壳聚糖溶液pH对载细胞海藻酸钠_壳聚糖微胶囊性能的影响

Vol.27高等学校化学学报No.1 2006年1月 CHE M I CAL JOURNAL OF CH I N ESE UN I V ERSI TI ES 182～186

壳聚糖溶液pH对载细胞海藻酸钠2壳

聚糖微胶囊性能的影响

于炜婷1,刘袖洞1,李晓霞2,綦文涛1,任东文1,马小军1

(1.中国科学院大连化学物理研究所生物医学材料工程组,大连116023;

2.四川大学材料科学工程学院,成都610064)

摘要　以激光共聚焦扫描显微镜为研究手段,原位直观地考察了在不同pH条件下聚电解质膜的络合程度和蛋白扩散情况.通过分析pH值对微胶囊膜性能的影响规律,并结合不同种类细胞对环境pH的敏感特性,确定了制备细胞培养用海藻酸钠2壳聚糖微胶囊的最佳pH值.结果表明,当壳聚糖溶液的pH值由3150增加到6150,微胶囊膜的络合深度呈现高2低2高的趋势,而微胶囊膜的膨胀性能呈现低2高2低的趋势,模型蛋白通过微囊膜的扩散呈现低2高2低的趋势,拐点均出现在pH=4100和5150处.结合动物细胞及微生物细胞对环境pH耐受能力的考察,确定制备微囊化动物细胞时,微胶囊成膜反应溶液的最佳pH值为5150;制备微囊化大肠杆菌时,反应溶液的最佳pH值为5100;制备微囊化酵母菌时,反应溶液的最佳pH值为4150.

关键词　海藻酸钠;壳聚糖;pH;微胶囊;细胞培养

中图分类号　O636;R318108 文献标识码　A 文章编号　025120790(2006)0120182205

微胶囊通常是指外层为高分子膜,内部为三维网状结构的球囊.作为细胞的固定化载体,外层高分子膜的选择透过性能保证了微胶囊内外的物质交换,而内部空间结构提供了细胞贴壁的表面,在反应器中进行微囊化细胞培养时,外部搅拌可使其处于悬浮状态而剪切力不伤及细胞活性,从而将贴壁和悬浮培养的优点集于一身,因此,微胶囊在细胞大规模培养的基础研究和工业应用方面都得到广泛重视[1].我们曾利用天然多糖海藻酸钠和壳聚糖之间的聚电解质络合反应制备了海藻酸钠2壳聚糖(A lginate2chit osan,AC)微胶囊[2],其囊膜是由壳聚糖单体分子上质子化的氨基和海藻酸钠单体分子上的羧基间通过静电力或氢键形成的聚电解质复合膜[3],因此,壳聚糖溶液pH直接决定两种聚离子暴露的电荷基团及分子结构,从而对复合膜的形成、膨胀性能及通透性都有明显的影响.

本文重点考察了反应溶液的pH值对复合膜的膜厚、膜的膨胀性能及蛋白扩散性能的影响规律.对于囊内细胞而言,由于细胞对制备微胶囊过程中环境的pH比较敏感,因此,在考察反应溶液pH值对细胞活性影响规律的前提下,选择适宜的反应溶液pH值,对制备用于动物细胞或微生物细胞培养的AC微胶囊具有明确的指导意义.

1　实验部分

1.1　试剂与仪器

海藻酸钠(Sodiu m alginate,简写为alg,化学纯,青岛海藻工业公司);壳聚糖(Chit osan,简写为chi,M w=411×104,参照王勇等[4]方法改性);荧光素异硫氰酸酯(Fluorescein is othi ocyanate,简写F I TC,Sig ma产品);罗丹明异硫氰酸酯(Rhoda m ine B Is othi ocyanate,简写RB I TC,Sig ma产品);胰蛋白酶(Tryp sin,Sig ma产品);中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Ha m ster Ovary,简写CHO,本实验室保存);大肠杆菌(Escherichia coli DH5α,简写E.coli DH5α,本实验室保存),啤酒酵母菌(Saccha ro m yces cere2 visiae,简写S.cerevisiae,大连理工大学白凤武教授馈赠).

收稿日期:2004212224.

基金项目:国家自然科学基金(批准号:20236040)及国家“九七三”计划项目(批准号:2002CB713804)资助.

联系人简介:马小军(1958年出生),男,研究员,博士生导师,从事生物医用材料工程学研究.E2mail:maxj@

高压静电场发生器(中国科学院大连化学物理研究所自制[5]);激光共聚焦扫描显微镜(Confocal

Laser Scanning M icr oscope,简称CLS M ,德国Leica 公司,T CS 2SP2);激光粒度仪(美国Beckman 2Coulter 公司,LS 2100Q ).

1.2　实验过程

1.2.1　AC 微胶囊的制备及其膜厚的测量　参照文献[6]方法制备出海藻酸钙凝胶珠,将其与质量体积分数015%F I TC 标记后的壳聚糖溶液(pH 值分别为3150,4100,4150,5100,5150,6100,6150)成膜反应15m in,形成AC 微胶囊.CLS M 透射光和荧光(激发/发射:488/530nm )通道同时扫描,在不同显微镜视野下获取图像15幅,在10×10放大倍数下共获得微胶囊100～200个,选取透射光与反射光完全重叠且粒径均一的微胶囊,用CLS M 软件2Quantify/Pr of .分别读取40个微胶囊的膜厚,计算均值和标准差.

1.2.2　微胶囊膜膨胀度的测定　将AC 微胶囊用55mmol/L 柠檬酸钠溶液液化后,用激光粒度仪测定各组微胶囊的平均粒径,参照文献[7]方法按照下列方程计算膨胀度:

S w =D 3t -D 30

D 30×100%

式中,S w 为膨胀度,D t 为AC 微胶囊液化后的直径,D 0为海藻酸钙胶珠的直径.

1.2.3　微胶囊膜通透性能的测定　以RB I T C 标记的Tryp sin 为模型蛋白,将AC 微胶囊按体积比为1∶20加入到标记好的蛋白溶液中,用CLS M 以xyt 模式扫描,每30s 扫描一幅图像,共21幅.扫描结果用软件Quantify /Quant 记录单个微胶囊内荧光量增加的动态曲线,记录3组数据,并取平均值.

1.2.4　壳聚糖溶液pH 对动物细胞活性的影响　在96孔板中均匀接种CHO 细胞,生长过夜后,分别与pH 值为3150,4100,4150,5100,5150,6100和6150的壳聚糖溶液及生理盐水接触反应,15m in 后弃去溶液,用生理盐水洗涤3次后加入RP M I 21640培养液,培养过夜.以生理盐水作对照,用MTT 法计算各组细胞存活率,以8组重复数据取平均值.

1.2.5　壳聚糖溶液pH 对微生物细胞活性的影响　同等条件下获得8组处于对数生长期的大肠杆菌

E .coli DH5

α,经离心获得菌体细胞,分别加入pH 值为3150,4100,4150,5100,5150,6100和6150的壳聚糖溶液和生理盐水,15m in 后,用稀释平板法获得各组残余活细胞数,以生理盐水反应组为对照,计算各组细胞的存活率,3组重复数据取平均值.用同样方法测定不同pH 壳聚糖溶液对酵母细胞S.cerevisiae 存活率的影响.

F i g .1　M e m brane th i ckness and swelli n g degree of AC m i crocapsules a s a functi on of pH of ch itos an soluti on

2　结果与讨论

海藻酸盐分子链由甘露糖醛酸(Mannur onic acid,M )和古罗糖醛酸(Gulur onic acid,G )构成,其p K a 值分别为3138和3165[8],而壳聚糖的p K a 值为613[9]

.因此,当溶液pH 值发生变化时,海藻酸盐和壳聚糖的解离度、海藻酸盐分子链上的羧基和壳聚糖分子链上的伯氨基的电荷密度都会发生显著变化,从而对聚电解质成膜反应进行的程度和过程产

生影响,最终对微胶囊膜性能产生影响.

2.1　壳聚糖溶液pH 对壳聚糖分子成膜深度的影

响

当反应溶液的pH 值由3150增至4100时,pH

值接近海藻酸钠的p K a 值,海藻酸盐链节中

—COO -基团随pH 值的升高而增多,壳聚糖由于

其p K =613,在低pH 值范围内—NH +3较多,因而

成膜反应程度随着—COO -基团的增多而加深,表

现为微胶囊膜厚增加.当pH 值从4100增加到

5150,p K alg

在此区间,海藻酸盐链节中—COO -基团随pH 值3

81　No .1　于炜婷等:壳聚糖溶液pH 对载细胞海藻酸钠2壳聚糖微胶囊性能的影响