无菌检验及方法验证
无菌检查方法学验证
无菌检查方法学验证1. 概述将规定量的供试品按无菌检查法中的薄膜过滤法进行操作,并接种小于100cfu 的试验菌,同时设置阳性对照,按规定温度培养3~5 天,与各相应的阳性对照管比较: 如含供试品各管中的试验菌均生长良好,则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用,可按此法进行供试品的无菌检查;如含供试品的任一管中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长,则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用,应采用增加冲洗量或使用中和剂等方法消除供试品的抑菌作用,并再重新进行验证试验。
2. 验证前提条件供试品的选择原则:相同配方,不同规格的制品,选择其中装量最大的制品进行验证。
种类相同,含量不同的制品,选择含量最高的制品进行验证。
照此原则,多规格制品按下表选择供试品进行验证。
3. 验证方法3.1菌液制备3.1.1细菌菌液制备程序①取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的冻干菌种管各一支，分别在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后，吸出滴入营养琼脂斜面上,使均匀分布，置30~35C培养18h~24h。
用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于营养琼脂培养基斜面上，于30~35C培养18h~24h o 同法操作,培养得第3代培养物。
②取生抱梭菌的冻干菌种管一支,在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后,吸出滴入胃酶肉肝疱斜面上,使均匀分布,置30~35C培养18h~24h o用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于胃酶肉肝疱斜面上，于30~ 35°C培养18h~24h。
取生抱梭菌的第二代新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,30~35C培养18h~24h,得第3代培养物。
③分别取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的第3代营养琼脂斜面新鲜培养物，用5.0ml吸管吸取3.0ml~5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。
无菌检验方法验证
无菌检验方法验证无菌检查方法是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的试验方法！至于无菌检查具体有哪些验证方法呢？下面就随店铺一起来了解下吧！无菌检验方法验证无菌检查方法验证一般分为前验证和再验证两种。
前验证，也称预验证，指在无菌分析方法正式使用前，按照预定验证方案进行的验证。
如果没有充分的理由，任何检查方法必须进行前验证。
再验证，指某一检查方法经过验证并在使用一段时间后进行的，旨在证实已验证状态没有发生飘移而进行的重新验证及对检查方法进行修订、改变时进行的验证。
通常一个无菌产品的检查流程为：首先基于产品的剂型、溶解度等性质，按照药典的要求确定是否需要进行前处理;然后根据产品的特性是否有抑菌性，确定是否需要增加去除产品抑菌性的方法;最后验证整个检查方法中用到的一切及试验过程中的每一个环节包括样品的预处理方式、检查过程、培养条件等均不影响样品中微生物的生长。
前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应是验证的重点。
供试品中抑菌活性的去除是当前验证工作的重点，尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。
(一)具体的验证方法如下：1. 菌种的选择无菌检查方法验证中通常选择以下6种试验中常用的控制菌的标准菌株，它们分别代表不同类型的菌种：枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]代表药品中常见的污染菌——芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]代表革兰阳性菌、生孢梭菌 [CMCC(B)64 941]代表厌氧菌、大肠埃希菌[CMCC(B)44 102]代表革兰阴性菌、白色念珠菌[CMCC(F)98 001]代表酵母菌、黑曲霉菌 [CMCC(F)98 003]代表霉菌。
2. 菌液的制备接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35 ℃培养18~24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，23~28℃培养24~48h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
医疗器械无菌检验方法验证方案
医疗器械无菌检验方法验证方案一、背景医疗器械无菌检验是确保医疗器械在使用前不会引起感染的关键步骤之一。
为了保证无菌检验方法的准确性和有效性，需要进行方法验证。
本文将介绍医疗器械无菌检验方法验证的方案。
二、目的本方案的目的是验证所采用的无菌检验方法对医疗器械的适用性和可靠性。
通过验证，确保该无菌检验方法能够准确判断医疗器械是否符合无菌要求。
三、验证内容1. 确定验证属性：根据实际需求，确定无菌检验方法的验证属性，例如检测灵敏度、特异性、准确性、重复性等。
2. 样品选择：选择符合验证属性需求的医疗器械样品，确保样本具有代表性。
3. 测试方案设计：根据所选验证属性，设计相应的测试方案。
包括实验组和对照组的划分、对照方法选择、实验参数设定等。
4. 实验组和对照组：按照测试方案进行实验组和对照组的划分。
实验组使用待验证的无菌检验方法，对照组使用已经验证过的或国际标准的无菌检验方法。
5. 检测过程：按照测试方案进行样品的无菌检验。
确保检测过程中的操作规范和环境条件符合要求。
6. 数据分析：将实验结果进行分析，包括验证属性的计算和对比分析等。
使用合适的统计分析方法，评估无菌检验方法的准确性和可靠性。
7. 结果评估：根据数据分析的结果，对无菌检验方法进行评估。
判断该方法是否符合验证属性的要求。
8. 结论和建议：根据评估结果，给出无菌检验方法的结论和改进建议。
如发现验证方法存在不足之处，建议进行进一步的优化和改进。
四、质量控制在验证过程中，需要进行严格的质量控制。
包括实验设备的校准、环境条件的监测、操作流程的标准化等。
同时，还需要使用合格的正、负对照进行比对，确保验证结果的准确性和可靠性。
五、参考文献[1] 国家药品监督管理局.医疗器械无菌检验方法验证指导原则[S].2015.[2] International Organization for Standardization. ISO 11137-1:2006, Sterilization of health care products - Radiation - Part 1: Requirements for development, validation and routine control of a sterilization process for medical devices[S].六、结语医疗器械无菌检验方法验证是确保医疗器械安全使用的重要环节。
无菌检查方法验证
无菌检查方法验证：取本品，分别加灭菌注射用水 1ml 溶解，采用薄膜过滤法依法检查(中国药典 2022 年版二部附录Ⅺ H )，应符合规定。
菌液制备： 10 倍稀释法培养基 营养琼脂培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基硫乙醇酸盐培养基改良马丁培养基改良马丁琼脂斜面 培养基菌悬液制备计数结果菌种 代数 稀释级 菌落数(cfu/ml )枯草芽孢杆菌 4 10-6 61金黄色葡萄球菌 4 10-7 89大肠埃希菌 4 10-6 78生孢梭菌 4 10-6 67白色念珠菌 4 10-7 83黑曲霉菌 4 10-4 401、供试品处理将供试品去掉铝塑盖，外表面用75%酒精全面消毒，然后向每支样品中注 入 1.0ml0.1%的蛋白胨灭菌溶液，备用。
2、检查阳性对照： 将等量的试验菌直接加入到液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液 体培养基管中，在相应的温度下培养。
液体硫乙醇酸盐培养基管在 30-35℃下培菌种枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501 金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003 大肠埃希菌 CMCC(B)44102生孢梭菌 CMCC(B)64941白色念珠菌 CMCC(F)98001黑曲霉菌 CMCC(F)98003菌悬液制备用 0.9% 无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌少于 100cfu (菌落行程单 位)的菌悬液加入 5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将 孢子洗脱，再同上制成每 ml 含菌 小于 100cfu 的菌悬液养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。
观察记录。
阴性对照：将灭菌的液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液体培养基管直接放在相应的温度下培养。
液体硫乙醇酸盐培养基管在30-35℃下培养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。
观察记录。
样品 (薄膜过滤法)：每种实验菌取10 支处理好的供试品溶液，将溶液合并后加入制备好的菌悬液1ml，用0.1%的蛋白胨灭菌溶液稀释至100ml，按薄膜过滤法过滤，取出滤膜，将其分为3 等份，分别置于含硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份作为阳性对照用。
无菌检验方法验证方案
无菌检验方法验证方案1.引言无菌检验是对物品或产品进行微生物污染检测的一种方法。
验证无菌检验方法的准确性和可靠性是确保检验结果准确的关键因素。
本方案旨在提供一种有效的无菌检验方法验证实施方案。
2.目的验证无菌检验方法的准确性和可靠性。
3.系统概述本方案包括以下主要步骤：-设计验证实验方案-准备验证试验样品和无菌试验介质-运行验证试验-分析结果并评估方法的准确性和可靠性-编写验证报告4.设计验证实验方案根据实际情况，设计验证实验方案，包括验证试验的样品数量、样品类型、试验方法和实验条件等。
根据实际情况，选择合适的无菌检验方法进行验证。
5.准备验证试验样品和无菌试验介质根据验证实验方案，准备验证试验所需的样品和无菌试验介质。
确保样品和介质的质量符合要求，并严格遵守洁净操作程序，防止试验过程中的污染。
6.运行验证试验按照验证实验方案，进行验证试验。
严格按照无菌检验方法的要求进行操作，确保试验过程的准确性和可靠性。
对样品和无菌试验介质进行适当的控制，以确保试验结果的可靠性。
7.分析结果并评估方法的准确性和可靠性根据验证试验的结果，进行数据分析。
对验证试验过程中的任何问题进行评估，并判断无菌检验方法的准确性和可靠性是否满足要求。
如果发现问题，需要进行适当的调整，并重新运行验证试验。
8.编写验证报告根据验证试验结果，编写验证报告。
报告应包括验证试验的目的、方法、结果和结论等。
报告应清晰、准确地描述验证试验过程和结果，并提出相应的建议。
9.结论通过验证实验方案的实施，可以评估无菌检验方法的准确性和可靠性。
如果验证结果表明方法可靠，可以继续使用该方法进行无菌检验。
如果验证结果不满足要求，需要对方法进行修订或选择其他合适的方法。
总之，无菌检验方法的验证是确保检验结果准确的重要步骤。
通过设计合理的验证实验方案、准备样品和无菌试验介质、运行验证试验、分析结果并评估方法的准确性和可靠性，可以有效地验证无菌检验方法的准确性和可靠性，并提供一份详尽的验证报告。
无菌检查方法验证报告
无菌检查方法验证报告目录1. 目的 (3)2. 适用范围 (3)3. 接受标准 (3)4. 抽样计划 (3)5. 设备、试剂和菌种信息 (3)6. 试验步骤 (4)7. 供试品检查 (6)8. 结论 (6)9. 再验证周期 (6)10. 附件清单 (6)1.目的支据中国药典2020版无菌检查法的要求，对产品的无菌检查法进行验证，以确定一种无菌检查的方法能有效的消除该产品对微生物的抑制作用，从而证实该方法的有效性和实用性。
2.适用范围适用于本司产品的无菌检查。
3.接受标准与阳性对照比较，含供试液各容器中的试验菌（金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌和黑曲霉）均生长良好，则可照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。
如含供试品的任一容器内的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，需进一步改进检验条件再进行方法验证试验。
4.抽样计划随机抽取灭菌后的样品24份。
具体信息见表一：表一样品信息确认人/日期：复核人/日期：5.设备、试剂和菌种信息5.1设备信息详见表二表二设备信息确认人/日期：复核人/日期：5.2试剂信息详见表三：表三试剂信息确认人/日期：复核人/日期：5.3菌种信息详见表四：表四菌种信息确认人/日期：复核人/日期：5.3.1菌液的制备用接种环取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的第三代培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取生孢梭菌的第三代培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取白色念珠菌的第四代培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取黑曲霉的第三代培养物，向培养物中加入10mL0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，转移孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的孢子悬液。
以上操作均在微生物检验室阳性菌室的生物安全柜中进行。
药典无菌检查方法验证及操作要点
2. 培养基
2.1 培养基的灭菌 配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
2.2 培养基的保存 制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的
环境。培养基若保存于非密闭容器中，一般在三 周内使用；若保存于密闭容器中一般可在一年内 使用。
•
2.3 培养温度 硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养
。改良马丁培养基置23～28℃培养。 2.4 培养基的适用性检查
•
黑曲霉
改良马丁琼脂斜面培养基上， 23～28℃培养5～7天，
加入3～5ml 0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗
脱
吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌
棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌
试管内
用0.9％无菌氯化钠溶液制成每lml含孢
子数小于l00cfu的孢子悬液。 •
4.3 薄膜过滤法 将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲
药典无菌检查方法验证 及操作要点
2020年4月29日星期三
1 前言 1.1 定义
无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药
品、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方
法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明
了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
•
1.2 实验环境条件要求
无菌检查应在环境洁净度10 000级下的 局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔 离系统中进行，其全过程必须严格遵守无 菌操作，防止微生物污染。单向流空气区、 工作台面及环境应定期按《医药工业洁净 室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方 法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔 离系统按相关的要求进行验证，其内部环 境的洁净度须符合无菌检查的要求。
3）枯草芽孢杆菌
(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63 501]
无菌检查法及其验证
无菌检查法及其验证
第8页
培养基储存
• 制备好培养基应该保留在2-25℃、避光环 境，若保留于非密闭容器中，普通在3周内 使用；若保留于密闭容器中，普通可在1年 内使用。
※应结合实际情况进行验证，以确定培养基 使用期。
无菌检查法及其验证
第9页
培养基适用性检验
本检验可在供试品无菌检验前或与供试品 无菌检验同时进行。 • 无菌性检验
无菌检查法及其验证
第24页
阳性对照试验
• 目标：①验证供试品经灭活后或用其它方式（稀 释、冲洗等）处理后是否仍有抑菌或杀菌作用， 确保检验条件符合要求，预防出现假阴性。②培 养条件是否符合要求。
• 应依据供试品特征选择阳性对照菌。 ①无抑菌及抗革兰阳性-金黄色葡萄球菌 ②抗革兰阴性-大肠埃希菌
③抗厌氧菌-生孢梭菌 ④抗真菌-白色念珠菌
无菌检查法及其验证
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• 对无菌检验试验所用设备及环境微生物监控结果不 符合无菌检验法要求；
• 回顾无菌试验过程，发觉有可能引发微生物污染原 因；
• 供试品管中生长微生物经判定后，确证有微生物生 长是因无菌试验中所使用物品和（或）无菌操作技 术不妥引发。
无菌检查法及其验证
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试验若经确认无效，应重试。重试时，重 新取同量供试品，依法重试，若无菌生长， 判供试品符合要求，若有菌生长判供试品 不符合要求。
2支
1 ml 5天
※其中硫乙醇酸盐及改良马丁培养基都有 1支不接种作为空白 ※接种量 ＜100cfu（不能多）
无菌检查法及其验证
第14页
培养基适用性检验
⑤结果判断
• 空白对照应无菌生长，若加菌培养 基管均生长良好，判该培养基灵敏 度检验符合要求。
4无菌检验方法验证
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无菌检验方法验证
1.ONE
开展验证的思路和程序
首先了解供试品是否具有抑菌性，抑什么菌
2.TWO
考虑和选择出适当的方法已消除或减低供试品的抑菌性
3.three 4.four
用实验证明你所用的方法已消除抑菌性——能使人工加 入的各种菌生长良好。
将所作实验记录在案——即为确认该供试品在该检验量
条件 无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行， 其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污 染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物 的检出。
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无菌检验方法验证
方法验证试验 当建立产品的无菌检查方法时，应进行
六、验证结论。
七、【检查】项下【无菌】或【微生物限度】具体方法确定。
八、实验员签名、验证报告批准人签名。
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无菌检验阳性结果调查
无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果 不符合无菌检查法要求
回顾无菌测试过程，发现有可能引起微生物污染的 因素
阴性对照有菌生长
稀释：—— 验证降低供试品相对抑菌浓度的有效稀释 倍数。
离心：—— 验证所用转速、时间和微生物的分YO布UR情SIT况E H。ERE
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3、确定供试品是否有抑菌性、抑什么菌 方法一： 可通过查阅临床药物实验手册、文献资料 （特别是杂志“Drug”，每一种新药上市，都有专 门的综述）、申报资料中的药效学资料，关注其对不 同细菌的MIC情况、参考已经验证过的品种、抗菌 药物可根据抗菌谱确定其敏感菌、中成药如果抗菌谱 不清楚，至少需选择一株细菌和一株真菌来试验等方 法。也可直接通过验证实验确定之。
无菌检验操作方法验证
无菌检验操作方法验证无菌检验操作方法验证是指对实验室内进行的无菌操作方法进行验证，以确定操作方法是否能够有效地保持实验室内的环境无菌，以及保证实验结果的准确性和可靠性。
无菌检验操作方法验证是实验室质量管理的重要环节，也是一项必要的规范操作。
下面将详细介绍无菌检验操作方法验证的步骤和要点。
1. 准备实验材料和设备：首先，需要准备无菌操作所需的实验材料和设备，包括培养基、无菌培养皿、无菌试剂、无菌滤纸等。
同时，要确保设备的无菌性，如离心机、超净工作台、培养箱等。
2. 设定验证方案：为了确保验证的有针对性和可行性，需要制定详细的验证方案，确定验证的目的、方法、步骤和评价标准等。
验证方案的编制应根据相关规范和实验室的具体情况进行。
3. 进行验证实验：在进行验证实验之前，需要对实验人员进行培训，使其掌握无菌操作的正确方法和技巧。
验证实验的过程中，应按照操作规程进行操作，注意操作的顺序、速度和力度。
实验过程中应严格遵守无菌操作规范，如使用消毒酒精擦拭操作台面和手部、佩戴无菌手套、使用一次性无菌物品等。
同时，要注意控制环境因素对实验结果的影响，如避免空气中的微生物等外源性污染。
4. 评价验证结果：完成验证实验后，需要对验证结果进行评价和分析。
评价内容包括环境无菌状况、培养基的无菌性、操作人员的无菌技术等。
评价可以通过直接培养培养基观察生长情况，或者使用生物指示物进行验证。
5. 记录和整理验证数据：对验证过程中的各项数据、结果和结论进行记录和整理。
记录内容包括验证的日期、操作人员、验证方案、验证结果等。
整理验证数据有助于对验证过程进行追溯和分析，以及后续改进操作方法和提高无菌操作水平。
6. 分析验证结果：根据验证的结果和数据分析，评估操作方法验证的合格性和有效性。
如果验证结果符合规范要求，则该操作方法验证合格；如果验证结果不符合规范要求，则需要分析问题产生的原因，并进行相应的改进和调整。
7. 实施操作方法的修订：根据验证结果的分析和评估，对操作方法进行修订和改进。
无菌检验及方法验证
培养基
• 中国药典: 改良马丁和FTM • 美国药典: TSB 和FTM • 购买的RTU培养基/实验室配制的培养基 • 按照相应的SOP编制培养基的批号 • 培养基质量控制（pH，无菌性，灵敏度实验） • 制定有效期 • FTM培养结束后培养基氧化层（粉红色）不应超过培养基深度
1/2。供试品接种前，培养基氧化层颜色不得超过培养基深度的 1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分 钟），迅速冷却，只限加热一次
培养基（续）
• 灵敏度检查 – 根据药典方法选择阳性菌种(G-,G+,酵母菌,真菌, 环境中分离 得到的菌株) – 购买的RTU培养基每批要进行灵敏度检查 – 将小于100 CFU的阳性菌加入培养基内,计数 – 细菌培养不超过3天,真菌培养不超过5天 – 空白对照无菌生长,加菌的培养基生长良好 – 加入添加剂的培养基须重新进行灵敏度检查 – 菌种制备,保存和培养的SOP – 对新开的菌种冻干管需要对菌种进行鉴定,菌种传代不超过5 代
培养基（续）
• 灵敏度检查 – 购买药典推荐的菌种 FTM：枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单孢菌，生 孢梭菌 TSB：白色念珠球菌，黑曲霉菌 --至少包含一种环境菌
• 培养基无菌性检查 培养基应在适当的温度下培养14天以检测其无菌性,每批随机抽取 5瓶
-培养基灵敏度检查可以和培养基无菌性检查、无菌检查同步进行
无菌实验
• 取样Sampling • 检测方法Test methodology • 培养基Media • 培养时间Incubation period • 阴性对照Negative test controls • 阳性对照Positive test controls
无菌检查方法学验证
2006年8月
无菌检查方法学验证
方法学验证资料试验结论
采用的方法：薄膜过滤法/直接接种法 关键实验点：如冲洗条件、中和、酶处
理等因素
2006年8月
无菌检查方法学验证
三、验证及资料中常见的问题
生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64 941]
白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F) 98 001]
黑曲霉 (Asperglllus niger) [CMCC(F) 98 003]
2006年8月
无菌检查方法学验证
菌株选择的原则:代表性,普遍性,易存活、低或非致病 性,标准菌株(或该药品中常见的污染菌)。
国药典发[2005]98号
各药品检验所： 根据国食监注[2005]234号“关于颁布和执
行《中国药典》2005年版有关事宜的通知” 规定，《中国药典》7月1日起开始执行，各 药品检验所在执行“微生物限度检查法”和 “无菌检查法”过程中遇到了一些问题，为 保证《中国药典》2005年版的顺利实施，现 就有关问题说明如下：
2006年8月
无菌检查方法学验证
直接接种法
取符合直接接种法培养基用量要求的硫 乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于 100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞 菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管；取 符合直接接种法培养基用量要求的改良 马丁培养基4管，分别接入小于100cfu的 白色念珠茵、黑曲霉各2管。其中1管接 人规定量的供试品，另1管作为对照，按 规定的温度培养3～5天。
2006年8月
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
计数 (CFU)
均值 (CFU)
22 26 24
金黄色葡萄 球菌
36 39
38
枯草芽孢杆 菌
62 66
64
铜绿假单胞 菌
58 54
56
生孢梭菌 20 20
20
菌种 计数(CFU) 均值(CFU)
表2 真菌数计数结果 黑曲霉菌
白色念珠菌
86
93
86
83
89
85
2024/4/20
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
7. 活菌计数 活菌计数结果见表1。
2024/4/20
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
5
第5页
10－4稀释 10－5稀释 10－7稀释
试验次数
1 2 1212
金黄色葡萄球菌
56 60
枯草芽孢杆菌
77 79
白色念珠菌
86 70
黑曲霉菌
80 76
铜绿假单胞菌
47 50
2024/4/20
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
方法： 中国药典相关微生物程度检验法方法验 证试验。
2024/4/20
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
30
第30页
详细操作方法
菌液制备： (1)取经37℃培养18~24h，金黄色葡萄球菌 、大肠埃希菌、枯草杆菌肉汤培养物 1ml+9ml盐水，10倍稀释至10-5 ~10-7，细菌 数约为50~100cfu/ml，做活菌计数备用。
2024/4/20
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
20
第20页
供试液制备：每2支以100ml生理盐 水溶解，混匀备用。
薄膜过滤：将要求量供试品按薄膜 过滤法过滤，冲洗，每次50ml，在最 终一次冲洗液中逐一加入试验菌少于 100CFU。按要求将培养基直接加至 滤筒内。天天观察并统计结果。
无菌检查方法验证方案
产品无菌检查方法验证方案无菌检查方法验证1.概述无菌检查是用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其它品种是否无菌的一种方法。
无菌检查工作量大、操作不规范、人员的知识匮乏、检查方法应用不当等都会导致试验失败，因此在对一个产品进行无菌检查之前应先对无菌检查方法进行验证。
2.验证目的2.1确认所用的无菌检查方法适用于“本公司所有无菌产品”的无菌检查。
2.2确保检查结果的准确性、可靠性、准确性和重现性以及检查方法的完整性。
2.3通过对不同批次产品无菌检查的比较，对医用即无菌产品的生产全过程进行质量监控。
3.验证范围“本公司所有无菌产品”的无菌检查。
4.验证人员及职责验证委员会负责验证项目的确定；质控部负责该验证方案的起草及组织实施；验证小组负责验证方案的审批；质控部参与验证的实施及监督。
验证小组成员：5.文件准备和培训5.1检查验证所需的各类文件资料，应齐全；相关的文件草案是否已具备。
5.2培训参加验证人员需进行本文件及下述内容的培训：微生物知识、无菌检查及微生物检验操作培训。
6.验证条件及验证时间安排6.1验证条件6.1.1检验公用系统验证及仪器安装完成；仪表量器经过校验合格，且在有效期内。
6.1.2供试品3批①②③培养基及试剂：氯化钠：临用前配成0.9%浓度的溶液硫乙醇酸盐流体培养基批号：生产厂家：TSB 批号：生产厂家：6.1.3验证用菌株：微生物培养基质控品（来源：杭州微球科技有限公司）金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】菌种传代次数铜绿假单胞菌【CMCC（B）10104】枯草芽孢杆菌【CMCC（B）63501】生孢梭菌【CMCC（B）64941】白色念珠菌【CMCC（F）98001】6.1.4无菌检验仪器及相关设备压力蒸汽灭菌器型号：编号：生化培养箱型号：编号：霉菌培养箱型号：编号：超净工作台型号：编号：6.2验证时间验证小组提出完整的验证计划，经批准后实施，整个验证活动按下面时间安排完成。
无菌检验方法验证报告
检查验证所需的各类文件资料，应齐全；相关的文件草案是否已具备。
6.验证条件
6.1.无菌检查室空气净化系统已经过验证并合格，仪器安装完成；仪表量器经过校验合格，且在有效期内。
6.2.供试品：3批，批号：
批号：
批号：
6.3.培养基及试剂：
6.3.1.试剂试液：
氯化钠:临用前配成0.9%浓度的溶液，配制记录见附件1。
2.验证目的：
验证所采用的方法和条件是否适合于供试品的无菌检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或者其抑菌活性以被充分消除到可以忽稍不计。
3.验证范围：
合用于灭菌注射用水无菌检查法的验证。
4.验证人员及职责
质量部负责该验证方案的起草及组织实施；
验证小组负责验证方案的审批；
质量部参预验证的实施及监督。
生孢梭菌
白色念珠菌
黑曲霉
【CMCC(B)26003】
【CMCC(B)10104】
【CMCC(B)63501】
【CMCC(B)64941】
【CMCC(F)98001】
【CMCC(F)98003】
购自：
各验证用菌种传代记录见附件4。
6.5.无菌检验仪器及相关设备：
压力蒸汽灭菌器
型号：
生产厂家：
校验日期：Байду номын сангаас
编码：
无菌检验方法验证报告
药业有限公司
1.概述：
无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。本公司的无菌检查只是针对于灭菌注射用水的无菌检查。
灭菌注射用水灭菌工艺采用121℃30min过度杀菌法，按照2005年版《中国药典》的规定，注射剂的无菌检查应采用薄膜过滤法。制定的《无菌检查法标准操作规程》(SOP4.14.038-B)应经过验证后，才干批准使用。
商业无菌检验能力验证技术方案
商业无菌检验能力验证技术方案无菌检验是在医疗领域、制药行业、食品行业等对无菌产品进行质量检验的重要环节。
无菌检验的准确性和可靠性对于产品质量和安全至关重要。
因此，进行无菌检验的实验室需要具备强大的检验能力和验证技术。
一、无菌检验能力验证的目的无菌检验能力验证的目的是评估实验室进行无菌检验的能力，确保检验结果的准确性、可靠性和可重复性。
通过验证实验室的检验能力，可以提高无菌检验的质量，降低风险。
二、无菌检验能力验证的内容1.管理体系验证：包括实验室设施、设备的验证，实验室操作规程的完善性和合规性，人员的培训情况等。
2.无菌检验方法验证：验证实验室使用的无菌检验方法的准确性和可靠性，如微生物计数法、膜过滤法等。
3.无菌环境验证：验证实验室的无菌环境是否符合相关标准和要求，如生物安全柜的性能验证、洁净室的验证等。
4.质控样品验证：验证实验室是否能够正确使用质控样品进行无菌检验，确保结果的准确性。
5.数据分析和报告编制验证：验证实验室对无菌检验数据的正确处理和分析能力，以及编制无菌检验报告的能力。
三、无菌检验能力验证的方法和步骤无菌检验能力验证的方法和步骤如下：1.制定验证计划：根据实验室的具体情况制定无菌检验能力验证的计划，包括验证的内容、方法和步骤等。
2.收集验证所需的资料：根据验证计划收集实验室的相关资料，如设备、方法和操作规程等。
3.进行实验室环境验证：验证实验室的环境是否符合无菌检验的要求，如温度、湿度和洁净度等。
4.进行无菌检验方法验证：验证实验室使用的无菌检验方法的准确性和可靠性，包括方法的选择、操作规程的编制和培训等。
5.进行质控样品验证：验证实验室是否能正确使用质控样品进行无菌检验，并进行数据分析和报告编制。
6.结果分析和报告编制：对验证结果进行分析，编制验证报告，提出改进措施和建议。
四、无菌检验能力验证的结果评价无菌检验能力验证的结果应根据相关标准进行评价，主要评估以下几个方面：1.实验室的基础设施和设备是否符合要求，是否能满足无菌检验的需要。
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否则验证无效。
方法验证实验（续）
• 薄膜过滤法 将规定量的样品按薄膜过滤法过滤，冲洗， 在最后一次冲洗液中加入小100cfu 试验菌。取出滤膜转移至相应的培养基中， 或将培养基加入滤筒内。取另一装有相同体 积的培养基的容器加入等量的试验菌，作为 阳性对照。按规定温度、时间培养。
无菌试验及验证
孙冬梅
无菌检查
• 定义 • 背景 • 培训 • 设施 • 无菌试验室的清洁 • 环境检测 • 方法验证 • 无菌检查 • 结果 • 解释和重新测试 • 调查报告
定义
• 营养实验(灵敏度检查):证明培养基能够 growth promotion test 支持微生物生长
• 阴性控制: 用来鉴定假阳性
无菌更衣
• 无菌更衣，头套，鞋套，护目镜，口罩 • 每次进入更换新的无菌服 • 保留无菌衣灭菌记录 • 实验员需得到无菌更衣的培训和资格确认，并保留记
录
洁净室设备和表面
• 电源插座，日光灯应嵌入墙或天花板内并密封 好，避免非洁净空气进入。洁净室表面应光滑 并耐腐蚀
• 转角光滑，容易清洁 • 应有通讯设备并便于消毒 • 应设有椅子和放置物品的桌面或推车，并便于
限度和行动限度 • 选择合适的培养基,接触碟培养基需要含有中和剂
方法验证实验
• 微生物实验方法验证的目的 • 验证实验:抑真菌/抑细菌实验 • 在对一个产品进行无菌测试之前， 要确认
产品固有的活性不会影响测试的可靠性， 并证明所用的测试程序适合于该产品的无 菌测试。 • 进行无菌测试验证时，所用测试方法应与 正常测试相同。 • 若样品的组分或原检验条件发生改变时， 测试方法需重新验证。
试验经验 • 样品表面/穿刺部位的消毒 • 物料的进入，过滤器盒的消毒 • 无菌操作注意 • 手和操作表面的消毒 • 蠕动泵的流速 • 空气过滤器的保护
培养基
• 中国药典: 改良马丁和FTM • 美国药典: TSB 和FTM • 购买的RTU培养基/实验室配制的培养基 • 按照相应的SOP编制培养基的批号 • 培养基质量控制（pH，无菌性，灵敏度实验） • 制定有效期 • FTM培养结束后培养基氧化层（粉红色）不应超过培养基深度
讨论：菌液的加入
方法验证实验（续）
• 直接接法
• 取适量的培养基，分别加入试验菌，每 瓶加试验菌10-100cfu，每种菌加2瓶， 其中一瓶加入规定量的供试品，另一瓶 作为阳性对照。按规定温度、时间培养
方法验证实验（续）
• 结果判断 • 如果接种后的培养基和阳性对照相比有明显
的微生物生长迹象，则说明该产品无抑菌活性 或该活性已被削减到满意的程度，无菌测试程 序可以不加修改直接使用。
消毒
• 不应存放与实验无关的物品 • 紫外灯
无菌实验室的清洁
• 实验过程中操作表面和操作人员要经常用消毒剂消毒 双手
• 要有无菌实验室的清洁程序SOP • 隔离器有其独特的消毒方法 • 在清洁前确保所使用的清洁剂,消毒剂经过验证,最少
接触时间和灭菌效力.所选择的消毒剂应达到使用要求 • 至少两种消毒剂轮换使用 • 保留清洁剂消毒剂的配制记录,有相应的SOP
听到报警 • 不同级区的压差不小于12.5帕斯卡。 • 压差记录/经过验证的计算机检测系统 • 每次实验前检查压差 • 压差表上标明压差的范围
更衣室
• 进入无菌室前更换无菌衣（符合进入生 产区无菌区的更衣要求）
• 在不影响无菌更衣程序的条件下，设计 应方便人员从非洁净室进入洁净室.如长 凳
• 配备穿衣镜，更衣说明，洗手池，洗手 液，干手机，无菌衣存储架
无菌检验
• 检验数量:是指一次实验所用供试品最小包装容器的数 量（样品无菌检查）
• 检验量:是指一次实验所用的供试品总量（验证实验， 阳性对照）
• 培养基用量:除另有规定外,应不小于药典规定的量
• 阳性对照:检验实验操作是否按照方法验证的程序进行, 对实验的检验
• 阴性对照:对实验条件,操作人员无菌操作,淋洗液无菌 性的检验
此试验条件下是无菌的；培养基变混浊意味着产品被污染
• 如何保证产品无菌？ 经过验证的恰当的生产工艺或无菌工艺
培训
• 在进行无菌测试前，操作人员必须熟练无菌操
作，经过专门的培训并通过资格认证.
• 确保每次实验操作人员都遵循SOP进行操作并 接受监测。 定期对操作人员进行培训。特别 对经常出现无菌实验假阳性、阴性控制出现阳 性的操作人员
无菌实验
• 取样Sampling • 检测方法Test methodology • 培养基Media • 培养时间Incubation period • 阴性对照Negative test controls • 阳性对照Positive test controls
取样
• 取样要有代表性,如开始,中间,结束
技术造成
结果的解释
• 如果无菌测试被认为是无效的，用同样数量的 样品进行复试。
• 如果复试没有出现微生物生长迹象，产品通过 无菌测试。如果复试仍出现微生物生长迹象， 产品无菌实验失败。
• 定期对无菌测试结果和阴性对照进行趋势分析
调查报告
• 无菌试验失败需起草调查报告 • 调查包括：细菌鉴定；环境/人员检测结
果；灭菌记录；人员资格；检验方法； 粒子计数结果；无菌室清洁记录；层流 台过滤器完整性等
• 产品放行前完成调查 • 保存归档
谢谢大家！
1/2。供试品接种前，培养基氧化层颜色不得超过培养基深度的 1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分 钟），迅速冷却，只限加热一次
培养基（续）
• 灵敏度检查 – 根据药典方法选择阳性菌种(G-,G+,酵母菌,真菌, 环境中分离 得到的菌株) – 购买的RTU培养基每批要进行灵敏度检查 – 将小于100 CFU的阳性菌加入培养基内,计数 – 细菌培养不超过3天,真菌培养不超过5天 – 空白对照无菌生长,加菌的培养基生长良好 – 加入添加剂的培养基须重新进行灵敏度检查 – 菌种制备,保存和培养的SOP – 对新开的菌种冻干管需要对菌种进行鉴定,菌种传代不超过5 代
• 如果无菌实验无效,进行再次实验的样品要能反映最初 样品的特性,取样点或无菌工艺过程的干扰
检验方法
• 薄膜过滤法是首选的方法 • 建议首先润湿滤膜（对小体积的产品和
抗生素必须先润湿滤膜）
• 用方法验证时验证的最少冲洗量的冲洗 液来冲洗滤膜。
• 每张滤膜过滤的体积不要超过1000ml
检验方法（续）
• 保留培训记录
设施
• 洁净室设计 • 无菌更衣室和气闸 • 洁净室的表面和内部设施
洁净室设计
• 达到无菌生产时相应洁净室级别的要求 • 设备根据相应的要求经过确认（IQ/OQ) • 无菌检查应在环境洁净度10000级背景下的局部100级的单向流
空气区域内或隔离系统内进行 • 无菌检查应在足够大的区域内进行， 物品的放置不会破坏层流 • 每年至少对层流台或隔离器进行一次确认 • 洁净室的空气应通过高效过滤器，如果压差超出范围应该能看到、
薄膜过滤法可采用的修改方案: • 增加淋洗液、培养基的用量。 • 用其他成分的滤膜而不用纤维素成分的滤膜( 如聚偏二氟乙烯，
尼龙，聚四氟乙烯或聚炭酸酯)。 • 在淋洗液中加入表面活性剂 (如淋洗液K) 来分散产品中的乳化粒
子。为了提高产品的可溶性，可将淋洗液保温到35°C－45°C。 • 如可行的话，在淋洗液中加入一合适的无菌的生物去活物质。
培养基（续）
• 灵敏度检查 – 购买药典推荐的菌种 FTM：枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单孢菌，生 孢梭菌 TSB：白色念珠球菌，黑曲霉菌 --至少包含一种环境菌
• 培养基无菌性检查 培养基应在适当的温度下培养14天以检测其无菌性,每批随机抽取 5瓶
-培养基灵敏度检查可以和培养基无菌性检查、无菌检查同步进行
USP真菌 20-25度,细菌30-35度 • 记录培养箱的温度,每年校验培养箱的温度 • 定期清洁培养箱 • 培养记录，培养期间每天检查样品,并记录 • 培养基产生悬浮、絮凝、沉淀，14天后将2-5
％培养物转入新鲜的培养基内，再培养7天
阴性对照
• 阴性对照：在进行无菌检测时,没有样品的漏斗作为阴 性对照
• 如果加过产品并接种后的培养基和阳性对照相 比生长微弱、缓慢或不生长，则说明该产品的 抑菌活性在该测试条件下没有被减弱到满意的 程度，需要对测试条件进行修改并重新验证至 该产品的抑菌活性被削减到满意的程度
方法验证实验（续）
• 采用一种或更多的方案对无菌测试方法进行修改，重新进行验 证。每个修改方案都必须很好地存档。只需用首次验证时未出现 生长的测试菌株，如果该菌株在修改后的测试条件下可以生长， 则在 同等条件下对所有的测试菌株进行验证。如果修改方法不 能使所有的测试菌株都出现生长，则 采用那个使最多种测试菌 株出现生长的方法。
• 需记录和计算阴性对照发生的频率
阳性对照
• 阳性对照：在进行无菌试验时将含样品的滤筒 内加入阳性控制菌 – 阳性菌的选择 – 阳性对照要与无菌检查分室进行
• 各国药典/法规对阳性对照的要求：
– EP，USP，TGA
– CP
结果判断
• 培养基澄清或虽然显混浊但经证明并非有菌生长---供 试品符合规定
环境监测
环境监测应结合空气和表面取样方法,如 - 空气浮游菌监测; - 沉降碟; - 表面监测:接触碟或擦拭法; - 空气粒子数检测 - 操作员的无菌衣和双手.
• 对环境中分离出的细菌进行鉴定,可以帮助解释无菌实验结果 • 环境监测应在动态条件下进行 • 取样点, 暴露时间,监测频率都应有相应的SOP 规定,并应设置警戒
• 任何培养基显混浊并确认有菌生长----供试品不符合规 定