石蜡切片

(1) 叶片横切结构玻片标本制备
①取材、固定：新鲜材料或腊叶标本材料均选取5片成熟完整的叶片，用解剖刀在叶片中部切取4mm×6mm大小的组织块（包括叶中脉在内），直接放入FAA固定液中固定48 h，使材料得到固定和软化。

②脱水：用65%→75%→85%→95%→100%→100%乙醇逐级脱水，每个浓度梯度脱水2h，100%乙醇时间减半，且分两次进行，第一次35min，第二次25min。

③透明：以二甲苯为透明剂，经2/3 无水乙醇+1/3 二甲苯→1/2无水乙醇+1/2 二甲苯→1/3无水乙醇+2/3 二甲苯→纯二甲苯，不断增加二甲苯的比例，逐级透明，每级透明时间为1h。

为使透明效果更好，可以用纯二甲苯透明两次，每次1h。

④浸蜡：先用低熔点的石蜡（52℃-54℃）在30℃下浸蜡24h，然后用混合石蜡（蜂蜡（熔点58℃-60℃）：低熔点切片石蜡＝1：9），在温箱中60℃保温浸蜡6h，每2h换一次混合石蜡。

⑤包埋：材料浸蜡结束后马上用镊子转移到装有液态上述混合石蜡的小纸盒中，并迅速冷却；使材料的轴性系统垂直于纸盒的底部，以便于蜡块的切修，做材料横切观察其横截面结构。

镊子在使用前应先预热，以免材料粘附在镊子上损坏材料。

⑥切片：根据材料在蜡块中的位置和方向，将蜡块修成梯形，然后粘到切片机的蜡台上进行切片。

本实验采用旋转式手摇切片机，切片厚度10μm，每个样品切20-30张切片。

⑦展片及粘片：在洁净的载玻片上均匀涂上少许蛋白甘油。

将蜡带小心地放在50℃的水面上，待蜡带展平后，用涂有蛋白甘油的载玻片将它捞起，使蜡带光面紧贴载玻片，然后在35℃温箱中烘干，使蜡带粘附在载玻片上。

⑧脱蜡和染色：二甲苯脱蜡后采用番红固绿复染法染色。

具体步骤如下：纯二甲苯（35℃，2-3h）→纯二甲苯→1/2 二甲苯+1/2 无水乙醇→无水乙醇→无水乙醇→95%乙醇→85%乙醇→75%乙醇→65%乙醇→番红染液（12h）→65%乙醇→75%乙醇→85%乙醇→固绿染液（0.3-0.5min）→95%乙醇→无水乙醇→无水乙醇→1/2 二甲苯+1/2 无水乙醇→纯二甲苯→纯二甲苯。

在从纯
二甲苯到番红染液到固绿染液再到纯二甲苯的过程中，除特殊注明以外，每个浓度梯度溶液中停留2-3min。

⑨封片：染色后的切片用中性树胶封片制成玻片标本，然后将玻片标本放入35℃温箱中烘干备用。