3-2 蛋白质改造和表达

避免产物降解 ：
分泌/融合表达
细菌蛋白酶抑制剂
提高表达水平的手段
2、选择合适宿主
Lac 启动子----LacI菌
PL/PR
--------
CI857 溶源菌
提高表达水平的手段
3、诱导表达
温度诱导------PLPR /
IPTG的化学诱导----Plac、Ptac
4、用蛋白酶缺失的宿主菌提高表达蛋
DNA聚合酶的选择
目前一般选择T4DNA聚合酶
存在于dNTP中的dUTP对离体DNA合成反应的影响
dCTP氧化脱氨可产生微量dUTP， dUTP渗入 到新生DNA链中后，受体菌中的尿嘧啶-N-糖基 化酶可在U的位置切断DNA链，降低突变体的产 率。
利用经HPLC纯化的高质量的dNTP可以降低U 碱基的错误搀入，降低突变产生的比率。
操纵子（operon）：是一组功能上相 关，受同一调控区控制的基因组成的 一个遗传单位
操纵子特点：
原核生物基因表达的基本单位（即一 个转录单位）。 共同协调作用，完成某一多肽的表达 调控。 包括：调控区(调节基因，启动基因， 操纵基因)、 结构基因
5、原核生物中参与转录的基因结构： 启动子 终止子
SD顺序与16srRNA3’末端互补程度。
AUG—SD间距离。
AUG后的核苷酸
影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素
4、转录终止区 5、mRNA的稳定性 6、蛋白质表达定位：胞内；细胞外周 质；细胞外分泌；胞质膜上；菌体表 面（外膜蛋白的膜外区，与鞭毛蛋白 菌毛蛋白融合、与脂蛋白或Lpp-OmpA 的N 端或C端序列融合）
影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素
9、培养条件的控制对表达效率的影响： 温度和培养基的变化影响不同RNA的翻译， 营养成分和培养参数影响蛋白酶的活性、 分泌和产量 培养基中添加甘氨酸能增强外周质蛋白 释放到培养基中，且不引起明显的细菌裂解
（二）原核表达载体
(1) (2) (3) (4) (5) (6) 复制起始点 选择性基因 强的、可诱导的启动子 强的转录终止序列 核糖体结合位点 合适的多克隆位点
大肠杆菌表达体系的应用
当外源蛋白质的分子量小于70kD,不存在半胱氨 酸或分子内的二硫键少于3～4个，以及不需要翻 译后修饰而能保持其生物活性的蛋白质，大多可 以利用大肠杆菌系统得到满意的结果。
大肠杆菌表达体系的缺点
1、不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修 饰，如糖基化、烷基化、磷酸化、特异性的蛋白 水解加工等； 而广泛二硫键的形成以及外源蛋白质组装成多亚 基复合体的能力也受到限制。 2、外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性的 包涵体；而当真核基因在大肠杆菌中表达时，作 为起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白质的N 末端。
一）融合型表达载体
Foreign DNA
P
SD
融合型表达载体
融合基因
技术关键： 克隆基因插入原核序列3’端而维持正确阅读框 架。 选择合适酶切位点 加入人工合成的DNA接头 构建位相载体
融合型载体----pGEX系列
Ptac：IPTG诱导
GST融合蛋白—直接纯化
产物切割方便：
终止子（terminator，T）:位于基因3’ 端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序 列
6 、与转译有关的原核细胞结构： —— 核糖体结合位点
转译起始密码子AUG 或GUG SD顺序（shine-dalgarno）：
•
• •
AUG上游3-11 bp
长约3-9bp mRNA与16s核糖体亚基间的识别与 结合序列
⑥ 受体细胞对突变体产率的影响 受体菌中的错配修复系统将产生的突变去除； 当用M13作为克隆载体时，由于M13 DNA可能出现 不对称复制，如果突变链的复制效率较低，则 最终将降低突变体的产率。 为了提高突变体的回收率，即提高突变效率，利用 点错配修复缺失的菌株为受体菌可使突变产率 提高近10倍。
1. 具转录后加工系统
2. 具翻译后修饰系统 3. 可实现真正的分泌表达
4.基因治疗
真核基因结构及表达调控特点
（一）真核基因组的复杂性 真核基因组庞大，具大量非编码序 列 ---mRNA丰度不同 结构复杂：染色质、核膜、线粒体--表达调控多样 不连续性：内含子、外显子 没有操纵子结构
启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合 酶识别、结合并启动基因转录的一段 DNA序列。
• 一般长40-60bp，富含A-T碱基对
• 具有保守序列：
-10区（pribnow box）：TATAAT
-35区：
RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录 各种启动子启动转录能力不同。
启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔 序列
关于DNA模板的制备


寡核苷酸突变引物的设计和选择
寡核苷酸突变引物与DNA模板的退火和引物延伸条件 DNA聚合酶的选择 存在于dNTP中的dUTP对离体DNA合成反应的影响 受体细胞对突变体产率的影响
关于DNA模板的制备
双链DNA模板：质粒 单链DNA模板：M13噬菌体载体，足够纯净(避免 RNA污染)
信号肽序列 ： SD 下游，编码信号肽， 引导蛋白跨膜 2、优点：分泌表达，避免降解。 可
分泌型表达载体----pINIII-ompA1
分泌型融合表达载体----pEZZ18
（三）．提高表达水平的手段 1、选择合适载体，提高翻译水平 强启动子----提高转录水平 核糖体结合位点（ATG---SD）
(2) 几种寡核苷酸介导的基因突变方法
① Kunkel 突变法 ② 基于抗生素抗性“回复”的突变方法
③ 基于去除特定限制酶切位点的突变
④ 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变
① Kunkel 突变法
② 基于 抗生 素抗 性回 复的 突变 方法
③ 基于去除特定限制酶切位点的突变
④ 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变
③ 寡核苷酸突变引物与模板DNA的退火和引 物延伸条件 退火条件：
突变引物与模板DNA的摩尔比为10－50；退火通 常将二者混合物加热到Tm值以上20度，然后再 缓慢冷却到室温；对于A＋T含量高的引物，为 保证退火安全，加热后可冷却到较低温度，以 稳定模板和引物复合体。 引物延伸条件： 退火完成后加入4种脱氧核苷三磷酸，DNA聚合酶、 DNA连接酶等，进行2-15小时的延伸反应。
第三节 重组蛋白质的表达
•
一．表达系统：
基因工程中用来获得有功能的异源蛋白 质的体系，包括克隆载体，表达载体及 受体细胞。
根据受体细胞的不同可分为：
1．原核表达系统(大肠杆菌)：
将外源基因引入原核细胞，并使其在原 核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合 成基因产物的体系。
2．真核表达系统（哺乳动物细胞）： 使 外源基因在真核细胞中表达的体系
3、高表达时易折叠错误
4、本身含有内毒素和有毒蛋白
5、由于真核mRNA的结构特性以及密码子使用频率与 大肠杆菌本身的差异，当用真核mRNA的序列直接 在大肠杆菌细胞中表达时，有时不能得到足够的 产物
（一）影响外源基因在原核细胞 中表达效率的因素
1、启动子：建立表达载体时，选择强启动子。
影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素
PCR flash
2．区域性定向突变
基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变， 也可以产生区域性的突变。 • 常用的方法如盒式突变法(cassette mutagenesis)，又称 片段取代法(DNA fragment replacement)。 • 盒式突变的具体操作是利用目标基因中所具有的适当的限 制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混 合序列)的DNA片段来置换或取代目标基因上的一段DNA 序列。
三．外源基因在原核表达系统中表达 的必要条件：
1.
2. 3. 4.
删除内含子和5’非编码区
外源基因置于强启动子、终止子、SD 序列控制之下 维持正确开放阅读框架（ORF） mRNA稳定且可进行有效转译和蛋白 质折叠，外源蛋白不被降解
四、大肠杆菌表达体系
大肠杆菌(E.coli)表达体系是目前应用最广 的一个外源基因表达体系，是外源基因表达 的首选体系。 利用大肠杆菌作为表达体系的优点：遗传学 和生理学背景清楚；技术操作简单，培养条 件简单，发酵经济；外源基因经常可以达到 高效表达。
寡核苷酸突变引物的设计和选择 引物特征： 具有和模板DNA的互补区； 足够长，能与目标DNA序列退火； 突变引物应尽可能避免形成稳定二级结构的回文 序列、重复序列或自身互补序列； 突变引物不能与目标DNA的其它区域和载体DNA 形成稳定的杂交体。 引物设计取决于所要产生的突变类型： 用于单个核苷酸改变的引物，一般长度为17－19 个核苷酸； 多处改变核苷酸或改变2个以上，一般长度为25 个核苷酸以上。
第二节 蛋白质改造的分子生物学途径
基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改 造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。 根据其特点，可将基因突变分为两大类：位点特异性突变和随机 突变。 位点特异性突变又可大体分为三种类型：一类是通过寡核苷酸介 导的基因突变；第二类是盒式突变或片段取代突变；第三类是 利用聚合酶链反应(PCR)，以双链DNA为模板进行的基因突变。 PCR技术的出现为基因的突变，基因的剪接开辟了一条极其有效、 极其快捷的道路。当然无论哪种方法都可以在为蛋白质编码的 基因序列上产生插入、缺失、取代等突变。
常见原核强启动子： Plac：受Lrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。
Ptac :Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。
PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受λ 噬菌体CI基因负调控。温度诱导。
影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素
2、基因剂量：
3、核糖体结合位点：
白的稳定性，防止被宿主降解
（四） 改善外源蛋白溶解性的方法
① ② ③ ④ 外源蛋白的分泌表达 细菌生长温度 外源蛋白与分子伴侣和折叠酶共表达 外源蛋白与相关蛋白或蛋白标签融合
五)．表达产物的检测：
1、特异性鉴定：
荧光抗体法 免疫沉淀法 免疫印迹法 ELISA
2、生物学活性鉴定
四、真核表达系统的必要性及优势
7、密码子的偏好性 8、宿主选择对表达的影响 BL21: Ion、 ompT蛋白酶缺陷 BL21(DE3)： Ion、 ompT蛋白酶缺陷，T7聚 合酶基因 Rosetta 2:携带pRARE2的BL21衍生菌，补充7 种稀有密码子对应的tRNA
Origami 2: K-12衍生菌，trxB、gor双突变， 提高二硫键形成几率 Rosetta-gamiTM 2 Origami B：lacZY 突变的BL21菌株， 根据 IPTG的浓度精确调节表达
1．寡核苷酸介导的位点特异性突变
这类突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介 导下进行的，也称为专一性位点突变。这种突变 的方法从问世至今不断更新，特别是PCR技术出 现后变得更高效。
(1) 寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 (2) 几种寡核苷酸介导的基因突变方法
(1)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素
盒式突变的两个关键问题：
目标基因中要有适当的限制性内切酶识别位点。 对于天然蛋白质来说，其所含可供利用的限制 性内切酶识别位点很少，可利用遗传密码的简 并性在不改变氨基酸序列的前提下，产生合适 的限制性内切酶位点，便于盒式突变的操作。
用于取代目标基因中特定DNA片段的突变 DNA片段的获得。目前利用PCR技术可产生 具有特定限制性内切酶位点的、具有各种突变 位点的盒式突变DNA片段
pGEX-1T—凝血酶
pGEX-2T---凝血酶
pGEX-3T---X因子
位相载体
二） 非融合型表达载体
Foreign DNA
P
SD
非融合型表达载体
非融合基因
非融合型表达载体----pPL-Lamda
PL启动子---温度 诱导
插入位点--HpaI
三）分泌型表达载体：
1、主要元件：
启动子和SD序列
二．原核生物基因结构和表达特点
1. 原核生物染色体DNA是裸露的环 形DNA，其转录和翻译是偶联的 连续进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统 4 、原核生物中功能相关的基因串联在 一起，形成操纵子。