超声提取细黄链霉菌胞外多糖工艺与抗氧化活性研究

超声提取细黄链霉菌胞外多糖工艺与抗氧化活性研究
李堆淑
【摘要】以细黄链霉菌胞外多糖的浓度为指标,采用单因素和响应面分析法对细黄链霉菌胞外多糖浓度的提取条件进行优化,然后用邻二氮菲法和DPPH法测定了细黄链霉菌胞外多糖的抗氧化活性.结果表明,影响细黄链霉菌胞外多糖浓度的单因素试验的最佳条件为乙醇体积分数70％,乙醇沉淀时间12 h,超声功率420 W.向应面法优化得到超声波提取细黄链霉菌胞外多糖的最佳工艺为:乙醇体积分数70.32％,乙醇沉淀时间12.06 h,超声功率417.12W,细黄链霉菌胞外多糖浓度为4.945 g/L,与预测值相差0.142％.细黄链霉菌胞外多糖对·OH和DPPH·均具有较强的抗氧化活性.%Using EPS of Streptmyces microflavus as the index,the extraction conditions of EPS from Streptmyces microflavus were optimized by single factor analysis and response surface analysis.Antioxidant activities of EPS of Streptmyces microflavus were determined by phenanthroline Fe2+ methodand and DPPH · assay.The results by single factor experiment showed that the optimum conditions of effecting EPS of Streptmyces microflavus were:ethanol volume fraction 70％,ethanol deposition time
12h,ultrasontic power 420W.With response surface methodology,the optimum technology of the ultrasonic extraction of EPS from Streptmyces microflavus was:ethanol volume 70.32％,ethanol deposition time 12.06 h,ultrasontic power 417.12W.EPS of Streptmyces microflavus was
4.945g/L,which was 0.142％ lower than predictive value.EPS of Streptmyces microflavus had fairly strong antioxidant activity of · OH and DPPH· radical.
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2016(042)005
【总页数】6页(P253-258)
【关键词】细黄链霉菌;胞外多糖;响应曲面法;抗氧化活性
【作者】李堆淑
【作者单位】商洛学院生物医药与食品工程学院,陕西商洛,726000
【正文语种】中文
微生物多糖具有化学结构简单、来源丰富、生产周期短、不受季节限制、安全、低毒等的优良特质，可作为乳化剂、保鲜剂、抗衰老剂、抗癌医药品、抗氧化剂、抗辐射剂等广泛应用于化工、食品、制药等领域[1-2]，微生物胞外多糖是微生物在代谢过程中分泌到细胞壁外的多糖高聚物[3]。

已经发现能产生胞外多糖的微生物有细菌、放线菌、酵母菌和丝状真菌等。

目前，主要研究细菌、真菌、藻类的胞外多糖，而对放线菌胞外多糖的研究相对较少。

蔡隽妮等[4]对南海石珊瑚中一株共生放线菌ZJG1胞外多糖的DPPH清除作用进行研究，发现放线菌ZJG1清除DPPH的物质在菌丝体胞外多糖中分布较少。

文金等[5]发现链霉菌(Streptomyces sp.)2305菌株的胞外多糖具有显著的体液免疫和细胞免疫增强活性。

蔡慧农等[6]发现放线菌ZJG1胞外多糖的发酵动力学类型属于“生长一产物合成耦合型”。

胡成旭等[7]认为用响应面法对云芝菌丝体多糖的提取条件优化合理可行，提高多糖的提取率。

超声波是一种高频机械波，超声场具有微扰、聚能、湍动和界面等效应[8]。

超声波常应用于提取植物中的苷类、生物碱、生物活性物质，研究发现超声波具有效率高、能耗低、还不破坏有效成分[9]。

鉴于此，本文
以细黄链霉菌菌株作为发酵菌种，在单因素的基础上，选取乙醇体积分数、乙醇沉淀时间、超声功率为因子，根据响应面法的中心组合试验，采用3因素3水平进
行试验，对细黄链霉菌胞外多糖提取工艺进行优化。

进一步检测细黄链霉菌胞外多糖对DPPH·和·OH消除作用。

旨在为放线菌胞外多糖发酵生产提供便利与基础。

1.1 实验材料
细黄链霉菌(Streptmyces microflavus)，商洛学院生物医药与食品工程学院微生
物实验室。

高氏一号(GA)培养基：可溶性淀粉 20g、NaCl 0.5 g、KNO3 1.0 g、K2HPO4 0.5 g、FeSO4 0.01 g、MgSO4 0.5 g、琼脂 20 g、蒸馏水 1 000 mL、pH值
7.2～7.4。

种子培养基：可溶性淀粉20g、葡萄糖 20 g、K2HPO4 1 g、(NH4)2SO4 20 g、MgSO4 1 g、CaCO3 0.3 g、NaCl 10 g、蒸馏水 1 000 mL、pH 7.4～7.6。

发酵培养基：可溶性淀粉 20 g、酵母膏10.0 g、葡萄糖 20 g、MgSO4 0.5 g、KNO3 1.0 g、K2HPO4 0.5 g、FeSO4 0.01 g，用1 000 mL蒸馏水溶解。

1.2 仪器与设备
GL-20G-H型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；UV755B型紫外可见分光
光度计, 苏州市莱顿科学仪器有限公司；LRH-150F生化培养箱，上海齐欣科学仪
器有限公司；ZHJH-C1109C超净工作台，上海智诚分析仪器制造有限公司；BCD-196FW/E海尔冰箱；RE-2000型旋转蒸发器，上海光学仪器厂；
SK8210LHC型超声波清洗机，广州沪瑞明仪器有限公司；ZHWY-1102C恒温培
养振荡器，上海向帆仪器有限公司；MJ-300B智能型霉菌培养箱，上海沪粤明科
学有限公司。

1.3 实验方法
1.3.1 细黄链霉菌发酵液的制备
将细黄链霉菌菌株28 ℃培养5 d的斜面菌种制成菌悬液按4%的接种量接种于种
子培养基中，28 ℃转速130 r/min培养3 d，然后以同一型号、规格的250 mL
三角瓶分装发酵培养基(100 mL)，按10%接种量接种发酵摇床130 r/min,28 ℃
培养7 d，备用。

1.3.2 细黄链霉菌胞外多糖浓度测定
将细黄链霉菌发酵液离心15 min(4 000 r/min), 取上清液，旋转蒸发浓缩，加3
倍体积的不同体积分数的乙醇, 4 ℃沉淀，再离心20min(5 000 r/min)，然后用氯仿与正丁醇的体积比为5∶1除蛋白，再用不同体积分数的乙醇沉淀，冷冻干燥得细黄链霉菌胞外多糖。

细黄链霉菌胞外多糖以蒸馏水稀释原体积(100 mL)100倍
溶解，用硫酸苯酚法测定细黄链霉菌胞外多糖浓度[10]，精密吸取2 mL多糖溶液于试管中，加入现配的浓度为6%苯酚溶液1 mL，迅速加入浓H2SO4 5 mL摇匀。

盛液试管于40 ℃水浴中恒温30 min。

冷却至室温后以试剂空白为参照，于490 nm波长处测定其吸光度，并代入回归方程计算细黄链霉菌发酵液产物胞外多糖浓度=C×100(C为根据标准曲线算出的细黄链霉菌多糖浓度)。

以葡糖糖的纯品配制
标准液，于490 nm波长处测定其吸光度，葡萄糖标准曲线方程为y=0.064 06x-
0.001 35(y-吸光度，x-葡萄糖浓度)，R2=0.996 86。

1.3.3 细黄链霉菌胞外多糖提取的单因素试验
(1)乙醇体积分数对细黄链霉菌胞外多糖浓度的影响
通过高氏1号发酵液发酵细黄链霉菌菌株，在料液比1∶30，提取温度为70 ℃，超声功率为420 W，超声时间为30 min，乙醇沉淀时间为12 h，考察分别为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇体积分数对提取细黄链霉菌胞外多糖的变化。

(2)乙醇沉淀时间对细黄链霉菌胞外多糖浓度的影响
通过高氏1号发酵液发酵细黄链霉菌菌株，在料液比1∶30，提取温度为70 ℃，
超声功率为420 W，超声时间为30 min，乙醇体积分数为70%，乙醇沉淀时间分别为4、8、12、16、20 h时，考察乙醇沉淀时间对提取细黄链霉菌胞外多糖的变化。

(3)超声功率对细黄链霉菌胞外多糖浓度的影响
通过高氏1号发酵液发酵细黄链霉菌菌株，在料液比1∶30，提取温度为70 ℃，超声时间为30 min，乙醇体积分数为70%，乙醇沉淀时间为12 h，超声功率分别为280、350、420、490、560 W时，考察超声功率对提取细黄链霉菌胞外多糖的变化。

1.3.4 响应面分析法试验设计
在单因素试验的基础上，选出乙醇体积分数、乙醇沉淀时间、超声功率3个主要因素，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计[7]，采用3因素3水平的进行试验条件优化，数据见表1，乙醇体积分数(A)、乙醇沉淀时间(B)、超声功率(C)为自变量，细黄链霉菌胞外多糖浓度(Y)为响应值。

设计响应面分析试验，3水平的编码记为-1，0，+1。

1.3.5 细黄链霉菌胞外多糖抗氧化活性测定
细黄链霉菌胞外多糖对·OH的清除的测定方法用邻二氮菲法参考文献[11]，细黄链霉菌胞外多糖清除DPPH的测定方法参考文献[12]。

1.4 数据处理
试验设计、模型建立、数据分析采用Design-Expert及SPSS 17.0分析中的单因素ANOVA。

2.1 提取细黄链霉菌胞外多糖的单因素试验
2.1.1 乙醇体积分数对细黄链霉菌多糖浓度的影响
由图1可见，在提取细黄链霉菌多糖的过程中，细黄链霉菌胞外多糖浓度随着乙醇体积分数的增大先升高后逐渐降低，并且乙醇体积分数为70%时，提取细黄链
霉菌胞外多糖浓度达到最高峰为4.68 g/L。

2.1.2 乙醇沉淀时间对细黄链霉菌多糖浓度的影响
由图2可见，在提取细黄链霉菌多糖的过程中，细黄链霉菌胞外多糖浓度随着乙醇沉淀时间的增加逐渐升高，当乙醇沉淀时间为12 h时，提取细黄链霉菌胞外多糖浓度达到最高峰位4.57g/L。

之后，随着乙醇沉淀时间的增加，提取细黄链霉菌胞外多糖浓度缓慢下降。

2.1.3 超声功率对细黄链霉菌多糖浓度的影响
由图3可见，在提取细黄链霉菌多糖的过程中，超声功率在280～420 W时，随着超声功率升高细黄链霉菌胞外多糖浓度缓慢增多，当超声功率为420 W时，提取细黄链霉菌胞外多糖浓度最高为4.63 g/L。

但是超声功率对细黄链霉菌胞外多糖浓度的影响较小。

2.2 响应面法对细黄链霉菌胞外多糖提取条件优化
2.2.1 Box-Behnken设计与试验结果
在单因素的基础上，综合考虑确定适宜的乙醇体积分数为70%，乙醇沉淀时间为12 h，超声功率为420 W，在此条件下以细黄链霉菌胞外多糖浓度(Y)为响应值，乙醇体积分数(A)，乙醇沉淀时间(B)，超声功率(C)为因素，采用软件Box-Behnken设计为3因素3水平，共17组试验，其中包括5次中心点(乙醇体积分数为70%，乙醇沉淀时间为12 h，超声功率420 W)的重复。

17组试验的各因素和响应面值(胞外多糖浓度)如表2所示，对数据进行二次回归拟合，分析各因素的效应，最后得到细黄链霉菌胞外多糖浓度的最优条件。

2.2.2 回归方程的建立与方差分析
利用软件Design Expert 7.0中Box-Behnken对表2实验结果进行回归分析，拟合得到细黄链霉菌胞外多糖浓度的回归模型为：Y=1.685A+11.896B+0.091 2C +1.000×10-3AB-6.429×10-5AC-5.786×10-3BC-0.012A2-1.561B2-
6.429×10-5C2-91.529。

表3是对回归方程进行方差分析。

由表3可见，回归方程模型P<0.001，表明该模型在95%水平上是极显著的，说明本试验方法是可靠的。

由P值可知，乙醇体积分数(A)，乙醇沉淀时间(B)，超声功率(C)对细黄链霉
菌胞外多糖浓度的影响为：B>A>C，回归模型的交互项AB、AC均有P>0.05，
则该项不显著；交互项BC有P=0.000 7<0.01，则该项极显著，二次项A2、B2、C2均有P<0.000 1，则该项极显著。

另外，失拟性的P=0.052 8>0.05不显著，可见模型较准确。

模型的相关系数R2=0.983 8，模型的调整相关系数，说明该模型有很高的可信度化，实验误差较小，因此该模型可以分析和预测细黄链霉菌胞外多糖浓度优化条件的结果。

2.2.2 Box-Behnken分析
图4～图6是因素(乙醇体积分数、乙醇沉淀时间、超声功率)交互影响的响应面图和等高线图。

响应面图的曲面越陡峭，说明因素对响应值影响越大[13]。

等高线是椭圆形的，说明两因素间交互作用显著，而等高线是圆形，则表示两因素间交互作用不显著[14]。

由图 4、图5、图6可见，3个响应面图均为开口向下的曲线，说
明响应值存在最大值。

图6的响应曲面图最陡，并且等高线图是椭圆形，说明乙
醇沉淀时间和超声功率对细黄链霉菌胞外多糖产量的交互效应最为显著，图4、图5的响应曲面图的陡度均比图6小，并且等高线图近似圆形，但图5比图4的响
应曲面图的陡度稍大，等高线图也稍扁点，说明乙醇体积分数和超声功率对细黄链霉菌胞外多糖浓度的交互效应次之(P>0.05)，乙醇体积分数和乙醇沉淀时间对细
黄链霉菌胞外多糖浓度的交互效应最不显著。

2.3 最佳工艺参数及验证
对超声波提取细黄链霉菌胞外多糖的二次多项式回归分析求极大值，得到超声提取细黄链霉菌多糖浓度的最佳工艺为：乙醇体积分数为70.32%，乙醇沉淀时间
12.06 h，超声功率为417.12 W，在此条件下，超声波提取细黄链霉菌多糖浓度
可达最大值4.945 g/L，结合最优工艺与实际生产，对各因素的取值进行调整，最终确定超声提取细黄链霉菌多糖浓度的最佳工艺为乙醇体积分数为70%，乙醇沉
淀时间12 h，超声功率为420 W，经5次重复实验验证，细黄链霉菌多糖平均浓度为4.938 g/L，与其在此条件下的预测值4.945 g/L接近，相差0.142%，因此，说明此响应面模型具有可行性。

2.4 细黄链霉菌胞外多糖对·OH的清除作用
细黄链霉菌胞外多糖对·OH的清除作用见图7。

由图7可见，细黄链霉菌胞外多
糖浓度在0.5～1.5 mg/mL对·OH的清除率不断增加，并且增加的幅度较大，而
细黄链霉菌胞外多糖浓度超过1.5 mg/mL时，对·OH的清除率增加的幅度较小。

2.5 细黄链霉菌胞外多糖对DPPH·的清除作用
细黄链霉菌胞外多糖对DPPH·的清除作用见图8。

由图8可见，随着细黄链霉菌
胞外多糖浓度的增加，胞外多糖对DPPH·的清除率也不断增强，并且细黄链霉菌
胞外多糖对DPPH·的清除效率较显著。

细黄链霉菌胞外多糖浓度为2.5 mg/mL时，胞外多糖对DPPH·的清除率(75.58%)比胞外多糖浓度为0.5 mg/mL时，胞外多
糖对DPPH·的清除率(8.93%)高8.5倍。

可见，细黄链霉菌发酵液中胞外多糖的抗氧化活性较强。

本研究的单因素试验得到超声波提取细黄链霉菌多糖的条件分别是乙醇体积分数为70%，乙醇沉淀时间为12 h，超声功率为420 W。

在单因素的基础上，利用Design-Expert 7.0软件的Box-Behnken响应曲面法，优化了超声波提取细黄链霉菌胞外多糖的工艺条件，建立了提取细黄链霉菌胞外多糖的二次多项式回归模型。

本研究结果表明，优化条件对提取细黄链霉菌胞外多糖浓度的影响效果为乙醇体积分数(A)>乙醇沉淀时间(B)>超声功率(C)，最终确定的最佳工艺为：乙醇体积分数
为70.32%，乙醇沉淀时间12.06 h，超声功率为417.12 W，超声波提取细黄链
霉菌多糖浓度为4.945 g/L。

从研究结果可以看出，Box-Behnken响应曲面法优
化的最佳条件比正交试验优化的条件更全面，因为响应面法不仅可以优化各因素的影响水平[15]、评估各因素的交互作用[16]，而且本试验的3因素交互作用影响提取细黄链霉菌胞外多糖直观地可以从响应面曲图表现出来。

用超声波辅助提取细黄链霉菌胞外多糖，可以缩短提取的时间。

细黄链霉菌发酵液的胞外多糖对·OH和DPPH·的均有较强的消除能力，表明细黄链霉菌发酵液的胞外多糖的抗氧化活性较强。

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