1
(中国医科大学第一临床学院血液科 沈阳　110001)
摘要 检测白血病细胞系KOCL233EPO受体(EPOR)的表达并阐明EPOR介导的增殖信号的转导途径。

用生物素酰基化EPO和流式细胞仪检测EPOR的表达,用免疫沉淀法和Western印迹法检测EPOR,SHC和PLC2γ的酪氨酸磷酸化。

结果发现KOCL233细胞可有EPOR的表达,且EPO可引起其增殖。

EPO刺激后1分钟,EPOR形成同源二聚体,出现酪氨酸磷酸化;EPO刺激后1分钟,SHC和PLC2γ出现免疫共沉淀和酪氨酸磷酸化增强。

上述结果说明在EPOR介导的KOCL233细胞增殖信号的传导中,EPOR形成同源二聚体、出现酪氨酸磷酸化,且SHC和PLC2γ两者结合在一起协同发挥作用的。

关键词 红细胞生成素受体 KOCL233白血病细胞系 SHC PLC2γ 酪氨酸磷酸化 细胞增殖信号转导
中国图书资料分类法分类号 R733.7 R973
红细胞生成素(EPO)是分子量为35-40kD的糖蛋白,为调节红细胞产生的最重要的细胞因子。

EPO通过幼红细胞表面的红细胞生成素受体(EPOR)来促进红系的增殖和分化。

EPOR的结构现已明确,为无酪氨酸激酶活性的细胞因子受体超家族的一员[1]。

在EPOR介导下,一系列信号传递蛋白被磷酸化,将信息传导到细胞核。

我们选择了对EPO刺激有显著扩增的来源于急性淋巴细胞白血病的细胞系KOCL233进行了有关信号传导蛋白的酪氨酸磷酸化的检测,探讨了含SH
2的转化蛋白(SH
22containing transforming protein,SHC)和磷脂酶C2γ(phospholipase C2γ,PLC2γ)在信号传导中的作用。

材料与方法
材料
白血病细胞系　KOCL233为日本山梨医科大学小儿科从婴儿急性淋巴细胞白血病建立的细胞系,核型为t(11;19)。

主要仪器与试剂　CO
2孵箱,流式细胞仪,96微孔培养板,液体闪烁计数仪,Mini电泳装置,低温高速离心机,EPO(中外制药株式会社),N2 hydroxysuccinimidobiotin(Sigma),PE2Avidin (Biomeda),蛋白A琼脂糖珠匀浆(Pierce),增强的化学发光(ECL)试剂(Amersham L IFE SCIENCE)。

表1为实验所用抗体。

方法
荧光染色法　用此方法将荧光物质结合到细胞系上,再用流式细胞仪检测EPOR的表达。

此方法为:①按照参考文献[1]制备生物素酰基化EPO。

②将制备好的生物素酰基化EPO20U与5×105 KOCL233细胞4℃孵育60分钟,冷PBS洗3次。

③加2μl PE2Avidin于4℃孵育30分钟,再用冷PBS洗2次。

④用流式细胞仪通过细胞表面的荧光强度检测EPOR的阳性率,每个样本收集10000个细胞进行分析。

⑤生物素和未生物素酰基化EPO对KOCL233细胞EPOR表达的竞争抑制试验:先将未生物素酰基化EPO与KOCL233细胞孵育15分钟,然后再加生物素酰基化EPO2U,其余同前。

⑥结果判定:K562细胞系作为阳性对照细胞系。

KOCL233细胞系分装二管,其中一管为实验管,另一管为不加生物素酰基化EPO作为阴性对照。

<10%为阴性。

3H2TdR掺入法　此法用来检测KOCL233细胞对EPO刺激的增殖反应。

此方法为:①无菌操作下接种细胞系到96微孔培养板的孔中,细胞数1×105Π孔。

每份标本均作3个复孔,同时设对照3孔。

　1山梨医科大学小儿科 日本
　2000-03-30收稿;2000-10-27接受
T able1　The antibodies used in experiments
Antibody M.W.
(kD)Isotype of
antibody
Supplier
Anti2EPOR55Mouse IgG2a TL Anti2PTyr Mouse IgG2bk UBI Anti2SHC66Π52Π46Rabbit IgG TL Anti2PLC2γ148Mouse IgG1TL
Conjugated peroxidase MouseΠRabbit IgG
　(H+L)
MBL
对照组只加10%FCS RPM I1640培养液。

实验组分别加EPO2.5,5和10UΠml。

②培养72小时后,加3H2TdR(1μCiΠ孔),继续培养6小时。

③然后用多头细胞收集仪将细胞收集到玻璃纤维滤器中,用液体闪烁计数仪测定3H2TdR掺入量,也即放射活性,以cpm值表示结果。

④对照组:阳性对照为K562细胞系。

Western印迹法　此方法:①无菌操作下,取培养中的KOCL233细胞,用D2M EMΠF212洗3次,再将其重新悬浮于D2M EMΠF212中,此时将细胞数调整为4×106Πml。

②重新放入CO2孵箱中,使细胞系饥饿2小时。

③再取出细胞,分装于6支试管中,每支试管中含有细胞悬液500μl,细胞数为2×106。

④于37℃水浴槽中,对照不加EPO,另5管于1,5,15,30和60分钟分别加EPO500μl(5U)。

按上述时间中止反应(中止反应液为:PBS含10 mmolΠL NaF,1mmolΠL NaV)。

⑤4℃,2500×g 离心1分钟后去掉上清。

⑥每支试管中加20μl的细胞裂解液〔50mmolΠL Tris2HCl,p H8.0,含1% Nonidet P240,150mmolΠL NaCl,0.05%NaN3,5 mmolΠL ED TA,1mmolΠL苯甲基磺酰氟(PMSF), 0.2TIUΠml抑蛋白酶肽(aprotinin),1μgΠml胃蛋白酶抑制剂(pepstatin A),10mmolΠL碘乙酰胺〕,冰上放置30分钟后,4℃,25000×g离心15分钟后,上清移到新的试管中。

⑦加10μl凝胶加样缓冲液,混匀后100℃,5分钟,然后离心,取上清20μl 进行SDS2PA GE及转移电泳。

⑧取下转移膜浸入5%脱脂乳中(稀释液为Tris缓冲盐溶液),封闭2小时以上。

用细胞裂解液洗3次,弃掉上清。

⑨将转移膜用Tris缓冲盐溶液洗3次,每次10分钟。

⑩将一抗用5%脱脂乳稀释到1μgΠml,将膜与之于室温下孵育过夜。

λϖTris缓冲盐溶液充分洗膜4次,每次10分钟。

λω再与辣根过氧化物酶标记的抗鼠或抗兔二抗孵育1小时,用增强的化学发光法显像于Hyperflim胶片上。

免疫沉淀法(Immunoprecipitation,IP)　此方法:①-⑥步骤同Western印迹法的①-⑥,其中每支试管中的KOCL233细胞数为5×106,细胞裂解液为每支试管100μl。

⑦按需要分别加入抗信号传导蛋白的抗体(按说明书稀释1∶1000-1∶2500),4℃平缓摇动过夜。

⑧然后加蛋白A琼脂糖珠匀浆40μl,也于4℃平缓摇动过夜。

⑨同Western印迹法的⑦-
λω,其中每支试管中加25μl 凝胶加样缓冲液,按需要更换一抗。

抗体的去除和再标记　此方法是为了证实免疫沉淀是否成功和各加样蛋白质是否均等。

因此,需将硝酸纤维素膜上的一、二抗去除,再重新标记相应的抗体。

统计学分析
3H2TdR掺入量的样本均数差异的显著性检验用配对t检验。

结 果
EPOR的表达和生物素及未生物素酰基化EPO 对K OC L233细胞EPOR表达的竞争抑制试验KOCL233细胞EPOR的阳性率为82%; KOCL233细胞的EPOR表达随着未生物素酰基化EPO浓度的增加而减少。

当EPO为2U时,EPOR 阳性率为89%,EPO增至80U时,EPOR阳性率被抑制到8%,其中生物素化酰基化EPO为2U。

不同EPO浓度下培养K OC L233细胞不同时间的3H2TdR掺入量
表2可见KOCL233细胞最大刺激反应为EPO 5UΠml孵育72小时后,3H2TdR最大掺入量与对照组相比有显著意义,P值为0.0044。

T able2　Incorporation of3H2TdR into K OC L233cells after 72hours incub ation with various concentrations of EPO
EPO(UΠml)3H2TdR uptake(cpm)P value
0 52873±4338
2.557426±45560.1617
585306±19570.0044
1079191±9790.0106
Western印迹法(图1)
一抗为抗PTyr,可见分子量46-210kD间出
现若干蛋白带。

EPO 刺激后1分钟即出现酪氨酸磷酸化或酪氨酸磷酸化增强。

为了证实是何种蛋白,又进行了下列检测。

Figure 1　Changes of tyrosine phosphorylation level in K OC L 233cells stimulated with EPO(5U )for various periods
免疫沉淀法
用抗PTyr 免疫沉淀后,再行Western 印迹法,一抗为抗EPOR 。

图2可见EPO 刺激后1分钟于
110kD 处见一明显的蛋白带发生酪氨酸磷酸化,5
分钟脱磷酸。

图3A 是抗SHC 免疫沉淀后,再行Western 印迹法,一抗为抗PTyr 。

可见SHC 在EPO 刺激后酪
Figure 2　Changes of tyrosine phosphorylation level of EPOR in K OC L 233cells stimulated with EPO (5U)for vorious
periods
Figure 3　Changes of tyrosine phosphorylation level of SH C and PLC 2
γin K OC L 233cells stimulated with EPO(5U)for varions periods
氨酸磷酸化增强,并且出现与SHC共沉的分子量在111-210kD的蛋白带。

为了证实何种信号蛋白与SHC共沉淀,将图3A膜上的抗体去除后,再分别用抗2SHC(图3B)与抗PLC2γ(图3C)重新标记,结果证实图3A中免疫沉淀下来的蛋白质为SHC和PLC2γ。

讨 论
关于EPOR是否存在于非红系细胞中,许多学者进行了大量的研究,发现在血管内皮细胞[2]、神经细胞[3]、B淋巴细胞[4]都存在EPOR的表达。

我们检测了来源于急性淋巴细胞白血病的细胞系KOCL233,结果发现EPOR的阳性率为82%。

为了排除非特异荧光所致假阳性的可能性,除设置了阳性对照和阴性对照外,我们又进一步地对KOCL233细胞进行了非生物素酰基化EPO的竞争抑制试验。

结果可见生物素酰基化和非生物素酰基化EPO二者间存在着竞争抑制作用,可以排除非特异性荧光所致的假阳性。

由上可知EPOR也存在于非红系细胞白血病细胞系中,为了探讨EPOR存在的意义,有必要进一步明确其功能。

从我们的实验结果可知KOCL233细胞能被EPO刺激而增殖,这提示表达的是功能性的EPOR。

关于EPO通过EPOR是如何调节红系细胞的增殖,1990年Y oshimura等[5]的研究结果证实,当EPO与EPOR结合时,受体形成同源二聚体。

图2可见KOCL233细胞在EPO刺激后1分钟,于110 kD处有一明显的蛋白带发生酪氨酸磷酸化。

鉴于EPOR可以互相聚合,而凝胶加样缓冲液短时间煮沸的处理,有时并不能使聚合体解聚,并且本实验所用抗EPOR抗体的分子量为55kD,推测此蛋白带为EPOR的同源二聚体。

EPOR介导的信号传导系统中,JA KΠSTA T途径起着重要作用[6,7]。

除JA KΠSTA T途径外,EPOR 也像酪氨酸激酶型受体一样,能活化RasΠMAP途径。

有报道在幼红细胞中磷酸化的SHC是与Grb22SOS1结合而活化RasΠMAP激酶途径[5]。

1994年Ren等[7]利用从巨核细胞白血病骨髓细胞建立的只依赖EPO增殖的细胞系U T27EPO,添加EPO后发现PLC2γ1被酪氨酸磷酸化,由此活化肌醇磷脂系途径。

耐人寻味的是本实验发现了SHC和PLC2γ的免疫共沉淀,且EPO刺激后都出现了磷酸化增强,这强烈提示在增殖信号传导过程中两者是结合在一起协同发挥作用的。

关于SHC和PLC2γ是通过那种信号传递途径将信号向下传导,这尚需要进一步的实验来证实。

总之,我们的实验提示白血病细胞系KOCL233在EPO刺激后EPOR形成同源二聚体,发生酪氨酸磷酸化。

在增殖信号传导中,SHC和PLC2γ两者结合在一起并协同发挥作用。

参考文献
1Shimoda K,Okamura S,Harada N,et al.Granulocyte colony2stimulating factor receptors on human acute leukemia:biphenotypic leukemic cells possess granulocyte colony2stimulating factor receptors.Cancer Res,1992;52: 3052-3055
2Anagnostou A,Lee ES,K essimian N,et al.
Erythropoietin has a mitogenic and positive chemotactic effect on endothelial cells.Proc Natl Acad Sci USA,1990;
87:5978-5982
3J uul SE,Anderson D K,Li Y,et al.Erythropoietin and erythropoietin receptor in the developirg human central nervous system.Pediatr Res,1998;43:40-49
4K imata H,Y oshida A,Ishioka C,et al.Human recombinant erythropoietin directly stimulates B cell immunoglobin production and proliferation in serum free medium.Clin Exp Immunol,1991;85:151-156
5Y oshimura A,Longmore G,Lodish HF,et al.Point mutation in the exoplasmic domain of the erythropoietin receptor resulting in hormone2independent activation and tumourigenicity.Nature,1990;348:647-649
6Y oshimura A,Lodish HF.In vit ro phosphorylation of the erythropoietin receptor and an associated protein,p130.
Mol Cell Biol,1992;12:706-715
7Ren HY,K omatsu N,Shimizu R,et al.Erythropoietin induces tyrosine phosphorylation and activation of phospholipase Cγ1in a human erythropoietin2dependent cell line.J Biol Chem,1994;269:19633-19638
Erythropoietin R eceptor2Mediated Proliferative Signal T ransduction
in Leukemic Cell Line K OCL233
FAN Hua SU GITA Kanji1 ZHA I Ming NA KAZAWA Chinhei1 (Depart ment of Hem atology,The First Clinical College,China Medical U niversity S henyang　110001)
Abstract
In order to investigate the expression of erythropoietin receptor(EPOR)in leukemic cell line and clarify the mechanism of proliferative signal transduction mediated by EPOR in the leukemic cell line KOCL233, biotinylated EPO and flow cytometry were used for detection of EPOR expression,3H2TdR incoporation for cell proliferation,immunoprecipitation and Western blot analysis were used to investigate the tyrosine phosphorylation of signal transduction proteins as the causation of enhanced proliferation of KOCL233cells. There was EPOR expression and the cell proliferation could be stimulated by EPO in KOCL233cells. Dimerization and tyrosine phosphorylation of EPOR were found after1minute incubated with EPO. Coimmunoprecipitation of SHC and PLC2γand enhanced tyrosine phosphorylation following to the stimulation of EPO were found.Our results suggest that dimerization of EPOR and tyrosine phosphorylation were appeared under the stimulation of EPO,and SHC and PLC2γplay a cooperative effect in EPOR mediated signal tranduction.
K ey w ords erythropoietin receptor KOCL233leukemic cell line SHC PLC2γ tyrosine phosphorylation cell proliferative signal transduction
　1Department of Pediatrics,Y amanashi Medical University Japan
脐带血移植的临床应用学习班
中山医科大学孙逸仙纪念医院将主办脐带血移植的临床应用学习班。

该学习班是卫生部授予的国家级继续医学教育项目,项目编号为2001206201010,记学分11.5分,时间是2001年11月14-20日,学费800元,招生对象为内、儿科高年住院医师、主治医师及以上从事或准备开展临床造血干细胞移植的工作者或实验室工作人员。

教学内容包括脐带血移植的回顾和展望、脐带血的生物学特性、脐带血扩增、脐带血库、脐带血HLA配型、移植合并症的防治、我国脐带血移植现状、香港脐带血移植经验、成人脐带血移植、脐带血移植护理和成份输血等,学习班还安排录像和现场移植观摩,有意参加者请于2001年9月底前来信或来电,以获取更详细的通知。

承办单位及地址:中山医科大学孙逸仙纪念医院儿科,广州市沿江西路107号,邮编:510120。

联系人:徐宏贵,方建培。

联系电话:(020)81332003或81332045。

E2mail:zhe meng@。