芝麻素对自发性高血压大鼠脑皮层氧化应激损伤的保护作用

芝麻素对自发性高血压大鼠脑皮层氧化应激损伤的保护作用卢毅宁;沈媛媛;杨解人
【摘要】目的:探讨芝麻素(sesamin,Ses)对自发性高血压大鼠(SHR)脑皮层神经元型一氧化氮合酶(nNOS)及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶亚单位
p22phox、p47phox蛋白表达的影响.方法:16周龄雄性SHR 35只,随机分为SHR[(0.5％羧甲基纤维素钠5 mL/(kg·d)]模型组,Ses高、低[160 mg/(kg·d)、80 mg/(kg·d)]剂量组,卡托普利30 mg/(kg·d)阳性组,每组7只.另设Wistar-Kyoto (WKY) 0.5％羧甲基纤维素钠5 mL/(kg·d)正常对照组7只,每日给药1次,连续灌胃12周.于末次给药后断头取脑,尼氏染色观察脑皮层神经元细胞病理变化并计数;比色法测定脑皮层组织MDA、H2O2、SOD及T-AOC的含量;硝酸还原酶法测定脑皮层组织NO含量;Western Blot法检测脑皮层nNOS、p22phox及p47phox 蛋白表达.结果:SHR模型组脑皮层存在组织损伤,神经元细胞排列疏松不均,形态不规则且细胞数量减少(P＜0.05);脑皮层组织MDA、H2 O2和NO增高,SOD、T-AOC明显降低(P＜0.05或P＜0.01);脑皮层nNOS、p22phox和p47phox蛋白表达上升(P＜0.05或P＜0.01).芝麻素给药12周后,芝麻素高、低剂量组对SHR 脑皮层病理性损伤均有不同程度改善,细胞数目增多(P＜0.05或P＜0.01),脑皮层组织MDA、H2 O2和NO减少,SOD、T-AOC明显升高(P＜0.05或P＜0.01);脑皮层nNOS、p22phox和p47phox蛋白表达明显下调(P＜0.05或P＜0.01).结论:Ses具有改善SHR脑皮层损伤的氧化应激作用,其机制与下调nNOS及
p22phox、p47phox蛋白表达有关.
【期刊名称】《皖南医学院学报》
【年(卷),期】2016(035)003
【总页数】5页(P214-218)
【关键词】芝麻素;脑皮层;神经元型一氧化氮合酶;NADPH氧化酶;氧化应激
【作者】卢毅宁;沈媛媛;杨解人
【作者单位】皖南医学院药理学教研室,安徽芜湖241002;皖南医学院药理学教研室,安徽芜湖241002;皖南医学院药理学教研室,安徽芜湖241002
【正文语种】中文
【中图分类】R285;R544.1
·基础医学·
【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.03.003
高血压是常见的威胁人类生命健康的疾病，主要损害人体重要靶器官心、脑、肾及血管。

文献表明[1]，脑部在高血压状态下，会发生不同程度的脑缺血或出血性病
变等高血压并发症,进而引起神经细胞损伤和脑血管病变，最终对大脑皮层造成损伤。

同时有文献报道高血压大鼠脑部存在氧化应激状态并造成脑损伤[2],提示氧化
应激在高血压脑损伤的发生发展中起重要作用，因此寻找具有抗氧化作用的脑保护药物具有重要意义。

芝麻素(sesamin，Ses)是从芝麻中提取的木脂素类化合物，
具有降血压、抗氧化、降血脂等[3-4]作用。

前期研究中我们发现，Ses可以降低
肾性高血压、肾性高血压伴高脂高糖饮食大鼠血压并缓解心脏、肾脏等靶器官的损伤[5]，其作用机制与其在靶器官发挥的抗氧化作用相关。

但关于Ses对SHR脑皮层损伤的保护作用是否与抗氧化应激有关未见相关报道。

故本研究采用SHR模型，观察Ses对SHR脑皮层的保护作用，并且通过研究nNOS及NADPH氧化酶亚
单位p22phox、p47phox等与氧化应激相关蛋白的表达来探讨其可能机制。

1.1 实验动物16周龄雄性SHR 35只和WKY 7只，体质量(340±20)g，许可
证号:SCXK(沪)2007-0005，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。

单笼饲养，保持温度22～25 ℃，相对湿度60%～70%，自然光照，定时进食和饮水，饲料
购于南京市江宁区青龙山动物繁殖场。

1.2 药品和试剂芝麻素(纯度93.7%)，分子式为C20H15O6，分子量354.34，批号P0315(北京兴百祥科贸有限公司)。

卡托普利(captopril，Cap)，25 mg/片，批号:09102411(常州制药有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD，编号：S0107)、总
抗氧化能力(T-AOC，编号：S0116)、丙二醛(MDA,编号：S0131)、过氧化氢
(H2O2，编号：S0038)、一氧化氮(NO，编号：S0021)及BCA蛋白检测试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所)。

nNOS抗体，编号：BA0360(武汉博士德生物科技有限公司)、p22抗体，编号：sc-20781、p47抗体，编号：sc-86190(Sant Cruz公司)。

辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG，编号：A0208，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG，编号：A0216，Tubulin抗体，编号:AT819(江苏碧云天生
物技术研究所)。

氟化聚偏乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)微孔转移膜(美国Millipore公司)。

1.3 实验分组及给药雄性16周龄SHR 35只，WKY 7只，适应性喂养2周。

SHR随机分组：SHR[0.5%羧甲基纤维素钠5 mL/(kg·d)，n=7]模型组、Ses高剂量[160 mg/(kg·d)，n=7]组、Ses低剂量[80 mg/(kg·d)，n=7]组、Cap[30
mg/(kg·d)，n=7]阳性对照组。

另设WKY[0.5%羧甲基纤维素钠5 mL/(kg·d)，
n=7]正常对照组。

每日下午5时灌胃给药1次，连续12周。

1.4 标本采集与组织处理于末次给药后，大鼠禁食12 h，麻醉，断头取脑。

取每组大鼠左脑，以冠状面切分为4段，分别置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于石蜡包埋；另取每组大鼠右脑皮层置于1.5 mL EP管中，用于制备10%组织匀浆；
并将剩余脑皮层-80 ℃保存，用于Western blot实验。

1.5 尼氏(Nissl)染色常规石蜡切片(5 μm)，放入60 ℃烘箱烤干2 h后，常规
脱蜡至水。

加入尼氏染色液5 min后，用蒸馏水冲洗两次后常规脱水、透明、中
性树胶封片，显微镜下观察大鼠脑皮层神经元细胞的变化，随后选取每组脑皮层各区切片，随机选取5个视野，在400倍光镜下进行细胞计数，取其均数进行分析。

1.6 生化指标测定BCA法测定组织蛋白浓度。

按试剂盒说明书分别以黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸比色法、二甲酚橙比色法和ABTS法测定脑组织匀浆SOD、MDA、H2O2和T-AOC的含量，硝酸还原酶法测定脑皮层组织匀浆中NO含量。

1.7 Western Blot法检测脑皮层nNOS、p22phox和p47phox蛋白低温提
取组织蛋白，BCA法测定蛋白浓度。

每孔上样60 μg蛋白，10%SDS-PAGE分离样品，转膜，封闭，再分别滴加Tubulin(1∶1000)、nNOS(1∶200)及
p22phox(1∶500)、p47phox(1∶200)一抗4 ℃过夜。

洗膜，二抗(1∶2000)室温孵育2 h。

洗膜后将高灵敏的ECL化学发光剂加到膜的正面，暗室压片曝光、显影。

胶片扫描后用Image J 1.43软件统计各组集成光密度值，并统计分析比较各组蛋
白表达差异。

1.8 统计分析实验数据以均数±标准差±s)表示，采用SPSS 16.0统计软件进行统计学检验。

多组均数比较采用单因素方差分析，两组间比较采用q检验，
P<0.05表示具有统计学意义。

2.1 Ses对SHR脑皮层的病理组织学影响尼氏染色结果显示，WKY组脑皮层
神经元细胞染色清晰，排列紧密、规则，形态完整；与WKY组相比，SHR模型
组脑皮层神经元细胞排列疏松不均，形态不规则，且细胞数量减少(P<0.05)，细
胞空染或淡染；与SHR组相比，Ses高、低剂量组及Cap组脑皮层神经元细胞排列较紧密，形态较规则，细胞空染或淡染均有不同程度的减少，其中Ses高剂量
组细胞数量显著上升(P<0.05)。

提示Ses具有改善SHR皮层损伤的作用(见图1，表1)。

2.2 芝麻素对SHR脑皮层组织匀浆T-AOC、SOD、MDA和H2O2的影响与
WKY组相比，SHR模型组脑皮层组织匀浆MDA和H2O2含量明显升高(P<0.05)，SOD和T-AOC含量明显降低(P<0.05)；与SHR模型组相比，Ses高、低剂量组
及Cap组脑皮层MDA及H2O2含量明显降低(P<0.05或P<0.01)，SOD和T-AOC含量明显升高(P<0.05或P<0.01)。

提示Ses具有抗SHR脑皮层氧化应激的作用(见表2)。

2.3 芝麻素对SHR脑皮层组织匀浆NO的影响与WKY组相比，SHR组脑皮
层组织中NO含量明显上升(P<0.05)。

与SHR组相比，Ses[160 mg/(kg·d)]组和Cap 组均有不同程度下降(P<0.05)，提示Ses可以降低SHR脑皮层中NO含量(见图2)。

2.4 Ses对SHR脑皮层nNOS蛋白表达的影响与WKY组相比，SHR组脑皮
层组织nNOS蛋白表达明显上调(P<0.01)；与SHR组相比，Ses 高、低剂量组和Cap 组nNOS蛋白表达均显著下调(P<0.01)。

提示Ses可以下调SHR脑皮层nNOS蛋白的表达(见图3)。

2.5 Ses对SHR脑皮层p22phox和p47phox蛋白表达的影响与WKY组相比，SHR组脑皮层p22phox和p47phox蛋白表达明显上调(P<0.01)；与SHR组相比，Ses 高、低剂量组和Cap组脑皮层p22phox和p47phox蛋白的表达不同程度地下调(P<0.05或P<0.01)。

提示Ses具有下调SHR脑皮层p22phox和
p47phox蛋白的作用(见图4)。

研究表明长期的高血压可导致SHR脑血管、脑皮层等部位发生结构形态、组织代
谢的损伤[6]，国外研究发现高血压对SHR脑皮层功能造成严重危害并引起紊乱[7]。

通过对饲养28周后的SHR脑皮层组织进行尼氏染色观察其形态改变发现其
脑皮层中神经元细胞形态不规则，排列疏松不均，且细胞数量减少，证实了高血压可引起SHR脑皮层发生损伤。

当SHR每天进行1次Ses灌胃给药，给药12周后，不同Ses剂量组大鼠脑皮层组织损伤得到不同程度改善，且细胞数得到不同程度
恢复，提示Ses具有改善SHR脑皮层损伤的作用。

当体内自由基的产生远高于氧化防御体系的保护能力时，体内自由基与抗氧化物质的平衡被打破，就会导致机体氧化应激并引起损伤[8]。

文献结果显示，SHR大鼠
脑组织自由基生成过多,抗氧化防御能力和自由基清除能力下降[9-10],最终导致SHR大鼠脑部发生氧化应激。

国外研究发现，高血压大鼠脑皮层存在氧化应激[11]。

因此本课题组制备脑皮层组织匀浆，发现SHR脑皮层组织自由基指标
MDA和H2O2含量明显高于WKY组，证明SHR脑皮层存在大量自由基；同时
发现SHR组大鼠脑皮层抗氧化能力指标SOD活性和T-AOC能力明显低于WKY 组，提示SHR脑皮层清除自由基和总抗氧化能力明显减弱，说明脑皮层存在氧化
应激状态。

经Ses治疗12周后，SHR脑皮层组织MDA和H2O2含量明显降低，SOD活性和T-AOC能力明显提高，提示Ses可改善SHR脑皮层的氧化应激状态。

但Ses具体是通过何种途径改善SHR脑皮层的氧化应激，有待于进一步研究。

故本课题组采用硝酸还原酶法测定脑皮层NO含量，同时用免疫印迹方法检测nNOS及NADPH氧化酶亚基蛋白表达，从nNOS-NO通路及NADPH氧化酶亚基p22phox和p47phox途径，探索Ses保护SHR脑皮层氧化应激损伤的可能
机制。

文献报道，在对SHR脑损伤的研究中发现持续的高血压状态可最终导致nNOS过量表达，并催化精氨酸产生过量NO[12]。

过量的NO可与超氧阴离子(O2-)反应
生成过氧亚硝基阴离子(ONOO-)等自由基进而引起氧化应激损伤。

本实验结果表明，SHR脑皮层组织中NO含量显著增高，且nNOS蛋白表达明显上调，表明SHR脑皮层nNOS蛋白过表达并生成过量NO，造成脑皮层氧化应激损伤。

经Ses给药治疗后，SHR脑皮层组织内NO含量下降，nNOS蛋白表达明显下调，
说明Ses可下调nNOS蛋白表达并抑制NO产生，调节nNOS-NO通路，改善SHR脑皮层氧化应激。

NADPH 氧化酶是体内氧化应激的另一重要来源,包括p22phox和gp91phox以及p47phox、p67phox等各种亚单位。

在病理状态或大量有害物质聚集等条件作用下,NADPH 氧化酶被激活从而造成高血压大鼠脑部自由基进一步蓄积[13]。

本实验结果发现SHR脑皮层p22phox、p47phox蛋白表达均显著上升，经Ses治疗后，SHR脑皮层p22phox、p47phox蛋白表达均不同程度下降，提示Ses可下调脑皮层p22phox、p47phox蛋白表达，调节NADPH氧化酶亚基p22phox 和p47phox途径引起的氧化应激。

综上所述，芝麻素可能通过抑制脑皮层nNOS-NO和NADPH氧化酶亚基
p22phox、p47phox所介导通路，降低脑皮层自由基含量，提高其抗氧化能力，进而对自发性高血压大鼠脑皮层氧化应激损伤起到改善作用，但其确切机制有待进一步研究。

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