实时定量PCR实验故障排除

实时定量PCR实验故障排除扩增曲线
原始数据
Spectra：各波长的原始信号
没有标准曲线
没有标准曲线
没有扩增曲线
原始数据只有1个循环
Spectra
只有1个循环的数据原因：
1.收集数据的步骤只有一个循环，只收集了一个数据点
2.电脑为了节省电源而休眠，通讯中断，1个循环后的数据丢失
原因1：PCR参数设置错误
原因2：硬盘休眠
从原始数据找原因
从第1-第9个循环，ROX的信号升高并逐渐下降。

在所设定的4-13基线范围内，ROX信号值是变化的，而FAM的信号值基本上是固定的，经过FAM/ROX的校正后，比值自然不相等，所以基线不是水平的直线，而有下滑部分。

ROX的信号变化与所用试剂的质量有关。

应该取10-20为合理的基线范围。

解决方法
修改基线范围为10-20，重新分析。

重新分析的结果
基线范围取10-20，重新分析后的图谱。

第1-9循环的信号为负数，由于试剂质量引起。

增曲线分成两段扩增曲线断裂
原因：基线的终点大于CT值，
通常是因为模板DNA浓度偏高，CT值< 15，而基线仍然取3-15，其中包含部分扩增信号，导致标准偏差偏大，阈值过高
解决方法：减小基线终点，至CT值前4个循环，重新分析数据
样品浓度跨度太大
直线扩增曲线
原因：探针部分降解
V形扩增曲线
V形扩增曲线
V形扩增曲线
扩增微弱或者信号很弱
ROX信号不稳定
扩增曲线不光滑
原因：信号太弱
解决方法
•使用高质量的探针
•补救方法：
1.7000的SDS软件升级到v1.1
2.关闭ROX校正，重新分析数据
关闭ROX校正的效果
ROX帮助故障诊断(1)
现象：重复性很差
正常的原始数据
原因：盖子未盖紧，溶液蒸发
排除蒸发的数据后
ROX帮助故障诊断(2)
现象：山坡形扩增曲线
原始数据显示有蒸发
引物二聚体SYBR Green I®化学，Dissociation curve试验•推荐措施：提高引物设计质量，
避免形成引物二聚体
•补救措施：优化引物浓度和退火温度
•也许：专设80度步骤收集信号？。