转基因作物安全性的解决方法研究进展

转基因作物安全性的解决方法研究进展
作者：王艳辉张晓东《生物技术通报》2009，（8）. 50-55 转基因植物自从1983年首次成功后，至今已有35科120多种植物转基因获得成功。

1986年首批转基因植物被批准进入田间试验，至今国际上已有30个国家批准数千例转基因植物进入田间试验，转基因农作物的产业化，带来巨大的经济效益和社会效益。

许多转基因作物如大豆、西红柿、抗虫棉等早已在大田生产，并走进了千家万户的日常生活。

根据农业生物技术应用国际服务组织(ISAAA)发布的年度报告，2006年全球转基因作物种植面积猛增1200万hm2，首次突破1亿hm2大关。

1996～2006年10年间，转基因作物种植面积增长了60倍。

2007年全球转基因作物种植面积达到1.143亿hm2，较2006年增长了12%。

全球有50多个国家或地区开展了转基因作物种植试验，其中美国、阿根廷、巴西、加拿大、印度和中国的转基因作物种植面积占全球种植总面积的95%。

转基因技术之所以发展这么迅猛，主要是因为这项技术可提高作物产量，改善品质，减少除草剂、杀虫剂等农药使用量，节省大量劳动力，在解决全球不断增长的粮食需求和保障农业的可持续发展等方面发挥了重要作用，而且在缓解世界能源危机问题也将作出巨大贡献。

目前，全球转基因作物种类主要有抗除草剂转基因作物、抗虫转基因作物和抗病转基因作物等。

然而，转基因技术是把“双刃剑”，在享受它带来的的科学发展、经济效益和社会效益的同时，社会公众也日益关注转基因作物及其产品对生态环境和人类健康造成的的安全性问题。

转基因作物的外源基因可能会通过花粉和种子等途径在种群之间扩散，产生“超级杂草”，从而对生态环境和生物多样性造成危害。

而且，关于转基因作物和以转基因作物为原料制造的转基因食品对人体的影响一直争论不休，在世界一些国家和地区，如欧洲和日本等地，对转基因产品抵触的人数比例较大，2006年在欧洲调查的人群中有58%的人认为转基因食品“不应该被鼓励”。

人们对转基因植物安全性问题的争论和担忧严重地影响转基因植物的商业化推广和应用。

除非解决了人们对转基因植物和转基因食品的恐惧和担忧问题，否则公众对应用新型生物技术的抵触，将会严重阻碍农业生物工程的进一步发展。

1 转基因作物潜在的主要安全性问题
在转基因植物中，导入植物体内的外源基因通常包括两类：一是标记基因，它能赋予转基因植株抗抗生素或抗除草剂等特性，在转基因过程中的使用大大提高了转基因植物筛选的效率。

二是目的基因，它是用来优化或赋予植物特定性状的基因。

转基因作物引发的安全性问题也主要来自这两方面。

1.1 选择标记基因带来的安全性问题
为了将转基因细胞和非转基因细胞分开，在构建质粒载体时，人们常常把一类对抗生素类或除草剂类具有抗性的基因作为选择标记基因引入TDNA，与目的基因一同转化到植物细胞。

在组织培养过程中，培养基中加入抗生素或除草剂后，转化细胞可以正常生长，而非转化细胞在抗生素或者除草剂的作用下死亡，从而获得阳性转化细胞，进而分化、再生获得转基因植株。

但遗憾的是，转基因一旦成功后，选择标记基因便不再发挥作用，反而变成了潜在的危险。

选择标记基因引起的最大的争议就是转基因逃逸问题，即导入植物的标记基因与其野生近缘种等非目标生物间的基因流动。

具有除草剂抗性的转基因作物的花粉可能会飘落到杂草或近缘野生品种上，使这些杂草和野生品种具有除草剂抗性，经过多次转移后可能成为“超级杂草”，从而破坏整个生态系统。

自20世纪90年代以来，已经有多例试验证实外源基因可以通过花粉逃逸到非转基因的对照植株中。

这些问题一旦发生，会引发严重的生态灾难。

另外，人们还担心抗生素类选择标记基因会影响抗生素类药物的治疗效果。

l.2 目的基因带来的安全性问题
无论是抗除草剂转基因作物和抗病虫害转基因作物，目的基因的引入都会带来安全隐患，对生态环境造成严重破坏。

抗除草剂基因的逃逸会产生超级杂草，抗虫基因的引入会使昆虫对该类转基因作物产生抗性。

沈法富等研究表明，转基因棉花Bt基因流在陆地棉品种间以及陆地棉和海岛棉间发生了转移。

一些抗病毒基因逃逸到其他土壤微生物也可能产生新的致病性病毒。

而且由于导入外源目的基因，转基因作物已经突破了传统的界、门概念，具有普通物种不具备的优势特征。

作为外来品种进入自然生态系统，往往具有较强的“选择优势”，可能会影响植物基因库的遗传结构，导致野生等位基因的丢失而淘汰原来栖息地上的物种和其它遗传资源，乃至影响农业生态系统中有益天敌生物的种类和种群数量，使生物多样性丧失。

这些隐患的存在使人们更加关注转基因作物的安全性问题。

2 解决转基因作物安全性问题的方案
为了消除潜在的基因扩散可能引起的生态危害和转基因食品安全性问题，同时也为提高人们对转基因植物的认同和接受，国内外学者做了大量有益的探索工作，并出现了一些成功的先例。

2.1 从选择标记基因出发
从理论上讲，提高转基因植物中标记基因的安全性有3种方法：一是转化时使用抗性标记基因，转基因成功后将该基因彻底剔除；二是使用安全的选择标记基因；三是完全不使用选择标记基因。

2.1.1 抗性标记基因的剔除技术
在转基因过程中，筛选后仍保留在转基因植物体内的抗性标记基因不仅影响了二次转化，而且带来了许多潜在的危害，加剧了人们对转基因植物安全性的焦虑。

为此，近年来已发展了共转化法、位点特异重组系统、转座子和同源重组系统等剔除标记基因的方法。

共转化法是将选择标记基因和目的基因分别构建在不同的载体或同一载体的不同位点上，一起转化受体细胞，通过筛选和分子鉴定获得二者共整合的转基因植株，其中一部分转化植株中标记基因和目的基因是不连锁的，以此为研究对象再经后代的有性分离获得仅含目的基因的转基因植株。

Komari等用超级双元质粒载体获得了无选择标记的转基因水稻植株。

沈革志等。

用混合菌液转化愈伤，分离得到只含目的基因的转基因株系。

尽管通过农杆菌介导法共转化以及后代的有性分离可以获得无标记基因的植株，但是由于该方法必须经过有性世代，其使用还是受到了一定的限制。

因此，它不仅费时，而且无法适用于无性繁殖的品种。

位点特异性重组系统是指通过重组酶作用于两个特定DNA序列实现重组。

该系统由重组酶及其识别位点组成，当两个识别位点正向排列时，重组酶可专一性地催化切除两个识别位点之间的序列。

在剔除标记基因技术中常用的是由Steinberg等在大肠杆菌噬菌体p1中发现的Cre/loxP重组系统。

由于Cre/loxP重组系统必须通过二次转化和有性杂交将cre基因导入到转化loxp结构的植株中剔除选择标记基因，使得选育过程复杂且周期较长。

为此，有研究者采用诱导型表达载体的策略。

在该策略中，cre基因的表达受诱导型启动子的严格调控，当标记基因完成筛选任务不再需要时，通过一定的化学或生理条件诱导cre基因的表达，从而只需一次转化就能高效地剔除标记基因获得仅含目的基因的转基因植株。

Joachim等用化学诱导型的载体转化愈伤，获得了无标记转基因植株。

Zhang等用热击蛋白启动子也获得了成功。

2003年，Mlynarova等还报导将Cre/loxp诱导删除和二次转化相结合组成一个新的删除系统，大大提高了删除效率。

诱导删除系统适用于无性繁殖，但其空间上的不平衡性限制了它在无选择标记转基因植物中的的应用。

通过诱导控制Cre重组酶表达的方式，不能对转基因植株中cre基因的表达部位和表达水平进行调控。

一般来说，植株的花粉、果实和种子等部位仍然有外源基因的存在，花粉传播造成的基因漂移和食用安全性的担忧仍然存在。

如果将Cre酶置于组织特异性启动子的调
控之下，就可以对cre基因进行时空特异性调控，定位删除标记基因。

Li等利用胚芽特异性启动子appl实现了在大豆胚芽中定位删除选择标记基因hyg。

Bai等用花特异性启动子OsMAD45成功获得了无标记转基因水稻。

Luo等利用热击启动子HSPl8.2控制的FLP识别位点和CaMV35S控制的选择标记基因ipt及gusA，构建了一种自动删除系统，获得了无标记的转基因烟草。

转座子系统普遍存在于植物界，而且通常一种植物转座子系统在异源植物中也能自由转座。

当前应用较多的仍是最早发现的玉米Ac/Ds转座子系统，在此体系中，Ac能够自发转座，而Ds则只有当Ac存在时，才能够转座。

利用这些特性，可将目的基因置于Ds之间或者将标记基因插于Ac中间，转基因完成后，目的基因和标记基因将随着转座作用而发生分离，从而获得无标记基因的转基因植物。

2003年金维正等将含有目的基因bar的Ds元件和hpt标记基因置于同一个T-DNA中，通过农杆菌EHA105介导将Ac-T-DNA及Ds-T-DNA 分别转入到不同的水稻植株，再将单拷贝的Ac-T-DNA植株与单拷贝的Ds-T-DNA植株杂交得到同时含有Ac和Ds元件的F1植株，F1自交产生F2后代，F2植株中转座后的Ds元件与T-DNA独立分离，在总共100株水稻植株中筛选得到2株只含有Ds元件插入而无hpt 标记基因的转基因水稻植株。

同源重组法是在没有重组酶活性的情况下，将标记基因置于重复序列之间，通过两个重复序列发生重组作用，从而将标记基因切除。

Zubko等利用attp同源序列介导的染色体内同源重组，剔除了选择标记基因，得到了无标记基因的转基因烟草植株。

其机理与位点特异性重组相同，但也有其自身的特点：它不需要辅助蛋白参与，因而不会对植物基因组造成可能的伤害，也省去了遗传分离的环节。

但是其重组频率抵，也限制了它的广泛应用。

另外，多元自主转化(multi-auto-transformation，MAT)载体系统和选择标记基因的组织特异性表达也在不同的作物上进行试验并得到了初步进展，但由于其效率低，还未得到广泛应用。

2.1.2 使用安全的抗性标记基因
与传统的抗性标记基因不同，安全标记基因无抗生素或除草剂等抗性，因此，它对生态环境和生物健康来说是安全的。

利用这些安全标记基因可使转化的细胞正常生长，非转化细胞的生长发育则受到抑制，从而有效地筛选出转化细胞和植株。

该系统的原理与使用抗性标记基因相同，即非转化细胞被杀死而转化细胞由于获得代谢或发育优势存活下来。

安全标记基因由于大多数来自植物本身，因而不必担心由于“基因逃逸”而产生的“超级杂草”的产生和临床抗生素失效，不会破坏生态平衡，从而避免了转基因引起的安全争议。

目前这类选择标记基因主要有6-磷酸甘露糖异构酶(6-pmi)基因、木糖异构酶(xyl-A)基因、绿色荧光蛋白(GFPs)基因、葡糖醛酸酶(GUS)基因、甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因、核糖醇操纵子(ribitol operon)、色氨酸脱羧酶基因(tdc)、汞离子还原酶基因(merA)、天门冬氨酸激酶(AK)基因、叶绿素合成酶基因(hemL)、阿拉伯糖脱氢酶（atld)基因和谷氨酸-1-半醛转氨酶(GSAAT)基因等。

安全选择标记基因已被用于玉米、小麦、水稻、棉花、甜菜、烟草、番茄、食用菌、马铃薯等的遗传转化。

但是安全性标记基因作为一种外源DNA片段存在于植物基因组中，同样会限制多价外源基因导入，所以还需要不断发展标记剔除策略。

2.1.3 完全不使用抗性标记基因
完全不使用抗牲标记基因就是采用基本元件(只包含启动子、开放阅读框架和终止子的线性DNA片段)转化。

基本元件转化不仅去除了转基因中的不必要序列，而且可以获得低拷贝的转基因产物并减少基因重排。

Fu等采用基因枪将含有bar开放阅读框的基本元件(35S-bar-nos)和相应的质粒分别用基因枪转化水稻的愈伤组织。

试验结果证明转化基本元件的水稻植株中bar基因能够稳定表达，且未发现转基因沉默现象。

但是由于基本元件是裸露的DNA分子，整合前易发生扩散、重排等，导致整合到基因组中的外源基因拷贝数增多，
排列复杂化等。

此外，基本转化元件不含筛选标记基因，这将给后期检测带来一定的困难。

因此采用基本转化元件进行遗传转化可能仅限于抗除草剂基因、耐盐碱基因、抗冷冻蛋白基因、纤维素酶基因等少数功能基因的转化。

2.2 从目的基因出发
为了防止目的基因的逃逸，科研工作者进行了不懈的努力。

现在主要有以下几种方法来阻碍外源基因通过花粉逃逸：母系遗传法、雄性不育法、种子不育法、染色体组特异性选择、特异性表达启动子。

2.2.l 母系遗传法母系遗传(maternal inheritance)又称细胞质遗传法是指核外染色体所控制的遗传现象。

由于叶绿体带有一套独立于核外，又能自我复制的遗传物质，同时与核基因组又存在一定程度的相互作用，因而，叶绿体被称作半自主性细胞器。

绝大多数植物的叶绿体遗传方式为母系遗传，不通过花粉传递，可避免外源基因通过花粉扩散到其他作物或杂草中去，不易造成环境安全性问题。

同时转化体与野生型间不会出现基因渗透(introgression)现象，减少了抗虫性及抗药性等问题出现的几率。

叶绿体母性遗传的特性使其后代分离不遵循孟德尔遗传规律，在后代中不表现性状分离，所以外源基因可在子代中稳定遗传和表达，且叶绿体环境对一些酶的活性和一些蛋白质的修饰、加工比细胞质中要好。

因而，叶绿体中外源基因的蛋白质表达比在细胞质中更稳定。

外源基因利用DNA片段的同源重组机制，经过双交换将插入在同源片段之间的嵌合外源基因整合到叶绿体基因组中。

如果同源片段位于基因组的重复序列区内，整合到其中一个拷贝通过纠正作用(copycorrection)使两个重复序列保持相同。

转化基因组拷贝进一步与未转化拷贝发生分子间的重组，使转化DNA在叶绿体内扩增，直到在选择压力下转化子占优势。

Daniell等分别在烟草、西红柿等作物的叶绿体转化中获得成功。

但由于叶绿体基因组序列和有关转化技术的限制，这种以叶绿体为基础的母系遗传转化法还有待遇进一步发展。

2.2.2 雄性不育法
由于基因漂移主要是在花粉的传播和授精过程中实现的，所以培育雄性不育品种是阻止转基因逃逸的一种直接而有效的方法，它对既能有性生殖又能无性繁殖的一类作物(如马铃薯)尤为适用。

目前这种方法主要通过以下两种策略实现：(1)通过花药或花粉特异表达启动子驱动细胞毒素基因在花药或花粉中表达，促使绒毡层细胞消融或花粉自融，达到雄性不育；
(2)利用反义RNA抑制花粉发育所必需的基因的表达，从而达到雄性不育。

Mariani等通过绒毡层的细胞中特异表达的启动子TA29分别控制barnase和RNaseT1基因在烟草和油菜中表达得到雄性不育株。

虽然雄性不育法在很大程度上阻止了目的基因的逃逸，但由于雄性不育的转基因植株仍能和非转基因的杂草进行杂交而将外源基因通过种子扩展到自然群体，所以该方法并未彻底解决转基因安全问题。

2.2.3 种子不育法
种子发育法最初是通过抑制胚的发育或将自杀基因用于阻遏细胞增殖实现的。

但由于其转基因功能的不可恢复性，Kuvshinov等设计了一种可恢复性的RBF(recoverable b1ock of funclion)结构，通过阻遏区和恢复期在不同外界条件下分别起作用，来实现从分子水平上彻底阻断外源基因通过花粉来逃逸。

虽然这种改良的种子不育法为农民解决了后代种子不育的问题，但是恢复后的种子含具有功能的外源基因，存在食品安全性问题，仍不能消除人们对转基因作物的担忧。

2.2.4 特异性表达启动子
在早期的作物转基因工作中，一般使用组成型表达启动子来引导目的基因的表达，如花椰菜花叶病毒基因CaMv35启动子、水稻肌动蛋白基因Actinl启动子、玉米泛素基因Ubi 启动子等。

这些启动子的表达不仅对营养器官的发育造成了影响，也给转基因作物在食用安全方面带来隐忧。

而最近发展起来的组织特异型表达启动子或诱导性表达启动子，将外源基
因的表达限制作物的特定组织和器官中，或者在特定条件下诱导表达。

已有报道由花药、种子、韧皮部、胚乳、叶片和髓部等组织特异性启动子驱动的外源基因在转基因作物中成功实现了特异性表达。

因此，利用组织特异表达启动子代替组成型表达启动子，解决转基因水稻的安全性问题已经成为作物转基因研究中的另一个热点。

2.2.5 染色体组特异性选择法
染色体组特异性选择在防止转基因逃逸也有一定的作用。

对于异源多倍体作物，如小麦和油菜来说，其基因组由来源于几种不同野生种的几套染色体构成，而只有某一套染色体和其近缘杂草具有杂交亲和性。

所以，对转基因定位后，只选择转基因插入到安全性较高染色体组的转基因作物，并进行产业化，可以降低产生超级杂草的生态风险。

3 彻底删除外源基因的技术
无论是从选择标记出发，还是从目的基因出发，研究人员都只是关心转基因作物中部分外源基因的删除，没能彻底的解决转基因带来的安全性问题。

近几年有学者研究出一套新的技术，为解决转基因植物潜在的安全性问题提供了一条新的途径。

2004年，罗克明等设计了一个新的位点特异性重组酶系统pLFHFGN。

该系统中重组酶FLP基因由热激蛋白Hsp18.2基因的启动子控制，所有外源基因，包括重组酶基因FLP、GUS 报告基因和NPTⅡ筛选标记基因都置于两个融合识别位点loxFRT之间。

将上述重组酶系统通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumef aciens)介导转化烟草，其T1代幼苗中删除外源基因的效率达到了48.2%～84.9%。

2007年，在此基础上，由美国康涅狄格大学华裔教授李义等发展了一种“外源基因清除”技术(Gene-Deletor)，利用器官特异或诱导型启动子、重组酶及融合识别位点构建基因表达元件，能将转基因植物中的全部外源基因在完成其功能作用后自动地从花粉、种子和果实中彻底清除。

“外源基因清除”技术综合利用了两套位点特异重组酶的元件，来源于细菌噬菌体的Cre/LoxP系统和来自于酵母的FLP/FRT系统，这两套系统均通过重组酶识别特定的重组位点将插入该位点间的所有外源基因删除，其关键是创造了一个loxP和FRT的融合识别位点LF(LoxP-FRT)，获得了一个高效基因清除系统。

特异启动子驱动重组酶FLP或者Cre在适当的时间和部位表达，重组酶识别融合识别位点LF，两个融合识别位点之间的序列，包括重组酶的基因序列在特定的时期、从特定植物器官的细胞基因组中全部清除。

有人形象地将该过程比喻成计算机“卸载”应用软件。

“外源基因清除”技术不仅可同时可适用于无性繁殖和有性繁殖中还可以达到用转基因作物生产出非转基因食品的目的，解决转基因食品的安全性问题。

与以前的相关技术相比，具有几个显著优点：(1)能够将转基因植物花粉和种子中的外源基因全部清除；(2)大幅度地提高了转基因植物中外源基因的删除效率。

Luo等证明，在3万多株转基因烟草后代植株中，基因清除效率达到了100%；(3)“外源基因清除”技术更适合于生产上应用，尤其是在第二代(生产者和消费者都受益的性状改良)和第三代(以转基因植物作为生物反应器)基因工程产品生产中更有应用价值。

与种子不育法相比，“外源基因清除”技术更适合在生产上应用，因为该技术不仅具备了前者防止外源基因扩散的的技术优点，还解决了它没有解决的转基因食品的安全性问题，同时也不影响农民使用自己收获的种子播种。

4 结语
转基因作物的安全性是一个与人类自身生活密切相关的复杂问题，直接关系到一种转基因作物的未来命运。

随着转基因作物不断地商业化，人们越来越重视由此带来的安全问题。

经过科学家的不断研究探索，转基因作物安全性的解决方法得到了很好的完善。

虽然有些解决方法存在不足之处，但是毕竟在某种程度上消弱了转基因作物潜在的威胁，尤其是“外源基因清除”技术的提出，使转基因安全问题的解决方法上升到了一个新的高度。

相信随着科学技术的发展，转基因作物的安全性问题能够得到彻底解决，人们对转基因技术的争议逐渐
消失，转基因作物得到更广泛的应用，从而为人们创造更加可观的社会经济效益。