植物水孔蛋白研究进展
植物中的水孔蛋白
植物中的水孔蛋白目录1、植物中的水孔蛋白简介2、植物水孔蛋白的发现3、植物水孔蛋白的结构及生化特性4、植物水孔蛋白的分类5、植物水孔蛋白的功能5.1水孔蛋白促进植物体内水分运输的功能5.2水孔蛋白对细胞的渗透调节作用5.3参与气孔运动5.4参与光合作用5.5调节植物对中性分子(甘油、NH 、尿素)和营养元素(硼、硅)的吸收5.6参与开花生理5.7参与果实的发育与成熟、种子的成熟与萌发5.8还参与栓塞的修复5.9还能防止渗透伤害6、水孔蛋白的调控6.1基因表达6.2翻译后修饰6.3调控6.3.1转录水平调控6.3.2磷酸化调控6.3.3 pH调控6.3其他调节机理7、水孔蛋白与植物抗旱性、抗盐性一、植物水孔蛋白简介水孔蛋白(aquaporin，AQP)是指细胞膜上能选择性地高效转运水分子的膜内在蛋白，属于MIP(major intrinsic protein)超家族，分子质量在23～31 ku[1]．1988年，Agre研究小组最先从人红细胞质膜中分离得到水孔蛋白CHIP28蛋白，即AQP1[2]．1992年他们在爪蟾卵母细胞表达系统中对所得蛋白质进行功能鉴定，第一次从分子水平证实细胞膜上存在蛋白质介导的水分跨膜转运[3]．1993年，Maurel等[4]从拟南芥中分离得到第一个植物水孔蛋白γ-TIP．迄今，已在真细菌、古生菌、真菌、动物和植物等几乎所有生物中发现AQP[5]．AQP的发现及其结构和功能的研究，为人们从分子水平认识和阐明细胞内水分运输及其调控的分子机制奠定了基础．本文着重就植物AQP的多样性与分类、结构特征、生理功能、活性调节及基因表达调控等方面的最新研究进展作简要综述．二、植物水孔蛋白的发现在植物中发现水孔蛋白并不是由于寻找有水分转运活性的蛋白，或者研究植物水分生理的结果。
而只是因为这些蛋白在细胞膜上丰度比较高而发现了这些膜内在蛋白(MIP,major intrinsic membrane protein)。
水孔蛋白——精选推荐
⽔孔蛋⽩1 ⽔孔蛋⽩的发现⼈们⾸次在脊椎动物中发现了⽔孔蛋⽩。
1 987年，Agre等分离了红细胞Rh⾎型抗原中跨双分⼦层的多肽成分，在⽤考马斯亮蓝染⾊时，有⼀种28 kD的多脯着⾊很少。
起初他们认为这种多肽是Rh细胞的蛋⽩⽔解⽚段随后，Den ker等”对这种多肽进⾏了⽣物化学鉴定，最初的研究表明这种蛋⽩质由疏⽔性氨基酸组成，并以两种形式存在：28 kD的未糖基化的多肽和40～60 kD的N⼀糖基化的多肽。
后来⼈们把这种独特的多脯命名为⽔孔蛋⽩⼝。
早在2O世纪60年代初，Ray：”和Dainty[ 就发现在植物膜中可能存在⽔通道。
后来在植物中分离了许多⽔孔蛋⽩。
2 ⽔孔蛋⽩的结构晶体学和拓扑学的研究表明，⽔孔蛋⽩具有MIP家族典型的结构特征，由5个短环连接的6个亲⽔的跨膜螺旋及N端和C端组成。
其N端和C端及B、D环⾯向细胞质⼀侧。
⽔孔蛋⽩在跨膜区及B、E环的氨基酸序列相对保守，⽽N端和C端的变化相对较⼤。
B、E环各⾃含有⼀段⾼度保守的氨基酸序列Asn—Pro．Ala，称为NPA盒，它们直接参与了⽔通道的形成；同时B环和E 环各⾃形成半个跨膜螺旋(HB、HE)，参与⽔孔蛋⽩活性的调控(Chaumont等2005)。
E环NPA盒前的半胱氨酸是⽔孔蛋⽩的汞抑制部位；汞离⼦和有机汞可以通过与半胱氨酸结合⽽封闭⽔通道。
虽然研究表明⽔孔蛋⽩单体即有⽔通道的活性，但在活体⽣物膜上通常以四聚体的形式存在，组成⽔漏状结构(侯彩霞等1997；于秋菊等2002)。
也有少数以⼆聚体或单体形式存在(朱美君等2000)。
⽔孔蛋⽩的活性受PH值、Ca2+、重⾦属离⼦(HgC12、AgNO3和HAuC14)、磷酸化、多聚化和异源蛋⽩间相互作⽤等影响(Niemietz和Tyerman2002；Fetter等2004；Kaldenhof和Fischer 2006；Hedfalk等2006)。
⽣长激素(脱落酸、⾚霉素、油菜内酯)、蓝光、盐分、⼲旱及病原微⽣物的侵染也均能诱导⽔孔蛋⽩基因的表达。
细胞膜上的水通道蛋白
细胞膜上的水通道蛋白作者：Marokko摘要：物质的跨膜运输是细胞维持正常生命活动的基础之一。
主要分为被动运输，主动运输，胞吞作用及胞吐作用。
但是事实上细胞的物质转运过程中，透过脂双层的简单扩散现象很少，绝大多数情况下，物质是通过载体或者通道来转运的。
离子、葡萄糖、核苷酸等物质有的是通过质膜上的运输蛋白的协助，按浓度梯度扩散进入质膜的，有的则是通过主动运输的方式进行转运。
而维持细胞之间的跨膜运输的膜转运蛋白则主要分为载体蛋白与通道蛋白。
其中通道蛋白(channel protein)是跨膜的亲水性通道,允许适当大小的离子顺浓度梯度通过,故又称离子通道。
有些通道蛋白长期开放,如钾泄漏通道;有些通道蛋白平时处于关闭状态,仅在特定刺激下才打开,又称为门通道(gated channel).而水扩散通过人工膜的速率很低,所以人们推测膜上有水通道.1991年Agre发现第一个水通道蛋白CHIP28 (28 KD )，目前在人类细胞中已发现的此类蛋白至少有11种,被命名为水通道蛋白（Aquaporin,AQP)。
水通道蛋白广泛存在于生物体中的各组织部位，影响着生物机体水代谢的过程。
随着分子生物学技术的进步，对水通道蛋白的基础研究已经比较深入和成熟。
目的可以利用水通道蛋白研究的基础成果，阐释临床水代谢障碍类疾病的发病机理提供可能的解决思路。
关键词：跨膜运输，通道蛋白，水通道蛋白正文：包括人类在内的大多数生物都是由细胞组成的。
单个细胞就像一个由城墙围起来的微小城镇，有用的物质不断被运进来，废物被不断运出去。
早在100多年前，人们就猜测细胞这一微小城镇的城墙中存在着很多“城门”，它们只允许特定的分子或离子出入。
这就是细胞之间的跨膜运输。
物质的跨膜运输主要分为被动运输，主动运输，胞吞作用及胞吐作用。
而事实上细胞的物质转运过程中，透过脂双层的简单扩散现象很少，绝大多数情况下，物质是通过载体或者通道来转运的。
下图分别为载体蛋白与通道蛋白。
植物水通道蛋白生理作用的研究进展
输通 道 ， 导胞 内或胞 间 的水 分跨 膜运 输 。调节 植物 体 内的 介 水分 快速 平 衡 ，对 于提 高植 物抗 盐 及抗 旱 性可 能发 挥 着 重
要作 用 。本文 主要 对植 物水 通 道蛋 白的发 现 、 型 、 构 、 类 结 生 理作 用等方 面作 一 些简 单介 绍 。 １ 植物水 通道 蛋 白的 发现 植 物 中 第 １个 水 孔 蛋 白 ２ Ｔ Ｐ是 由 Ｍａ ｒｌ 人 于 一 Ｉ ｕｅ 等
些 膜 蛋 白的单体 分子 量在 ２ － ０ Ｄ 之 间 ，由 ６个跨 膜 结构 ３３ｋ 域 （ 过 五个亲 水环 相连 ） 通 和两 端短 的 ＮＨ２、 端组 成 （ １ Ｃ 图
［ ４ １
、
基端 的 Ｂ环 和 Ｅ环 各有 由 ３个氨 基 酸 （ 冬 酰氨 一 氨 酸 一 天 脯 丙氨 酸 ） 成 的基 元 ， 是 该 蛋 白家 族 成 员共 有 的高 度 同源 组 这
种 子 及 向 日葵 下 胚 轴 薄 壁 细 胞 等 多 种 植 物 中都 发 现 了
ＡＱＰ 。 ｒ ￣
２ 植物 水通道 蛋 白的 结构 特点
植 物 ＡＱＰ的结 构与 动物 ＡＱＰ一样 ，同属 于一 个 古 老
的跨膜 通道 蛋 白 ＭＩ （ ｍｂａ ｅ ｔ ｎｉ ｒｔｉ） Ｐ ｍｅ ｒｎ ｒ ｓ ｐｏｅ 超家 族 。 ｎ ｉ ｉ ｃ ｎ 这 图 ２ 植 物 ＡＱＰ １单体 结构 的 沙漏模 式嘲
的特 征 性 结 构 。 Ｂ环 和 Ｅ环 上 的 １９位 点和 ７ ８ ３位 点均 为
图 ２］。 些氨 基酸 残基 在 不 同的 ＡＱＰ中很 保 守 ， ｔ 一 ｓ ） 例如 位
《唐古特白刺水孔蛋白NIP家族基因调控植物响应环境胁迫的分子机理研究》范文
《唐古特白刺水孔蛋白NIP家族基因调控植物响应环境胁迫的分子机理研究》篇一一、引言植物作为地球上最重要的生物之一，其生存环境经常受到各种环境胁迫的影响，如干旱、盐碱、寒冷等。
为了适应这些环境变化，植物进化出了一套复杂的响应机制。
近年来，随着分子生物学和基因工程技术的飞速发展，植物对环境胁迫的响应机制逐渐被揭示。
其中，唐古特白刺水孔蛋白NIP家族基因在植物响应环境胁迫的过程中发挥了重要作用。
本文旨在探讨唐古特白刺水孔蛋白NIP家族基因调控植物响应环境胁迫的分子机理。
二、唐古特白刺水孔蛋白NIP家族基因概述唐古特白刺水孔蛋白NIP家族是一类重要的植物膜蛋白家族，具有调节植物细胞内水分和溶质运输的功能。
该家族基因在植物中广泛分布，对植物的生长和发育具有重要影响。
在环境胁迫条件下，NIP家族基因的表达水平会发生显著变化，从而影响植物的适应性。
三、NIP家族基因的调控机制1. 基因表达调控：NIP家族基因的表达受多种内外因素的调控，包括光照、温度、水分等环境因素以及激素、转录因子等生物因素。
这些因素通过调控NIP家族基因的转录和翻译过程，影响其表达水平。
2. 蛋白相互作用：NIP家族蛋白与其他蛋白之间的相互作用也是调控其功能的重要方式。
例如，NIP家族蛋白与AQP（水通道蛋白）等其他膜蛋白之间的相互作用，可以影响细胞膜的通透性和水分运输效率。
3. 信号转导：在环境胁迫条件下，植物会通过一系列的信号转导途径来响应。
NIP家族基因作为信号转导途径的重要节点，可以接收并传递环境胁迫信号，从而调控相关基因的表达和植物对环境胁迫的适应性。
四、唐古特白刺水孔蛋白NIP家族基因在响应环境胁迫中的分子机理1. 干旱胁迫：在干旱条件下，NIP家族基因的表达水平会显著提高，从而促进植物细胞对水分的吸收和运输。
此外，NIP家族蛋白还可以与其他膜蛋白相互作用，提高细胞膜的通透性，进一步促进水分的运输。
2. 盐碱胁迫：盐碱胁迫会导致植物体内离子平衡失调，影响植物的正常生长。
水孔蛋白
植物水孔蛋白研究进展摘要: 孔蛋白(Aquaporins,AQP)是新近发现的一组与水通透有关的细胞膜转运蛋白, 广泛存在于动物、植物及微生物细胞膜上.植物水孔蛋白在植物体内形成水选择性运输通道,在植物种子萌发、细胞伸长、气孔运动、受精等过程中调节水分的快速跨膜运输。
有些水孔蛋白还在植物逆境应答中起着重要作用,因此研究水孔蛋白与植物抗旱性的关系引起了广泛关注。
关键词:植物水孔蛋白;水分运输;逆境应答；磷酸化植物的生存、生长发育有赖于水分的供给，但在植物水孔蛋白发现以前，人们并不十分了解植物水分跨膜运输的机制。
水孔蛋白( aquaporin，AQP) 是一种功能性的跨膜输水蛋白，属跨膜通道的膜内在蛋白( membrane intrinsic protein，MIP) 家族，实现水分的跨膜运输。
MIP 是一类同源性很高的家族蛋白，具有转运水、甘油、小分子溶质的功能。
当植物体处于干旱、盐碱等胁迫状态时，体内各组织间的水分平衡被打破，水孔蛋白在水分运输和胞内渗透压的调控等方面发挥着重要作用。
1 水孔蛋白的概述1988年，Agre研究小组从人的红细胞膜上分离得到CHIP28蛋白，随后他们用爪蟾卵母细胞表达系统证实CHIP28具有水通道功能，第1次从分子水平上证实蛋白质介导水分的跨膜转运(Denker等1988;Preston等1992)。
1997年基因组命名委员会正式将CHIP28命名为AQPI。
现在已经知道，水孔蛋白(aquaporin，AQP)是一类介导水分快速跨膜转运的膜内在蛋白，属于MIP(majorin-rinsicprotein)家族，分子量在26~34切a(Fr妙sse等2005)。
水孔蛋白几乎存在于所有的生物体内，包括人、动植物、酵母和细菌等，是一类古老的膜蛋白(Borstlap2002;Gustavsson等2005)。
AQP 在植物中分布广泛，具有丰富的多样性．到目前为止，在拟南芥、烟草、菠菜、马铃薯、胡萝卜、玉米、水稻等许多植物中都发现了AQP ．AQP 是由多基因家族编码的．在拟南芥中已发现有35 个基因编码AQP，而玉米和水稻中也存在33 个AQP 基因．最近在非维管束植物球蒴藓(Physcomitrella patens)中发现有23 个AQP 基因．根据氨基酸序列的同源性及结构特征，通常将植物AQP 分为 5 类：质膜内在蛋白(plasmamembrane intrinsic proteins，PIPs) 位于质膜上，分为PIP1、2、3 三个亚类；液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins，TIPs) 处于液泡膜上，分为α、β、γ、δ和ε-TIP五个亚类；类Nod26 膜内在蛋白(nodulin 26-like intrinsic proteins，NIPs)存在于根瘤菌和豆科植物的共生膜上；小分子碱性膜内在蛋白(small and basic intrinsic proteins，SIPs)，分为SIP1 和SIP2 二个亚类；以及类GlpF(glycerolfacilitator)膜内在蛋白(GlpF-like intrinsic proteins，GIPs)2水孔蛋白的结构水孔蛋白与膜内在蛋白(membrane intrinsicprotein, MIP)具有很高的序列同源性和结构相似性,于是将其归类为MIP 家族。
水孔蛋白ppt
(a) 螺旋的正电荷极性部分约束通过 通道的水分子的取向,使质子不能通 过;
（二）转运机理
由于与NPA 之间的van der Waals 作用,孔螺旋HB 和HE 被 保留在膜的中间;在主链NH 基团 和NPA 基序的Asn 羧基之间存在 的氢键作用结束于短孔螺旋的N 端。这就导致Asn76 和192 被定 位伸向孔中。水分子中的氧与氨 基酸基团形成氢键,而代替相互 之间形成的氢键。
•
水分子
水分跨膜移动途径示意图
类脂
水通道蛋白图
水孔蛋白
1AQP的发现 2AQP的功能 3AQP的结构
4AQP的调节机制
AQP的发现
1920 年代以前,人们认为水分子以扩散机理通过细胞膜,但水凭借扩散方式 通过细胞膜的通量很低以及活化能很高,难以解释水分子以很快的速度大量 通过细胞膜的现象。 1950年代，人们发现水分子可以很快地通过选择性通道进入红细胞，而其 他溶质分子和离子则不能通过红细胞膜。 此后三十年研究表明，细胞膜上的水通道是一种具有高度选择性的过滤器， 在渗透梯度的驱动下，允许水分子通过，而质子则不能通过。 1988年，阿格雷从红细胞和肾小管中分离出一种功能为治的新的膜蛋白--CHIP28（AQP1）。 1991年，经过N2段肽链测序和整个cDNA序列测定获得了蛋白质的氨基酸 序列结构，证实了这就是一直寻求的水通道。 阿格雷与他的合作者用高分辨成像技术研究AQP水通道膜 蛋白，并在2000年公布了世界第一张分辨率为0.38纳米的高清晰度立 体结构图。
二、结构特征 （一）基因结构
AQP家族由一个基因组 进化而来，典型的AQP 基因结构含有一个较大 的外显子编码AQP的氨 基端半侧分子和四个较 小的外显子编码AQP的 羟基端半侧分子。
植物质膜内在水通道蛋白PIPs的分子生物学研究进展
植物质膜内在水通道蛋白PIPs的分子生物学研究进展何勇清;方佳;余敏芬;方仲相;江波;潘寅辉;郑炳松【摘要】Water is an important component in plant cells with plant aquaporin being the major protein for water transport in and between plant cells. As a subfamily of plant aquaporins, the plasma membrane intrinsic proteins (PIPs) located in the plasma membrane are classic, high water, selective channel proteins. This paper focuses on recent advances in the molecular biology of PIPs concerning structural characteristics, biological function, and a regulation mechanism. PIPs possess two highly conserved domains; GGGANXXXXGY andTGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VFWF/YN. PIPs can also be divided into two phylogenetic subgroups named PIP1 and PIP2. PIP1 possesses longer N terminal sequences and shorter C terminal sequences than PIP2 with con served amino acid sequences respectively. Studies of transgenic plants and expression in Xenopus oocytes cells indicate that PIPs not only may facilitate transport of water and small neutral solutes like CO2 and glycerin, but they also possess many physiological functions. The functions of plant aquaporins are regulated by many factors including post-translational modification, heteromerization, pH value, and divalent cations. These results indicated that PIPs act as a pivotal role in water and small neutral solutes transport in plants. [Ch, 1 tab. 51 ref.]%水是植物细胞的重要组成成分,植物水通道蛋白是细胞间和细胞内水分快速运输的主要通道,作为植物水通道蛋白的一个亚类,质膜内在蛋白PIPs定位于原生质膜,为典型的高水分选择性通道蛋白.主要介绍了PIPs的结构特征、生物学功能及其调控机制.高等植物PIPs存在2个高度保守的区域:GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VFWF/YN.PIPs 分为PIP1和PIP2亚类,PIP1比PIP2具较长的N-端和较短的C-端,并且具有各自的保守氨基酸.通过转基因和非洲爪蟾卵Xenopus oocytes母细胞异源表达研究表明PIPs不仅是水和二氧化碳、甘油等中性小分子选择性通道蛋白,同时还具有许多生理功能,是一类多功能蛋白.蛋白翻译后修饰、异聚化、pH值、二价阳离子等都能调控PIPs的运输功能.【期刊名称】《浙江农林大学学报》【年(卷),期】2012(029)003【总页数】7页(P446-452)【关键词】植物学;质膜内在蛋白;功能;调控机制;综述【作者】何勇清;方佳;余敏芬;方仲相;江波;潘寅辉;郑炳松【作者单位】浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地,浙江临安311300;浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地,浙江临安311300;浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地,浙江临安311300;浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地,浙江临安311300;浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地,浙江临安311300;浙江省龙游县林业局,浙江龙游324400;浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地,浙江临安311300【正文语种】中文【中图分类】Q74;S718.3水分对于植物的生长、发育和繁殖是非常重要的。
水孔蛋白-贾玉辉
对 照
NaCl处 理Fra bibliotekConclusion
We therefore hypothesized that the faster kinetics of recovery may reflect an enhanced cycling of the AtPIP-GFP constructs. By comparison with the control, a slight but not significant increase was observed under salt conditions. These results suggest that the rates of AtPIP-GFP cycling (endocytosis and exocytosis) were simultaneously increased under salt stress, leading to a faster targeting to the PM.
Urban Johanson ,Sofia Gustavsson.A New Subfamily of Major Intrinsic Proteins in Plants. Mol Biol Evol (2002) 19 (4): 456-461.
2004 Blackwell Publishing Ltd, Plant, Cell and Environment, 28, 85–96
Fluorescence recovery after photobleaching reveals high cycling dynamics of plasma membrane aquaporins in Arabidopsis roots under salt stress. The Plant Journal ,2011 Blackwell Publishing Ltd
植物水分的吸收及其利用效率的研究进展
大， 细胞 膜对 水 的正 常通透性 低 ， 细胞 有极 高 的转 移 Ｒ Ａ的能力 ， 多 以爪 蟾 卵细 胞 作 为基 因异 源表 达 Ｎ 故 系统 ， 为研 究水 通 道 的蛋 白结 构 与 通 道 功能 的关 这
收 、 系吸 水 、 通道 蛋 白及水 分利用 效率 的研究 热 根 水
道 蛋 白中 的液泡膜 内在 蛋 白． 过 近 年来 的深 入研 通 究， 学者 发现 水通 道 蛋 白广泛 存 在 于 拟 南芥 、 草 、 烟 豌 豆 、 米 、 麦 叶 表 皮 等 多 种 植 物 及 其 组 织 之 玉 大
植 物细 胞 通 过扩 散 、 流及 渗 透 作用 三 种 主要 集 方式 进行 吸水 ， 中植 物 体 的水分 集 流 主要 是通 过 其
膜上 的水 通道 蛋 白形成 的水 通道 （ ａ ｒ ｈ ｎ ｅ） ｗ ｔ ａ ｎ１ 来 ｅｃ 实施 的． 物水 通道 对水 分 的运输 具有专 一性 ， 植 能够
植 物体 水分 代 谢 是植 物 生 长 发 育 的必 要 条 件 ， 植 物 体对水 分 的吸收 及其 利用 效率直 接影 响到植 物 各项 生理生 态指 标 ． 物 对水 分 的吸 收 是个 体 存 活 植 的必 要前提 ， 水分 的利 用 效率 是 影 响 植 物生 长 发 对 育 的关键 因素 ． 本文 拟 就 近 年来 有 关 植 物体 水 分 吸
收稿 １期 ：０ ８— ３— ８ ３ ２ ０ ０ ０
的物 质 Ｊ研 究 发 现 ， 码 不 同 的水 通 道 蛋 白 的基 ． 编 因表 达与植 物 细胞伸 长 、 细胞 分裂 、 气孔 的关 闭 以及
作者简介 ： 龙飞（ ９６一） 男 ， 袁 １８ ， 河南 尉氏人
浅析植物水通道蛋白的研究进展-植物学论文-生物学论文
浅析植物水通道蛋白的研究进展-植物学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——水通道蛋白（也称水孔蛋白，AQPs）促使着水分的双向跨膜运动，它所介导的自由水快速被动地跨生物膜转运，是水进出细胞的主要途径。
第1 次从分子水平上证实细胞膜上存在水转运通道蛋白是Pe-ter Agre 研究小组[1]于1988 年从血红细胞和肾小管中分离纯化出的CHIP28 蛋白，并由实验证明了CHIP28 蛋白具有允许水分子进入的功能。
CHIP28 蛋白也因此被重新命名为l 号水通道蛋白（AQPl）。
第1 个植物水通道蛋白---2-TIP 是Maurel 等[2]于1993 年从拟南芥Arabidopsis thaliana 中分离出来的。
目前，已经从细菌、酵母、植物、动物中分离出多种水通道蛋白的同源基因，并且证明水通道蛋白除了担负细胞间或细胞内外水分子输导的功能，还参与细胞伸长与分化、气孔运动等生理过程。
本文主要从水通道蛋白家族成员组成、结构、生理功能及表达等方面对植物水通道蛋白的研究进展进行系统介绍。
1 水通道蛋白家族成员植物水通道蛋白的结构与动物水通道蛋白同属于一个古老的跨膜通道蛋白MIP 超家族。
已经测序的植物基因组揭示植物水通道蛋白是一个超家族：拟南芥中有38 个水通道蛋白基因编码的35 种水通道蛋白同源蛋白，其中10 个属于液泡膜水通道及其类似蛋白，13 个为质膜水通道及其类似蛋白，12 个属于NLM 类。
此外，玉米Zea mays 和水稻Oryza sativa 中分别有35 个和33 个水通道蛋白基因[3]. Johan-son 等[4]根据氨基酸序列同源性和亚细胞定位将水通道蛋白划分为5 个家族：质膜内在蛋白（PIPs），液泡膜内在蛋白（TIPs），类Nodulin26（NOD26）膜内在蛋白（NIPs），小的碱性膜内在蛋白（SIPs）和类GlpF 膜内在蛋白（GIPs）。
水通道蛋白的发现及应用讲稿
彼得·阿格雷（Peter Agre），科学家。
1949年生于美国，1974年在巴尔的摩约翰斯·霍普金斯大学医学院获医学博士，现为该学院生物化学教授和医学教授。
由于发现了细胞膜水通道蛋白，在2003年获得诺贝尔化学奖。
水通道蛋白发现历程19世纪20年代以前，人们认为水分子只是以自由扩散形式透过细胞膜，但是后来通过自由扩散方式水分子通过量很少且活化能很高，难以解释水分子以很快速度大量通过细胞膜，且通过菲克第一定律测量出细胞膜对水的通透性远高于人造脂质体，并且Posm(渗透水通透系数)／Pdw（扩散水通透系数）>1。
于是当时人们提出细胞膜上很可能存在调控水分子和其他小的溶质分子进出细胞的某种通道。
50年代，许多科学家（Arthur K. Solomon in Boston, Alan Finkelstein in New York, Robert Macey in Berkeley, Gheorghe Benga in Romania, Guillermo Whittembury in Venezuela, Mario Parisi in Argentina）通过大量实验证实水分子能快速，大量通过选择性通道进入红细胞，而其他分子或离子（H+）通不过，这种现象同样存在于唾液腺，肾脏和膀胱（99%的水分被肾小管重吸收利用）中。
尽管科学家做了努力，但由于这种分子通道十分简单，因此始终未能分离并鉴定。
1988年，Peter Agre和他的团队在研究分离提纯兔子Rh血型抗原蛋白（利用抗体—抗原结合特性来鉴定一定分子质量的物质并进行过滤）结果发现抗体与质量接近30kDa的蛋白结合，起初以为是32kDa的抗原水解产物，但是由银光标记的琼脂糖凝胶电泳实验（SDS-PAGE）结果显示有一条28kDa的不连续条带。
他们发现此蛋白不被考马斯亮蓝等染液染色，排除了抗原水解产物的可能。
这便引起了Peter Agre的极大兴趣。
植物蛋白质分离纯化的研究进展
植物蛋白质分离纯化的研究进展植物蛋白质在现代人类生活中发挥着日益重要的作用，其分离纯化已成为蛋白质研究的重要课题之一。
本文在概述了植物蛋白质预处理方法的基础上，对植物蛋白质分离纯化技术如膜分离技术、离心分离技术、凝胶层析技术、盐析法、等电沉淀法、电泳、离子交换层析、等进行了综述，并对植物蛋白分离纯化的发展进行了展望。
标签：植物蛋白质；提取；分离纯化Abstract：Plant protein plays an increasingly important role in modern life，and the isolation and purification of target protein from plant has become one of the hot topics in protein research. In this paper，based on introducing pretreatment methods of plant samples，the protein isolation techniques such as membrane separation，centrifugation，gel chromatography，salting out，isoelectric precipitation，electrophoresis，ion exchange chromatography，are reviewed，and the development or the protein purification plant is prospected.Key words：plant protein；extraction；isolation and purification蛋白質是生命活动的物质承担者，存在于所有生物中。
蛋白质参与生物形态结构的建成，基因表达的调节，生物信息传递，生物分子催化、代谢以及学习、防御等多种生命活动过程。
细菌水通道蛋白研究展望
Ｒ ｈ血型抗 原 的 核 心 多 肽 时 ， 从 人 红 细 胞 膜 中意 外 又
发现 一种 相对 分 子质 量 为 ２ ×１ 。 含 有 亲 水 性 氨基 ８ ０、
ｒ ｓＧＬ ） 存 在于 乳 酸 链 球 菌 中 ， ｉ ， Ａｓ ： ｎ 它属 于 另 一 种 类 型 的水通 道 蛋 白 ， 但 对 水 有 高 通 透 性 ， 且 能 通 透 不 并 尿 素和 其他 小分 子物 质 ， 也能 通 透 甘 油但 通 透 速度 不 及 ＧｌＦ， 作 用 类 似 于 哺 乳 动 物 的 Ａｑ ３ Ａｑ ７和 ｐ 其 ｐ、 ｐ
【 要】 根 据 通 透 特 异 性 ， 已 证 实 和命 名 了 三 类 细 菌 的水 通 道 蛋 白 ， 们 以 四聚 体 形 式 存 在 于 摘 现 它 特 定 细 菌 的 细 胞 膜 上 ， 同完 成 水 、 油 、 分 子 物 质 转 运 ， 细 菌 各 个 生 长 期 有 着 不 同 的 分 布 和 表 共 甘 小 在 达 ， 细 菌 的生 长 、 殖 、 异 和死 亡 有着 重要 的 生 理作 用 ， 能 是 杀 灭 细 菌 的 切 人 点 之 一 。 对 繁 变 可
细菌 水通 道蛋 白的分子 结构 和生 化特 性 细 菌水 通道 蛋 白 的基 本 结 构 与 哺 乳 动 物 水 通 道 蛋 白的基本 结 构 类 似 。演 绎 氨 基 酸 序 列 的 拓 扑 学 分 析 揭示 ， 该蛋 白在 细 胞 膜 中 以 四 聚 体 的形 式 存 在 ， 即
由四个对 称 排列 的各 长 ５ｎ 直 径 ３ ２ｎ 的 圆筒状 ｍ、 ． ｍ
植物水孔蛋白pip2表达量快速无标记检测
第６０卷第１期２０２０年１月大连理工大学学报J o u r n a l o fD a l i a nU n i v e r s i t y o f T e c h n o l o g yV o l ．６０,N o ．１J a n ．２０２０文章编号:１０００Ｇ８６０８(２０２０)０１Ｇ００１５Ｇ０７植物水孔蛋白P I P ２表达量快速无标记检测徐㊀铭,㊀赵子健,㊀夏秀英∗(大连理工大学生物工程学院,辽宁大连㊀１１６０２４)摘要:相较于传统的抗体检测,适配体更易于大量快速合成,且可和多种检测技术相结合,在蛋白检测方面具有巨大的潜力．水孔蛋白作为生物体内水分跨膜运输的主要途径,了解其表达量的变化在植物水代谢研究中有着重要意义．利用传统的混合列分法构建了８个C 端恒定半胱氨酸残基的类肽适配体文库,结合表面等离激元共振成像技术,筛选得到能特异性结合高等植物水孔蛋白P I P ２的类肽适配体P P A ７,其亲和力K D 高达２．５２ˑ１０－９m o l /L ．利用P P A ７检测了石竹玻璃化和正常植株的水孔蛋白表达量,结果表明,石竹玻璃化植株的水孔蛋白表达量显著高于正常植株．研究提供了一种新的植物蛋白定量检测策略,也为进一步明确水孔蛋白在组培苗玻璃化发生中的作用奠定了基础．关键词:水孔蛋白;P I P ２;类肽适配体;表面等离激元共振成像;快速无标记检测中图分类号:T Q ４６４．７文献标识码:Ad o i :１０．７５１１/d l l gx b ２０２００１００３收稿日期:２０１９Ｇ０４Ｇ０５;㊀修回日期:２０１９Ｇ１１Ｇ２０．基金项目:国家自然科学基金资助项目(３１８７２１１６)．作者简介:徐铭(１９９３Ｇ),女,硕士生,E Ｇm a i l :f o x Ｇe l a i n e ＠f o x m a i l ．c o m ;夏秀英∗(１９７２Ｇ),女,副教授,E Ｇm a i l :x x ４７＠d l u t ．e d u ．c n ．０㊀引㊀言水孔蛋白(a q u a po r i n ,A Q P )是一类膜内在蛋白[１]．植物A Q P 既可运输水分,也可运输C O ２㊁N a ＋㊁K ＋㊁C a ２＋等,在光合作用㊁蒸腾作用㊁气孔运动㊁种子萌发㊁受精㊁果实发育以及环境应答等过程中都起着重要作用[２Ｇ４]．根据氨基酸序列及结构特征,植物A Q P 通常被分为５类:质膜内在蛋白(pl a s m a m e m b r a n e i n t r i n s i c p r o t e i n s ,P I P s )㊁液泡膜内在蛋白(t o n o pl a s ti n t r i n s i c p r o t e i n s ,T I P s )㊁类N o d ２６膜内在蛋白(n o d u l i n２６Ｇl i k ei n t r i n s i c p r o t e i n s ,N I P s)㊁小分子碱性膜内在蛋白(s m a l l a n db a s i c i n t r i n s i c p r o t e i n s ,S I P s)和未表征功能的膜内在蛋白(X i n t r i n s i c p r o t e i n s ,X I P s )[５]．其中P I P s 位于质膜上,分为P I P １㊁P I P ２和P I P ３３个亚类．P I P ２较其他种类的水孔蛋白具有高的水分运输活性及结构保守性[６Ｇ８]．A Q P的快速定量检测对于其功能研究具有重要的意义．目前,植物水孔蛋白定量检测主要采用传统的W e s t e r n 方法,但该方法精度较低[９],不能完全反映植物中水孔蛋白的表达情况．另外,W e s t e r n 方法需要特异性抗体,由于抗体的制备周期较长㊁成本较高,且一些植物的水孔蛋白并没有成熟的市售抗体,限制了植物水孔蛋白的研究．类肽是一类以N Ｇ取代甘氨酸作为结构单元的多肽模拟物,其分子骨架与多肽相同,但侧链连接在N 上,不同于多肽[１０]．类肽的设计与合成较多肽更加简便高效,且具有丰富的化学多样性㊁良好的稳定性㊁抗酶解作用和生物活性[１１Ｇ１４],目前已被广泛应用于药理学㊁生物学㊁化学㊁材料学㊁生物传感器等众多领域[１５]．最新研究表明,类肽在模拟抗体[１０]及生物标志物的检测[１６]上具有独特的优势,其动力学过程充分证明了其作为蛋白识别探针的高亲和力和高特异性,在药物递送[１０]㊁诊断试剂[１６Ｇ１７]㊁抗菌剂[１８]㊁药物等[１５]方面显示了其巨大的应用潜力,但类肽用于植物蛋白定量检测还鲜有报道．表面等离激元共振成像(s u r f a c e p l a s m o nr e s o n a n c e i m a g i n g ,S P R i )技术是一种用于测量分子间相互作用及其动力学过程的快速无标记㊁实时高通量的生物传感技术[１９]．其原理是p 偏振光经由棱镜入射金属表面后在金属与玻璃交界面上发生全反射,并与表面等离子激元发生共振现象,由于光子将能量转移到了表面等离子激元,从而产生强烈的光吸收现象,引起反射光能量大量衰减,进而利用C C D成像系统收集反射光信息并转化可以得到分子相互作用的动力学信息．S P R i作为一种新兴的检测技术,越来越广泛地应用于生物分子相互作用的研究中,被誉为相互作用检测的金标准．最新研究表明,以类肽分子探针在S P R i芯片表面构建阵列,作为一种快速有效的高通量文库筛选㊁无标记生物标志物检测的新方法[２０Ｇ２１],引起了广泛的关注．玻璃化是植物组织培养过程中经常出现的一种生理失调或生理病变．玻璃化植株水分代谢失调,组织超度含水,叶片呈半透明水浸状,脆弱易碎,成活率低,是植物组织培养中亟待解决的一大难题[２２Ｇ２３]．但目前玻璃化发生的机制尚未有统一的认识．明确植物水孔蛋白表达量与玻璃化发生的关系对于深入阐明玻璃化机制具有重要意义．本研究构建８单元的类肽适配体展示肽库,并通过S P R i技术筛选出与植物水孔蛋白P I P２具有高亲和力㊁高特异性的适配体,同时用筛选出的适配体检测石竹玻璃化植株水孔蛋白表达的变化,为植物水孔蛋白研究提供新的方法和策略,同时探讨玻璃化发生机制．１㊀实验部分１．１㊀类肽库的构建通过一株一物(O B O C)法进行组合类肽库的合成[１６,２４],利用R i n kＧA m i d e树脂作为载体引导固相合成．每个残基采用亚单元法进行合成,即第一步是酰化反应,卤代乙酸经由二异丙基碳二亚胺(D I C)活化后与上一步末尾的胺反应;第二步是取代反应,通过S N２取代反应,让一个伯胺进攻并取代卤素以形成NＧ取代甘氨酸单体．在亚单元法的S N２取代反应中,树脂被分为８等份分置于８个合成管中,分别与类肽文库中所包含的８种胺反应．反应完成后充分清洗并混匀,进行下一步酰化反应．在所有残基合成结束后,利用甲醇收缩３０m i n,干燥后将树脂与标记有P I P２保守序列多肽(购自吉尔生化)的磁珠充分混合,在外加磁场下收集吸附有磁珠的树脂,放入３８４孔板,每孔一个树脂,其后加入裂解液(９５％三氟乙酸㊁２．５％水㊁２．５％三异丙基硅烷)反应２h,将与P I P２保守序列多肽有相互作用的类肽分子从树脂上裂解下来(同时亦可移除侧链保护基团),最后用氮气将其吹干,并封存３８４孔板于－８０ħ备用．类肽结构由MA L D IＧT O F/T O F质谱确定．１．２㊀类肽微流控芯片打印将类肽分子溶于去离子水中配制２m m o l/L 浓度的类肽溶液,在４０％的湿度条件下,利用生物芯片点样仪(B i o D o t,美国)将类肽阵列化地打印在裸金芯片(P l e x e r aB i o s c i e n c e,美国)表面．每种类肽打印３个且每个点包含２０n L类肽溶液．打印完成后,芯片在４ħ㊁８０％湿度条件下孵育过夜,然后用１０ˑP B S T㊁１ˑP B S T㊁去离子水(２次)依次程序清洗芯片,每次１５m i n．将清洗完毕的芯片用氮气吹干,之后用５０g/L脱脂奶粉封闭过夜,再按照上述步骤程序清洗并干燥,完成后盖上芯片盖片形成完整的流道腔室备用．１．３㊀表面等离激元共振成像S P R i方法参照Z h a o等的方法[２０],将制备完成的裸金芯片装载入P l e x A r r a y H T(P l e x e r a B i o s c i e n c e,美国)的光路系统中,平行光(６６０n m)经由棱镜照射在裸金芯片表面,通过调节入射角使之发生全反射,反射光被C C D接收．待测样品用P B S T溶解,以梯度浓度依次注入流动腔室内,每次测量包括４步．基线获得:用P B S T作为流动相,以恒定速度２μL s－１得到稳定的基线;结合:样品以２μL s－１的速度注入,作用３００s;洗脱:用P B S T以２μL s－１的速度洗脱３００s;重生:体积分数０．５％H３P O４以２μL s－１的速度洗脱３００s．动力学曲线的拟合及平衡解离常数(K D)的计算由B I A e v a l u a t i o n４．１S o f t w a r e (B i a c o r e,I n c．,美国)完成．１．４㊀植物材料的获取与准备实验材料为石竹(D i a n t h u s c h i n e n s i s L．)继代培养过程中出现的玻璃化苗与正常苗,培养条件为M S＋５g L－１琼脂＋２５g L－１蔗糖,培养室光照强度为３０~４０μm o l m－２ s－１,光照时间为１６h d－１,温度为(２５ʃ２)ħ．分别取等量玻璃化及正常植株的组织块,１ˑP B S㊁d d H２O梯度充分清洗后滤纸吸干．冰盐浴条件下将植株组织剪碎,其后１ʒ４加入匀浆介质(５０m m o l/L６１大连理工大学学报第６０卷㊀T r i sＧH C l,p H７．４)．将变幅杆插入样品液面下,超声波细胞破碎仪SＧ２５０D(B r a n s o n,美国)超声处理２m i n,将裂解液配制１０％匀浆液,４ħ,４０００r/m i n离心１５m i n,取上清液备用．２㊀结果与讨论２．１㊀类肽适配体展示肽库的构建分子间作用力是分子间相互作用的决定性因素之一,为了得到与靶标分子具有高亲和力的适配体,展示肽库的构建需包含氢键㊁输水相互作用㊁静电力㊁ππ堆积等多种分子间相互作用力,因此选取图１(b)中展示的８种伯胺单体．O B O C法进行文库合成时通用结构(图１(a))的C端包含两个１,４Ｇ丁二胺(N l y s)单体,用以增加类肽分子的溶解性,而N端的６个可变残基再合成时随机添加８种单体,因此,本研究构建的类肽文库容量为８６．传统的类肽合成有固相合成和液相合成两种方法:液相合成适用于合成相对分子质量较大的类肽,其结构与序列不易控制[２５];固相合成适用于相对分子质量较小的类肽,能够更加精确地控制类肽的序列㊁结构和性质[２６Ｇ２７]．本研究采用固相合成的方法,并在末端加入半胱氨酸,使所合成的类肽能够更好地固定在S P R i裸金芯片表面．(a)类肽的一般结构(b)类肽的伯胺亚单元图１㊀类肽展示肽库的结构F i g．１㊀S t r u c t u r e o f t h e c o m b i n a t o r i a l p e p t o i d l i b r a r y从合成的类肽文库中随机选取１０个分子,并利用MA L D IＧT O F/T O F确定其序列结构,以验证文库的多样性和合成质量,如图２所示,１０条类肽分子序列结构不同,表明所构建的文库可靠．高等植物P I P蛋白具有两段高度保守序列G G G A N S V A T G Y和T G I N P A R S F G A A V I Y N,分别处于P I P蛋白的N端和C端,其较小的空间位阻决定了其为良好的与适配体相互作用的靶点,因此针对该两段多肽作为靶标筛选得到的适配体,有潜力识别多种高等植物的P I P蛋白．通过S P R i高通量筛选,得到与其具有高亲和力的类肽分子P P A１６５㊁P P A９５㊁P P A２５９６和P P A７,作为植物水孔蛋白P I P２精筛备选分子．其中P P A７与两段保守序列亲和力最高,分别为１．１３ˑ１０－９m o l/L和２．８１ˑ１０－９m o l/L(图３(b))．２．２㊀植物水孔蛋白P I P２适配体的筛选除去保守序列以外,不同高等植物的P I P２蛋白具有不同的多肽序列,且较保守序列短肽具有更高级的空间结构,因此适配体与不同高等植物P I P２蛋白相互作用有所不同．利用S P R i技术进一步对P P A７与拟南芥水孔蛋白相互作用的动力学过程进行了表征,如图４所示植物水孔蛋７１㊀第１期㊀徐铭等:植物水孔蛋白P I P２表达量快速无标记检测㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀(１)N p i p ＧN l y s ＧN s e r ＧN l y s ＧN l e u ＧN a l l ＧN l y s ＧN l y s ＧC y s (２)N b z a ＧN s e r ＧN l y s ＧN c e ＧN l e u ＧN p i p ＧN l y s ＧN l y s ＧC y s (３)N p i p ＧN a l l ＧN l y s ＧN f f a ＧN f f a ＧN c e ＧN l y s ＧN l y s ＧC ys (４)N l y s ＧN l y s ＧN l e u ＧN b z a ＧN s e r ＧN p i p ＧN l y s ＧN l y s ＧC y s (５)N l e u ＧN l y s ＧN b z a ＧN p i p ＧN l y s ＧN a l l ＧN l y s ＧN l y s ＧC y s (６)N a l l ＧN p i p ＧN f f a ＧN c e ＧN l y s ＧN c e ＧN l y s ＧN l y s ＧC y s (７)N f f a ＧN p i p ＧN a l l ＧN c e ＧN l e u ＧN b z a ＧN l y s ＧN l y s ＧC ys (８)N l y s ＧN l y s ＧN s e r ＧN p i p ＧN s e r ＧN b z a ＧN l y s ＧN l y s ＧC y s (９)N s e r ＧN b z a ＧN b z a ＧN p i p ＧN c e ＧN c e ＧN l y s ＧN l y s ＧC y s (１０)N l y s ＧN p i p ＧN c e ＧN b z a ＧN a l l ＧN l e u ＧN l y s ＧN l y s ＧC ys 图２㊀随机选取展示肽库中１０条类肽序列F i g ．２㊀S e q u e n c e s o f t e n p e p t o i d sr a n d o m l y se l e c t e df r o mt h e c o m b i n a t o r i a l p e p t o i d l i b r a r y白P I P ２与P P A ７具有极高的亲和力,K D 高达２．５２ˑ１０－９m o l /L ．除去亲和力,特异性也是一个评价适配体优劣的重要指标,对于蛋白的定量检测,特异性直接影响了检测的灵敏度和信噪比,因此本研究选取高等植物中常见的脯氨酸转运蛋白(P r o T )㊁γＧ氨基丁酸转运蛋白(G A T ),以及G 蛋白(P r o t e i nG )作为对照,与P I P ２共同作为流动相分别与P P A ７进行相互作用(流动相浓度为９１．２n m o l /L ),结果表明,P P A ７与P I P ２的结合信号远高于P r o T ㊁G A T 以及G 蛋白,说明P P A ７对于P I P ２具有良好的特异性．从而证明了P P A ７分子在植物水孔蛋白P I P ２的检测上具有较大的潜力和应用价值．P P A １６５P P A ９５P P A ２５９６P P A７(a)分子结构(b)亲和力图３㊀P I P ２保守序列亲和力较高４种分子的结构与亲和力F i g ．３㊀S t r u c t u r e s o f t h e i d e n t i f i e d t o p f o u rP I P ２Ｇp e p t i d eb i n d i n gp e p t o i d s a n d t h e i r b i n d i n g af f i n i t i e s ８１大连理工大学学报第６０卷㊀(a )P P A ７与拟南芥P I P ２蛋白相互作用动力学过程表征㊀㊀(b )P P A ７检测P I P ２的特异性表征(n ＝６)图４㊀P P A ７与P I P ２的亲和力与特异性F i g ．４㊀A f f i n i t y a n d s p e c i f i c i t y ofP P A ７a n dP I P ２不同种类植物水孔蛋白抗体制备周期长且成本高昂,因此快速低成本地筛选一种能够针对多类高等植物水孔蛋白的适配体具有极其重要的意义．本研究采用的类肽适配体,其结合位点针对P I P ２的N 端与C 端的高度保守结构,使得其不同于抗体,具有识别多种高等植物P I P ２蛋白的潜力．筛选过程分为两步:第一步,以两段保守序列短肽作为靶标,筛选出亲和力为纳摩尔级别的类肽分子;第二步,利用拟南芥P I P ２分子对粗筛得到的类肽分子进行进一步的筛选鉴定,得到不仅和P I P ２保守序列短肽有高亲和力,同时与具有更高级结构的P I P ２蛋白依然能够高亲和特异性结合的适配体．２．３㊀植物水孔蛋白表达量检测玻璃化植株组织高度含水,但其水分积累的原因尚不明确．近年来研究表明,水孔蛋白参与细胞水分运输,调节渗透势变化,植物含水量㊁水势和水力导度的变化与水孔蛋白表达变化直接相关,改变水孔蛋白表达可直接影响植株水分吸收．但水孔蛋白表达量的变化与玻璃化的发生是否有关尚未有相关报道．本研究利用适配体P P A ７通过S P R i 法对玻璃化与正常石竹植株(图５)的水孔蛋白表达量进行了比较,结果发现,玻璃化植株的水孔蛋白含量显著高于正常植株．水孔蛋白表达量的提高,可能增强了植株的水分吸收及运输能力,而密闭的培养容器及较高的湿度使得蒸腾作用减弱,造成水分在组织细胞内/间积累,引起了玻璃化症状的发生．(a)玻璃化植株的形态学特征㊀(b)正常植株的形态学特征(c )不同稀释比例的石竹裂解液与P P A ７的结合信号(d)玻璃化石竹与正常石竹水孔蛋白表达量图５㊀植株形态学特征及结合信号和水孔蛋白表达量F i g ．５㊀T h em o r p h o l o g i e s o f p l a n t s a n db i n d i n g s i gn a l s ,e x p r e s s i o n q u a n t i t y o f a q u a po r i n ３㊀结㊀语本文通过S P R i 高通量筛选类肽文库的方法,得到了一种能够高灵敏识别植物水孔蛋白P I P ２的适配体P P A ７,与拟南芥P I P ２的亲和力为２．５２ˑ１０－９m o l /L ,达到了大部分抗体的亲和９１㊀第１期㊀徐铭等:植物水孔蛋白P I P ２表达量快速无标记检测力水平,且具有较高的特异性,可用于检测植物水孔蛋白P I P２表达量．利用适配体P P A７成功检测了石竹玻璃化植株水孔蛋白表达量的变化,为植物蛋白的定量提供了新方法及策略,同时为玻璃化试管苗发生机制的研究提供了参考．参考文献:[１]P R E S T O N G M,C A R R O L L T P,G U G G I N O W B,e t a l．A p p e a r a n c eo fw a t e r c h a n n e l s i nX e n o p u s o o c y t e se x p r e s s i n g r e dc e l lC H I P２８p r o t e i n[J]．S c i e n c e,１９９２,２５６(５５５):３８５Ｇ３８７．[２]L I G u o w e i,S A N T O N I V,MA U R E L C．P l a n ta q u a p o r i n s:r o l e s i n p l a n t p h y s i o l o g y[J]．B i o c h i m i c ae t B i o p h y s i c a A c t a,２０１４,１８４０(５):１５７４Ｇ１５８２．[３]K A P I L A N R,V A Z I R I M,Z W I A Z E K J J．R e g u l a t i o no f a q u a p o r i n s i n p l a n t s u n d e r s t r e s s[J]．B i o l o g i c a lR e s e a r c h,２０１８,５１:４．[４]P AWŁOW I C Z I,MA S A J A D A K．A q u a p o r i n s a s a l i n k b e t w e e n w a t e r r e l a t i o n s a n d p h o t o s y n t h e t i cp a t h w a y i na b i o t i cs t r e s st o l e r a n c ei n p l a n t s[J]．G e n e,２０１９,６８７:１６６Ｇ１７２．[５]MA R T I N E ZＧB A L L E S T A M dC,C A R V A J A L M．N e wc h a l l e n g e s i n p l a n t a q u a p o r i nb i o t e c h n o l o g y[J]．P l a n t S c i e n c e,２０１４,２１７Ｇ２１８:７１Ｇ７７．[６]C HA UMO N T F,B A R R I E U F,J U N G R,e t a l．P l a s m a m e m b r a n e i n t r i n s i c p r o t e i n s f r o m m a i z ec l u s t e r i nt w os e q u e n c es u b g r o u p sw i t hd i f fe r e n t i a la q u a p o r i na c t i v i t y[J]．P l a n t P h y s i o l o g y,２０００,１２２(４):１０２５Ｇ１０３４．[７]MA N a n,X U EJ i n g q i,L IY u n h u i,e t a l．R hＧP I P２;１,ar o s ea q u a p o r i n g e n e,i si n v o l v e di ne t h y l e n eＧr e g u l a t e d p e t a le x p a n s i o n[J]．P l a n t P h y s i o l o g y,２００８,１４８(２):８９４Ｇ９０７．[８]A L L E V A K,MA R Q U E Z M,V I L L A R R E A L N, e t a l．C l o n i n g,f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i z a t i o n,a n dc oＧe x p r e s s i o n s t u d i e s of an o v e l a q u a p o r i n(F a P I P２;１)o fs t r a w b e r r y f r u i t[J]．J o u r n a lo f E x p e r i m e n t a lB o t a n y,２０１０,６１(１４):３９３５Ｇ３９４５．[９]MA I N A E,MA T R I C O T I I,N O L I C．A na s s e s s m e n t o f a W e s t e r nb l o t m e t h o d f o r t h ei n v e s t i g a t i o n o f c a n i n e c u t a n e o u s a d v e r s e f o o dr e a c t i o n s[J]．V e t e r i n a r y D e r m a t o l o g y,２０１８,２９(３):e７８Ｇ２１７．[１０]S U N J i n g,Z U C K E R MA N N R N．P e p t o i dp o l y m e r s:a h i g h l y d e s i g n a b l e b i o i n s p i r e dm a t e r i a l[J]．A C SN a n o,２０１３,７(６):４７１５Ｇ４７３２．[１１]S I MO N RJ,K A N I A RS,Z U C K E R MA N N R N, e t a l．P e p t o i d s:a m o d u l a r a p p r o a c h t o d r u gd i s c o ve r y[J]．P r o c e e d i n g s of t h eN a t i o n a lA c a d e m yo f S c i e n c e so ft h eU n i t e dS t a t e so fA m e r i c a,１９９２,８９(２０):９３６７Ｇ９３７１．[１２]Z U C K E R MA N N R N．T h ec h e m i c a ls y n t h e s i so f p e p t i d o m i m e t i cl i b r a r i e s[J]．C u r r e n t O p i n i o ni nS t r u c t u r a l B i o l o g y,１９９３,３(４):５８０Ｇ５８４．[１３]MU R P H YJE,U N O T,HAM E RJD,e t a l．Ac o m b i n a t o r i a l a p p r o a c ht ot h ed i s c o ve r y o fef f i c i e n tc a t i o n i c p e p t o id re a g e n t sf o rg e n e d e l i v e r y[J]．P r o c e e d i n g s o ft h eN a t i o n a lA c a d e m y o fS c i e n c e so f t h eU n i t e dS t a t e so fA m e r i c a,１９９８,９５(４):１５１７Ｇ１５２２．[１４]L U X E N H O F E R R,F E T S C H C,G R O S S MA N N A．P o l y p e p t o i d s:a p e r f e c t m a t c h f o r m o l e c u l a rd e f i n i t i o n a n d m a c r o m o l e c u l a r e n g i n e e r i n g?[J]．J o u r n a lo f P o l y m e r S c i e n c e,P a r t A P o l y m e rC h e m i s t r y,２０１３,５１(１３):２７３１Ｇ２７５２．[１５]Z U C K E R MA N N R N,K O D A D E K T．P e p t o i d sa s p o t e n t i a lt h e r a p e u t i c s[J]．C u r r e n t O p i n i o n i nM o l e c u l a rT h e r a p e u t i c s,２００９,１１(３):２９９Ｇ３０７．[１６]R E D D Y M M,W I L S O N R,W I L S O N J,e ta l．I d e n t i f i c a t i o n o f c a n d i d a t e I g G b i o m a r k e r s f o rA l z h e i m e rᶄs d i s e a s e v i a c o m b i n a t o r i a l l i b r a r ys c r e e n i n g[J]．C e l l,２０１１,１４４(１):１３２Ｇ１４２．[１７]Y AM A Y,WA N G X u e m e i,G A O C M,e t a l．A u n i v e r s a l m e t h o d f o r d e t e c t i o n o f a m y l o i d o g e n i cm i s f o l d e d p r o t e i n s[J]．B i o c h e m i s t r y,２０１１,５０(２０):４３２２Ｇ４３２９．[１８]C H O N G S I R I WA T A N A N P,P A T C H J A,C Z Y Z E W S K IA M,e t a l．P e p t o i d s t h a tm i m i c t h es t r u c t u r e,f u n c t i o n,a n d m e c h a n i s m o f h e l i c a la n t i m i c r ob i a l p e p t i d e s[J]．P r oc e ed i n g s o f t h eN a t i o n a lA c a d e m y o f S c i e n c e s o f t h eU n i t e dS t a t e s o fA m e r i c a,２００８,１０５(８):２７９４Ｇ２７９９．[１９]L A U S T E DC,HUZ h i y u a n,H O O DL,e t a l．S P Ri m a g i n g f o rh i g ht h r o u g h p u t,l a b e lＧf r e e i n t e r a c t i o na n a l y s i s[J]．C o mb i n a t o r i a l C h e m i s t r y&H i g hT h r o u g h p u t S c r e e n i n g,２００９,１２(８):７４１Ｇ７５１．[２０]Z HA O Z i j i a n,Z HU L i n g,B U X i a n g l i,e ta l．L a b e lＧf r e e d e t e c t i o no fA l z h e i m e rᶄsd i s e a s e t h r o u g h t h eA D P３p e p t o i dr e c o g n i z i n g t h es e r u m a m y l o i dＧb e t a４２p e p t i d e[J]．C h e m ic a l C o m m u n i c a t i o n s,０２大连理工大学学报第６０卷㊀２０１５,５１(４):７１８Ｇ７２１．[２１]Z HA O Z i j i a n ,Z HU L i n g ,L I H a i yu n ,e t a l ．A n t i a m y l o i d o g e n i ca c t i v i t y o fA β４２Ｇb i n d i n gp e p t o i d i nm o d u l a t i n g a m y l o i do l i g o m e r i z a t i o n [J ]．S m a l l ,２０１７,１３(１):１６０２８５７．[２２]G A O H o n g y a n g ,X I A X i u y i n g ,A N L i ji a ,e ta l ．R e v e r s i o n o f h y p e r h y d r i c i t y i n p i n k (D i a n t h u s c h i n e n s i s L ．)p l a n t l e t sb y A g N O ３a n d i t s a s s o c i a t e d m e c h a n i s m d u r i n g in v i t r o c u l t u r e [J ]．P l a n t S c i e n c e ,２０１７,２５４:１Ｇ１１．[２３]G A O H o n g y a n g ,L IJ i a w e i ,J I H u i n i n g,e ta l ．H y p e r h y d r i c i t yＧi n d u c e d u l t r a s t r u c t u r a la n dp h y s i o l o g i c a l c h a n g e s i n b l u e b e r r y (v a c c i n i u m s p p ．)[J ]．P l a n t C e l l T i s s u e &O r g a n C u l t u r e ,２０１７,１３３(４):６５Ｇ７６．[２４]V E N D R E L L ＧN A V A R R O G ,R ÚA F ,B U J O N SJ,e ta l ．P o s i t i o n a ls c a n n i n g s y n t h e s i s o fa p e p t o i d l i b r a r yy i e l d sn o v e l i n d u c e r so fa p o p t o s i st a r g e t i n gk a r y o ph e r i n s a n d t u b u l i n [J ]．C h e m B i o C h e m ,２０１５,１６(１１):１５８０Ｇ１５８７．[２５]G U O L i ,Z HA N G D o n g h u i ．C y c l i c p o l y (a l ph a Ｇp e p t o i d )s a n d t h e i r b l o c k c o p o l y m e r s f r o m N Ｇh e t e r o c y c l i c c a r b e n e Ｇm e d i a t e dr i n g Ｇo p e n i n gp o l ym e r i z a t i o n s o fN Ｇs u b s t i t u t e dN Ｇc a r b o x y l a n h yd r i de s [J ]．J o u r n a lo ft h e A m e r i c a n C h e m i c a l S o c i e t y,２００９,１３１(５０):１８０７２Ｇ１８０７４．[２６]R O S A L E SAM ,MU R N E NHK ,Z U C K E R MA N N R N．C o n t r o lo fc r ys t a l l i z a t i o n a n dm e l t i n g b e h a v i o r i n s e q u e n c e s pe c if i c p o l y p e pt o i d s [J ]．M a c r o m o l e c u l e s ,２０１０,４３(１３):５６２７Ｇ５６３６．[２７]R O S A L E S A M ,MU R N E N H K ,K L I N E S R ,e t a l ．D e t e r m i n a t i o n o ft h e p e r s i s t e n c el e n g t h of h e l i c a l a n dn o n Ｇh e l i c a l p o l y p e pt o i d s i ns o l u t i o n [J ]．S o f tM a t t e r ,２０１２,８(１３):３６７３Ｇ３６８０．R a p i d l a b e l Ｇf r e e d e t e c t i o no f e x p r e s s i o n q u a n t i t y o f p l a n t a q u a po r i nP I P ２X U ㊀M i n g ,㊀Z H A O ㊀Z i j i a n ,㊀X I A ㊀X i u y i n g∗(S c h o o l o f B i o e n g i n e e r i n g ,D a l i a nU n i v e r s i t y o f T e c h n o l o g y,D a l i a n １１６０２４,C h i n a )A b s t r a c t :C o m p a r e dw i t h t r a d i t i o n a l a n t i b o d y d e t e c t i o n t e c h n i q u e s ,a p t a m e r s a r e e a s i e r t ob e r a p i d l ys y n t h e s i z e d i n l a r g e q u a n t i t i e s ,a n da r ee a s y t ob ec o m b i n e dw i t hav a r i e t y o fd e t e c t i o nt e c h n i q u e s ,w h i c hh a s g r e a t p o t e n t i a li n p r o t e i n d e t e c t i o n ．A st h e m a i n w a y o f w a t e rt r a n s p o r ta c r o s st h e m e m b r a n e i n o r g a n i s m ,i t i s o f g r e a t s i g n i f i c a n c e t o u n d e r s t a n d t h e c h a n g e s o f a q u a p o r i n e x pr e s s i o n i n p l a n tw a t e rm e t a b o l i s m．A ne i g h t Ｇm e r p e p t o i da p t a m e r l i b r a r y w i t ho n e c o n s t a n t c ys t e i n e r e s i d u eo n t h eC Ｇt e r m i n a l i s s y n t h e s i z e du s i n g t h ec o n v e n t i o n a l s p l i t Ｇa n d Ｇp o o lm e t h o d ,a n dt h e p e p t o i da p t a m e r P P A ７(P I P ２Ｇb i n d i n g p e p t o i da p t a m e r７)w i t h h i g h a f f i n i t y a n ds p e c i f i c b i n d i n g t o h i gh e r p l a n t a q u a p o r i n (P I P ２)i s s c r e e n e db y s u r f a c e p l a s m o nr e s o n a n c e i m a g i n g (S P R i )t e c h n o l o g y ．I t sa f f i n i t y K D i su p t o２．５２ˑ１０－９m o l /L ．P P A ７i su s e dt od e t e c tt h ee x p r e s s i o n q u a n t i t y o fa q u a po r i ni n h y p e r h y d r i c p i n k (D i a n t h u s c h i n e n s i s L ．)a n dn o r m a l p l a n t s ．T h e r e s u l t ss h o wt h a t t h ee x pr e s s i o n q u a n t i t y o f a q u a p o r i n i nh y p e r h y d r i c p i n k (D i a n t h u s c h i n e n s i s L ．)i s h i g h e r t h a n t h a t i nn o r m a l o n e s ,w h i c h p r o v i d e san e w q u a n t i t a t i v ed e t e c t i o ns t r a t e g y f o r p l a n t p r o t e i n sa n dl a y saf o u n d a t i o nf o r f u r t h e r c l a r i f y i n g t h e r o l e o f a q u a p o r i n i nh y p e r h y d r i c i t y．K e y wo r d s :a q u a p o r i n ;P I P ２;p e p t o i da p t a m e r s ;s u r f a c e p l a s m o nr e s o n a n c e i m a g i n g (S P R i );r a p i d l a b e l Ｇf r e e d e t e c t i o n１２㊀第１期㊀徐铭等:植物水孔蛋白P I P ２表达量快速无标记检测。
蚕豆类水孔蛋白基因的克隆及表达
蚕豆类水孔蛋白基因的克隆及表达自监科乎j焦,展第15卷第5期2005年5月559蚕豆类水孔蛋白基因的克隆及表达*崔香环郝福顺陈惠蔡敬辉陈珈王学臣一中国农业大学生物学院植物生理生化国家重点实验室,北京100094摘要为了解水孔蛋白在气孔运动中的作用,通过5/3RACE(rapidamplificationofcDNAends)技术从蚕豆(Viciafaba)叶片表皮cDNA中克隆出1个编码290个氨基酸的类水孔蛋白基因vfPIP1(giciafabaplasmamembraneintrinsicproteingene),GenBank登录号为AY667436.应用计算机软件对VfPIP1的氨基酸序列分析表明,VfPIP1含6个跨膜区,具有质膜水孔蛋白的特征信号序列GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSI/FGAAI/VI/VF/YN,属于PIP1亚家族成员.原位杂交及Northernblot分析显示,V厂PIP1在保卫细胞中有较强的表达信号,并受脱落酸(ABA)诱导.上述结果为研究水孔蛋白VfPIP1在气孔运动中的作用及其活性调节机制打下了基础.关键词ABA水孔蛋白基因克隆蚕豆保卫细胞叶片表皮上的气孔由一对保卫细胞组成,其启闭程度对植物的蒸腾,光合作用等具有重要的调控作用.保卫细胞水分跨膜进入或排出引起膨压变化是气孔张开或关闭的最根本原因.过去人们一直认为水分是通过简单扩散作用进出细胞的,然而这种方式运输水分的速率很小.植物中水孔蛋白的发现为气孔运动过程中水分运输调节的研究提供了新的思路.在植物中迄今已分离了30多种水孔蛋白基因_1],详细分析它们编码蛋白质的氨基酸序列发现,其中6个跨膜区,较短的保守氨基酸基序NPA 和信号序列SGXHXNPA是水孔蛋白运输水分所必需的[3"].根据水孔蛋白的分布及功能,可将其分为4个亚类:一类是位于质膜上的内在蛋白PIPs (plasmamembraneintrinsicproteins),另一类是位于液泡膜上的内在蛋白TIPs(tonoplastintrinsic proteins),第三类主要指与大豆(Glycinemax)根瘤菌周膜上水通道蛋白NOD26类似的通道蛋白NLMS(NOD26一likeintrinsicproteins),还有一类是SIPs(smallbasicintrinsicproteins)l2j.分析GenBank中水孔蛋白的数据库表明,植物拥有比哺乳动物更多的水孔蛋白,并且这些水孔蛋白在时空分布,蛋白活性及特定功能等方面存在差异].虽然目前已分离出多种水孔蛋白基因,但其研究主要集中在根中lg,有关保卫细胞水孔蛋白的研究相对较少.我们实验室曾用拟南芥(Arabidop—sisthaliana)水孔蛋白RD28的DNA探针和抗体检测到蚕豆保卫细胞中有水孔蛋白的存在l1,但究竟哪些水孔蛋白在保卫细胞中存在并起作用至今还不清楚.据文献报道,拟南芥质膜水孔蛋白AtPIP1b,蚕豆类水孔蛋白bbaql,向日葵(Helianthusarlrl—UUS)液泡膜水孔蛋白SunTIP7和SunTIP20可能在保卫细胞中表达l1,然而具体的情况仍不清楚.为此我们以蚕豆叶片表皮为材料,分离出1个蚕豆保卫细胞类水孔蛋白基因WPIP1,并对其氨基酸序列的特性,转录表达及定位进行了分析,初步证明它在保卫细胞中表达,并具有质膜水孔蛋白的特征信号序列,属于PIP1亚家族成员,其表达受ABA诱导.2004—08—06收稿,2004—10—18收修改稿*国家重点基础研究发展规划(批准号:G1999011700,2003CB114307)和国家自然科学基金(批准号:30370129)资助项目**通讯作者,E—mail:**************.cn56O自.筻科手逍屋第15卷第5期2005年5月1材料和方法1.1材料蚕豆种子种在生长室中.生长条件:光/暗周期为12h/12h,光照强度为200Ⅱtool?m?s,温度为22/17℃,取3周龄展开的叶片,撕取表皮条,用Trizol法提取蚕豆叶片表皮的总RNA(GIB—CO—BRL试剂盒).1.2V,PIP1eDNA的克隆1.2.1V,PIP1EST序列的克隆以oligo(dT)s为引物,用M—MIV反转录酶合成cDNA.通过比较几种植物水孑L蛋白的保守氨基酸序列,设计兼并引物1和2[¨].引物1:5一(A T)GG(TA)CACAT(TC)AAC—CCAGC一3引物2:5一AG(AG)CT(GA)GC(CGT)GGGTTGATGCC一3以该对引物经PCR扩增其EST序列.将其产物克隆到pMD18-T—vector中,由Bioasia公司测序.1.2.2V,PIP1全长eDNA的克隆根据以上的EST序列,设计5端的两条下游特异引物(GSP1和GSP2)和3端的两条上游特异引物(GSP3和GSP4):GSP1:5一CCACCGCCTTTCGCACCGAAGA—AGGC一3GSP2:5一CTTGTTAGAGACAGTTTCCTC—GCC一3GSP3:5一TGGAATCTCTGGGGGTCACAT—AAACCC一3GSP4:5一GCCACTGATGCCAAACGTAGT—GCCAG一3用5/3一RACE试剂盒(ClonTech)分别扩增—PIP1的5和3端的序列,分别将其克隆到pMD18一Tvector中由Bioasia公司测序.将测序的序列与其EST拼接,根据拼接的全长序列,设计VfP1和VfP2两条特异引物:VfP1:5一ACGCGGGGA TAGCATTCA TAT—TC一3VfP2:5一GAATAAACACATGATCCAGA—TCTCTC一3用pfuDNA聚合酶从蚕豆叶片表皮cDNA中扩增出VfPIP1的全长cDNA序列,按上述方式克隆和测序,1.3Northern杂交将生长3周的蚕豆苗用100tool?LABA分别处理0.5,1,2,3,5h,未处理的作为对照,用Trizol试剂盒(GIBCO—BRI)提取总RNA.按照Tsang等口的方法,进行RNA的凝胶电泳,并将其转移到尼龙膜上口.按照TaKaRa随机引物标记试剂盒的说明,用船P标记VfPIP1的3,_UTR序列作为杂交探针.65℃在Church缓冲液中(0.25tool? LNa2HPO4,pH7,2,1mmol?L～EDTA,7SDS,1BSA)进行预杂交和杂交,用高强度的SSC溶液洗杂交膜(2×SSC,0.5SDS,1×SSC,0.5SDS),一80℃曝光3d.1.4原位杂交原位杂交按照Marrison等的方法],并做了一些修改.生长3周的蚕豆叶片在FAA固定液(50乙醇,5醋酸,3.7甲醛)中真空抽气15min,室温固定6h.按照常规方法进行石蜡切片,以PCR扩增3末端cDNA特异片段,用地高辛RNA标记试剂盒(BoehringerMannheim)合成V_厂一PIP的正义和反义探针.将200—400ng?mL探针与组织切片在杂交缓冲液(6×SSC,3SDS,50formamide,100g?mLtRNA)中50℃孵育20h.经用洗脱缓冲液(2×SSC,50formamide)50℃洗两次后,用含10g?mIRNaseA的2×SSC液37℃处理切片30min;50.C用洗脱缓冲液处理1h;经过上述处理的切片在含0.59/6封闭液的TBS中封闭1h,再在含1BSA和0.3%TritonX一100的TBS中处理30min;然后用TBS按1/3000将碱性磷酸酶结合的抗体稀释成抗体溶液,用此抗体溶液处理材料90min.再用马来酸缓冲液(0.1 tool?L马来酸,0.15tool?LNaC1,pH7.5)洗去未结合的抗体,然后室温下在显色液(100mmol?L Tris—HCl,pH9.5,0.1tool?LNaCl,50mmol?LMgC1z,1/50NBT/BCIP)中反应10h,检测VfPIP1的mRNA信号.用光学显微镜(Optiphot一2,Nikon)照相.自置科手.连展第15卷第5期2005年5月5612结果和分析2.1蚕豆叶片表皮V,PIP1基因的克隆以引物1和2经RT-PCR从蚕豆叶子表皮cDNA中扩增出一个0.39kb的EST序列.BLAST分析表明它具有水孔蛋白的保守区.按照5/3'RACE试剂盒的说明分别用5端的两条特异引物(GSP1和GSP2)和3端的两条特异引物(GSP3和GSP4)扩增出IP1的5和3末端的序列.最后以VfP1和VfP2为特异引物,用pfuDNA聚合酶从蚕豆叶片表皮cD—NA中扩增出IP1的全长cDNA序列(图1(a)).序列分析表明,它长1.039kb,包含47bp的前导序AcGcGGGGATAGcATTcATATTccTccATTcATcAAGAGAGTGAGAAlAT(AAGcA AAGGAAcAAGATGTTT CACTTGGAGCCAACAAATTCCCAGAGAGAC AACCCATCGGTATTGCAGCTC AGAGCCATGACGACGGAAAG GACTATAAGGAACCACCTCCAGCACCGTTGTTCGAGCCTTCTGAACTCACT TCATGGTCTTTCTACAGAGCT GGGATAGCCGAGTTCGTCGCAACTTTTCTGTTTCTCTACA TCACCA TCTTGA CTGTCATGGGTGTCAACAAA TCTCAGTCCAAGTGTGCAACTGTTGGTATTCAAGGAATCGCTTGGTCTTTC GGTGGCATGA TCTTTGCCCTT GTTTACTGCACCGCTGGAATCTCTGGGGGTCACATAAACCCGGCAGTGACA TTCGGTTTGTTCTTGGCGAG GAAACTGTCTCTAACAAGAGCAGTGTTCTACATCGTGATGCAGGTTCTCGG TGCTATCTGTGGTGCTGGTGT GGTTAAGGGTTTTGAAGGAAAAGCCTTCTTCGGTGAAAAAGGCGGTGGTG CTAA TTTTGTTGCTCCTGGTTACACAAAAGGAGATGGACTTGGTGCTGAGATTATTGGTACCTTTGTTCTTG TTTACACCGTTTTCTCAGCCA CTGATGCCAAACGTAGTGCCAGAGACTCTCACGTTCCTATTTTGGCTCCTTT GCCAATTGGGTTTGCTGTGTTTTTGGTTCATTTGGCCACTA TTCCAATCACTGGAACTGGTATCAACCCTGC TAGGAGTCTTGGTGCTGCAATTATCTTCAACCAAGA TCGTGGCTGGAA TGA TCAGTGGATTTTCTGGGTTGG ACCA TTCA TTGGTGCAGCACTTGcAGcAcTTTAccAcAcAGTTGTGA TcAGAGccA TTccTTTcAAGTccAGATcaTG A~rTTGATTTCTTTCT TTATAAAACTTCATTGTTGCATCTTGGATTGTAATTGAGCTTGAAAA TATTTG AGAGATCTGGATCATGTGTTT(a) MEAKEQDVSLGANKFPERQPIGIAAQSHDDGKDYKEPPPAPLFEPSELTSWSF YRAG1AEFVATFLFLYIT1LTVMGvNKsQsKcA TvGIQGIAwsFGGMIFALvYcTAG圆FGLFLARKI~TRA VFYIVMQVLGAICGAGVVKGFEGKAFFGE亟叵KGDGLGAEIIGTFVLVYTVFSATDAKR~RDSHVPILAPLPIGFAVFLVHLATIP1TG匮亟匦亟匿巫圃QDRGWNDQWIFWVGPFIGAALAALYHTVVIRAIPFKSRS(b)图1Vl,PJPJcDNA序列和氨基酸序列(a)VfPIP1的全长cDNA序列;(b)VfPIP1相应的氨基酸序列,框内分别表示MIP家族信号序列SGxHxNPA VT和典型的质膜信号序列GGGANxxxxGY及TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/YN,框中S分别表示一个潜在的PKA磷酸化位点(Serl31)和一个潜在的PKC磷酸化位点(Ser205)列,870bp的开放阅读框及122bp的3r_非编码区.IP1cDNA序列已递交GenBank,登录号为AY667436.编码290个氨基酸的VfPIP1具有6个跨膜区(图2),MIP家族的信号序列SGXHXNPA VT,植物质膜水孔蛋白的特征信号序列GGGANxXXXGY 和TGI/TNPARSI/FGAAI/VI/VF/YN(图1(b)),分子量约30.7ku.此外,VfPIP1具有1个磷酸激酶A(PKA)的磷酸化位点(Ser131)和1个磷酸激酶C (PKC)的磷酸化位点(Ser205)(图1(b)).与4种植物水孔蛋白(拟南芥AtPIPlb,蚕豆CAB93959,烟草(Nicotianatabacum)NtAQP1和玉米(Zeays)ZmPIP1—2)的氨基酸序列进行比较,发现它们的同源l00l50200250氨基酸数目图2VfPIP1跨膜区分析跨膜区■l胞质内I胞质外2●8642O●0OOO鼙562自.鞋科乎j遁,展第15卷第5期2005年5月性都在81以上(分别为84.48,84.14Z,81.1和87.24),并且在水孔蛋白的功能区,氨基酸序列都是高度一致的,序列差异主要出现在N端(图3(a)), Atp:?:hVfP:?iNTA07CA393959ZmP:?i2C0:en0u0Atp0VfPNTA07.C^9j997mF'一2 AtF::Vf.j NTAQ? CA9j9j9 Zii:?2C0sensus Atr.?b VfP:? NTAQ? CAB9395 zmpIp12 CcLsei.sJs At11I, VfpJ1 NTA~P1 CAB9395 ZraPIP1—2 AtPIP1b VfPIPlNT^0P1 CAb030S1 ZmF'11 rrprjAtP1p1b'fpI1N1A0p1 CAB939,ZmPIp1—2N<'AQP1:^B9395口ZIIp1P1AtPIP1bVfPlP1NA0P1'AHq3q0ZrapIPl—_vtfa1AtP1P3AtPlP2aAtPlP2bAtPIPlbAtPlPlaAtPlPlCAtP1Pl图3VfPIPI与其他植物PIP的氨基酸序列比较(所有序列均来自GenBank)(a)VfPIP1分别与拟南芥AtPIP1b,蚕豆CAB939,烟草NtAQP1和玉米ZmPIP1—2的氨基酸序列比较.黑色部分代表5种蛋白序列中保守的氨基酸序列,灰色部分代表5种蛋白序列中有差异的氨基酸序列;(b)VfPIPl与拟南芥PIPs的氨基酸序列比较这可能与亚细胞定位有关.与已鉴定的拟南芥质膜水孔蛋白氨基酸序列比较,发现VfPIP1与At—PiP1b的同源性最高(84.48)(图3(b)),并且VfPIP1的N端比AtPIP2长16个氨基酸,因此属于PiP1亚家族成员.2.2V,PIP1的表达特性以vfPiP1的3非编码区作为探针,用North—ernblot杂交研究了vfPiP11TIRNA在根,茎和叶中的表达.结果表明,vfPiP1在根,叶中的表达较茎中的高(图4(a).用Northern杂交进一步分析ABA处理的蚕豆叶片总RNA,发现ABA处理1h时VfPIP1转录开始增加,随着处理时间的延长,转录继续增加,5h达到最大,如图4(b).这表明厂PJP1是一个受ABA上调的基因.-_(a1l23456+一VfPlPl+一28SrRNA—l8StRNA—?—————一28SrRNA+一l8StRNA(b1图4Northernblot杂交分析y,PIP1在蚕豆中的转录表达(a)13分别为根,叶,茎(b)ABA处理的叶片PIP1的mRNA信号.1,对照2,处理0.5h3,处理1h;4,处理2h5, 处理3h;6,处理5h2.3V,PIP1的定位用原位杂交对vfPiP1在叶中进行了组织定位(图5).观察发现厂PIP1mRNA在保卫细胞中的信号最强,叶肉细胞中信号较弱,而在表皮细胞中没有检测到信号.3讨论保卫细胞中水孔蛋白的发现为研究气孔运动调控的机理提供了新的思路.在此我们克隆了一个新的蚕豆保卫细胞类水孔蛋白基因Vfplp1.由于VfPIP1具有水孔蛋白典型的6个跨膜区,与垂虬璺菘自鞋科乎遗展第15卷第5期2005在5月,,∞毫':圈s原位杂交在蚕豆叶组织中定位,,PIPImRNA cIZ】NAfjc-cIJⅢMcii}1EI一自^t【1IPII.zH1I1P11椰A㈩水孔蟹功能柏垂【基酸序列完仝一或.非且J巫育植物质脱水扎崔l典型n0特川信号序刊【r((ANxXXXGY和rc;l/ rNPARs『H,A^1VIVIYN.此Vrl1P]直属十Iil'i,l寐旅成骨找们曩骑宦竹报道』细抛-f荐m水孔r1蚱毒与J气孔压功州节,然】至/}报道保细胞水扎n的殳献I然很少K~ddenboll:等I将q,『】frJM四的脑动r』l{埘帮甘眩脯((-.)【构也成融合肚转化拟南并z乏小ALT'I1…主雩在干分化的细胞技新J,V的l—十¨.1n绑胞巾也_芷珊J'Is的在s等和s¨r等i分别利lI_豫佗受挂术叫盘且雨1向【棼保卫细胞巾行类水fL蛋白牡罔cf.蔽泡膜水孔门甚ⅢT/Fl圳T』P20的_¨RN^信号¨生宽进确ilI_丁株lJ…胞q一仃住水扎蓝白此我们研究气孔功的式制料正豆叶一分离炎质膜水L蛋1l…V/,』,1.童Ⅱ织丧达分析表叫小屉1,特肆击达的根和u的表达较兰的高叶,怕定位研究表州.保细胞巾自较强的表达信.这意味蕾VfPIPI能保IjⅢ啮的小分跨J世运辅中起重要怍¨]水孔蚩ILl活性的足水分五输删节的重餐索研究襄叫.植物水孔噩的性受环境l于敞黎磷艘比,(l1I等…翥的捌I我Ir】仆离的v/,'f』』受激索ABA埔导AI世悄物件『饭霹要的逆境响血澈采.它既屉境胁迫呼的导产物.是胁迫f号的传导瞢城终血越州1Y气孔的仆J妾米维持愤物水分F街由干V/PIP)'ZmPIPl_2E环卜破激活的jL个氯基醯一致.iJ能.ZmPlPI_2的活性j周节式相似.通过与其他水扎]的,形成杂多案体的肜式被激活此外.V_I1IPI具仃1个I'KA1't9磷艘化他电和1个l】K【的磷酸化他点可能存在荷磷酸化均活ri心机蚌且已仃}充丧明在AJ},删的L扎运动过程巾肯芏}fn澈酶和蛋白磷瞒酶的参』f进丹析轰l圳V/r,川塾枉卫细胞中是受ABA诱导,非H宁刊讣析盘持它迁具有潜n的被澈活的ll刮特止可能参与JABA洞节的扎运动但其体功能需要刑转的材料进步端}参考殳拙㈨一Ⅲ㈨_耋_量～一564自.鞋科誊j焦,展第15卷第5期2005年5月scriptsencodingwaterchannelproteins:Tissue-specificexpres—sioninthecommonicaplant.PlantCell,1995,7:1129—11428DanielsMJ.ChaunontF.MirkovTE.Characterizati0nofanewvacuolarmembraneaquaporinsensitivetomercuryatau～niquesite.PlantCell,1996,8:587—5999JavotH,MaurelC.Theroleofaquaporinsinrootwaterup～take.AnnBot,2002,90:301—31310MelkonianJ,YuLX,SetterTI.Chillingresponsesofmaize (ZeamaysI.)seedlings:Roothydraulicconductance,abscisic acid,andstomata[conductance.JExpBot,2004,55:1751—1760l1HuangRF,ZhuMJ,KangY,eta1.Identificationofplasma membraneaquaporininguardcellsofVicia}abaanditsrolein stomatalmovement.ActaBotSin,2002,44:42—4812KaldenhoffR,KollingA,MeyersJ,eta1.Thebluelight—re—sponsiveAthH2geneofArabidopsisthalianaisprimarilyex～pressedinexpandingaswellasindifferentiatingcellsandencodes aputativechannelproteinoftheplasmalemma.PlantJ,1995,7:87—9513SunMH,XuW,ZhuYF,eta1.Asimplemethodforinsitu hybridizationtoRNAinguardcellsofViciafabaL.:Theex—pressionofaquaporinsinguardcells.PlantMolecularBiology Reporter,2001,19:12913514SardaX,TouschD,FerrareK,eta1.TwoTIP—likegenesenco—dingaquaporinsareexpressedinsunflowerguardcells.PlantJ, 1997,12:l1031l1115WeigA,DeswarteC,ChrispeelsMJ.Themajorintrinsicpro—teinfamilyofArabidopsishas23membersthatformthreedis tinctgroupswithfunctionalaquaporinsineachgroup.Plant Physiol,1997,114:1347135716TsangS,YinX,Guzzo-ArkuranC,eta1.IOSSofresolutionof gelelectr0ph0resis0fRNA:Aproblemassociatedwiththepres—enceofformaldehydegradients.Bio—Techniques,1993,14: 38O一38117SambrookJ,FritschEF,ManiatisT.MolecularCloning:A LaboratoryManua1.3rded.NewY ork:ColdSpringHarborLa—boratoryPress,2001,7.21—7.45MarrisonJL,IeechRM.Thesubcellularandintra—organelle recognitionofnuclearandchloroplasttranscriptsindeveloping leafcells.PlantJ,1994,6:6O5—614SugaS,KomatsuS,MaeshimaM.Aquaporinisoformsrespon—sivetosaltan. dwaterstressesandphytohormonesinradishseed—lings.PlantCellPhysiol,2002,43:1229—1237WanXC,SteudleE,HartungW.Gatingofwaterchannels (aquaporins)incorticalcellsofyoungcornrootsbymechanical stimuli(pressurepulses):EffectsofABAandofHgClz.Journal ofExperimentaIBotany,2004,55:411—422SiefritzF,BielaA,EckertM,eta1.Thetobaccoplasmamem—braneaquaporinNTAQP1.JournalofExperimentalBotany, 2001,52:1953—1957JohanssonI,KarlssonM,ShuklaVK,eta1.Watertransport activityoftheplasmamembraneaquaporinPM28Aisregulated byph0sph0rylati0n.PlantCell,1998,10:451—459 GerbeauP,AmodeoG,HenzlerT,eta1.Thewaterpermeabili—tyofArabidopsisplasmamembraneisregulatedbydivalentcat—ionsandpH.PlantJ,2002,30:71—81Tournalre~RouxC,SutkaM,JavotH,eta1.CytosolicpHregu latesrootwatertransportduringanoxicstressthroughgatingof aquaporins.Nature,2003,425:393397HarrisMJ,OutlawWH.Rapidadjustmentofguard—cellab—scisicacidlevelstocurrentleaf-waterstatus.PlantPhysiol,1991,95:171173WilkinsonS,DaviesWJ.XylemsappHincrease:Adrought signalreceivedattheapoplasticfaceoftheguardcellthatin—volvesthesuppressionofsaturableabscisicaciduptakebytheep—idermalsymplast.PlantPhysiol,1997,113:559—573FetterK,WilderVV,MoshelionM,eta1.Interactionsbetween plasmamembraneaquaporinsmodulatetheirwaterchannelactivity.PlantCell,2004,16:215228SchmidtC,SchelleI,LiaoYJ,eta1.Strongregulationofslow anionchannelsandabscisicacidsignalinginguardcellsbyphos—phorylationanddeph0sph0rylati0nevents.ProcNatlAcadSciUSA,1995,92:9535—9539l}}I}llllIl}}￡}lllll§I}{ll}llEl§BIEEEIg￡#《EIEEEI￡￡￡}l￡llIlI8__llfl} 加嬲。
水通道蛋白综述与展望
水通道蛋白水通道- 从原子结构到临床医学生物膜的透水性在生理学上是一个长期存在的问题，但负责此类蛋白质的蛋白质仍然未知，直到发现水通道蛋白1（AQP1）水通道蛋白。
AQP1由渗透梯度驱动的水选择性渗透。
人类AQP1的原子结构最近被定义。
四聚体的每个亚基含有允许水分子单文件通过但中断氢键通过质子所需的单独水孔。
已经鉴定了至少10种哺乳动物水通道蛋白，并且它们被水（水通道蛋白）或水加甘油（水甘油聚糖）选择性渗透。
表达位点与临床表型密切相关，从先天性白内障到肾源性尿崩症。
在植物，微生物，无脊椎动物和脊椎动物中发现超过200个水通道蛋白家族成员，并且它们对这些生物体的生理学的重要性正在被揭开。
在20世纪20年代发现脂质双层提供了当沐浴在较低或较高pH或含有毒性浓度的Ca2 +或其他溶质的细胞外液中时细胞如何维持其最佳细胞内环境的解释。
从1950年代开始发现离子通道，交换剂和共转运体为溶质的跨膜运动提供了分子解释。
然而，长期以来，假定水的输送是由于通过脂质双层的简单扩散。
来自具有高膜渗透性的多个实验系统的观察，例如两栖膀胱和哺乳动物红细胞，表明通过脂质双层的扩散不是水跨越膜的唯一途径。
虽然提出了各种解释，但直到10年前发现AQP1才能知道分子水- 特异性转运蛋白（Preston等，1999）。
现在人们普遍同意扩散和通道介导的水分运动都存在。
通过所有生物膜以相对较低的速度发生扩散。
水通道蛋白水通道发现于上皮细胞的一部分10至100倍的水渗透能力。
值得注意的是，水通道蛋白水通道的选择性非常高，甚至质子（H3O +）被排斥。
在大多数组织中，扩散是双向的，因为水进入细胞并从细胞释放，而水通道蛋白介导的体内水流则由渗透或液压梯度引导。
扩散的化学抑制剂是未知的，扩散发生在高Ea（Arrhenius活化能）。
相比之下，大多数哺乳动物水通道蛋白受汞的抑制，Ea等同于大量溶液中水的扩散（〜5 kcal mol_1）。
水通道蛋白的发现说明了偶发性在生物学研究中的重要性，并且引起了上游流体运输过程中水如何穿过生物膜的范式的完全转变。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
植物 ＡＱＰ 与动物 ＡＱＰ 同属于一个古老 的 跨 膜 通 道 蛋 白 ＭＩＰ 超家族， 其膜蛋白的单体分子量为 ２３～３０ ｋＤ。 植物 ＡＱＰ 分子前后 ２ 部分序列非常相似， 在膜上呈 １８０ °对称镜 像结构， 靠近 Ｎ 端和 Ｃ 端的 Ｂ 环和 Ｅ 环分别各有由 ３ 个氨 基酸（ 天冬酰氨"脯氨酸"丙氨酸） 组成的基序， 这是该蛋白家 族大部分成员共有的高度同源的特征性结构。水通道蛋白 是由 ４ 个对称排列的圆筒状亚基包绕而成的四聚体， 它的 结构对于维持单个亚基的位置是很重要的， 这 ４ 个亚基在 水通道中的作用都是独立的。植物 ＡＱＰ 中研究得比较清楚 的 是 ＡＱＰ１ 的 结 构 ， ＡＱＰ１ 的 １ 级 结 构 由 Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ 和 Ｅ ５ 个环连接而成， 具 ６ 个跨膜区段； 其中 Ｂ 和 Ｄ 位于胞质侧 为胞内环 ， Ａ、Ｃ 和 Ｅ 为 胞 外 环 （ 图 １） ［２］； Ｂ 和 Ｅ 环 具 有 疏 水 性， 其余的环具有亲水性。该蛋白家族大部分成员的 Ｂ 和 Ｅ 环都具有天冬酰氨"脯氨酸"丙氨酸（ ＮＰＡ） 基序， Ｂ 和 Ｅ 环沉 至 双分 子 层 内 ， 可 使 ＮＰＡ 折 叠 形 成 狭 窄 的 水 孔 ， 孔 道 大 小 约为 １ 个单水分子。目前已知的植物 ＡＱＰ 都是由 ４ 个对称
安徽农业科学， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉ． Ｓｃｉ． ２００６， ３４（ ２０） ： ５１６８－ ５１７０
责任编辑 姜 丽 责任校对 胡剑胜
植物水孔蛋白研究进展
张渝洁 ， 全先庆 ， 李新国 １，２
１
２ ＊ （ １．临沂 师范 学院 生 命 科 学 学 院 ， 山 东 临 沂 ２７６０００； ２．山 东 省 农 业 科 学 院 高 新 技 术 研 究 中 心 ， 山 东 济 南
基金项目 作者简介 收稿日期
国 家 自 然 科 学 基 金 项 目（ ３０５７１１２６） ； 山 东 省 中 青 年 科 学 家奖励基金项目（ ２００５ＢＳ０６００３） 。 张渝洁（ １９６８－ ） ， 女， 山东临沂人， 讲 师， 在 读硕士 ， 从事 发 育生物学方面的教学科研工作。＊ 通讯作者。 ２００６" ０６" ０７
排列的圆筒状亚基包绕形成的四聚体， 四聚体每个单体都 是功能独立的水通道， 其中 Ｂ 和 Ｅ 环对水的选择通透性十 分重要， 其任何变异都会导致水通道活性下降， 其中 Ｅ 环的 主要功能是激活 ＡＱＰ。ＡＱＰ１ 的 ２ 级结构由 ４０ ％的 α－ 螺旋 和 ４２ ％～４３ ％的 β片 层 及 转 角 构 成， ３ 级 结构 呈 沙 漏 模 式［２］ （ 图 １） 。
植 物 中 第 １ 个 水 孔 蛋 白 γ"ＴＩＰ 是 由 Ｍａｕｒｅｌ 等 人 于 １９９３ 年从拟南芥中分离出来的。目前， 已在拟南芥、烟草、 玉 米 、豌 豆 、大 麦 、滨 藜 、番 茄 、甜 菜 、西 葫 芦 及 向 日 葵 、甜 椒 、 含羞草等植物中发现了 ＡＱＰ。根据氨基酸序列的同源性， 将 植物水孔蛋白分为 ４ 类： 质膜内在蛋白（ ＰＩＰｓ） ， 液泡膜内在 蛋白（ ＴＩＰｓ） ， 根瘤菌共生膜上的内在蛋白 ＮＯＤ２６（ ＮＬＭｓ） 和 小分子碱性内在蛋白（ ＳＩＰｓ） ［１］。 ２ 结构
水 孔 蛋 白（ ＡＱＰ） ， 普 遍 存 在 于 植 物 、动 物 及 微 生 物 中 。 其主要作用是控制植物体内的水分运输， 降低根部细胞间 水分运输时的阻力， 调节细胞的渗透势， 参与气孔调节， 渗 透胁迫等。植物水孔蛋白在控制水分运输过程中受多种因 素的调控， 主要调控因子有异聚化作用、磷酸化作用 、ｐＨ 值 、胞 内 渗 透 压 、Ｃａ２＋浓 度 、细 胞 膨 压 、温 度 、激 素 等 。 笔 者 将 最新研究进展做一介绍。 １ 类型
２５０１００）
摘要 从分子生物学角度综述了近年来植物水孔蛋白研究进展。
关键词 水孔蛋白； 生理作用； 活性调节
中图分类号 Ｑ９４４．６８＋５
文献标识码 Ａ 文章编号 ０５１７－ ６６１１（ ２００６） ２０－ ５１６８－ ０３
Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ Ｐｒ ｏｇｒ ｅｓｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ａｑｕａｐｏｒ ｉｎ ＺＨＡＮＧ Ｙｕ"ｊｉｅ ｅｔ ａｌ （Ｈｉｇｈ"Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｊｉｎａｎ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ ２５０１００） Ａｂｓｔｒ ａｃｔ Ｐｌａｎｔ ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ ｐｌａｙ ｔｈｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ， ａｎｄ ７０ ％￣９０ ％ ｏｆ ｗａｔｅｒ ａｂｓｏｒｂｅｄ ｂｙ ｒｏｏｔ ｉｓ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ． Ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ａｑｕｐｏｒｉｎｓ ａｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｍａｎｙ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ， ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ， ｐＨ ｖａｌｕｅ ａｎｄ ｓｏ ｏｎ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ， ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｄｖａｎｃｅ ｉｎ ｐｌａｎｔ ａｑｕｐｏｒｉｎｓ ｗａｓ ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ ａｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｌｅｖｅｌ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ Ａｑｕａｐｏｒｉｎ； Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ； Ａｃｔ渝洁等 植物水孔蛋白研究进展
５１６９
可以避免细胞质的坍塌或膨胀， 在细胞间隙的某些变化引 起细胞内渗透发生突然变 化 的 时 候 ， 这 种 作用 更 为 突 出 ［４］。 在拟南芥细胞中， 质膜体深深地突入到液泡之中， 原生质膜 水孔蛋白聚集于质膜体上， 这可能有利于液泡和质外体之 间进行水分交换， 而细胞质的渗透波动很小。因此， 在植物 细胞中水孔蛋白具有很强的渗透调节功能， 而这种功能与 这些细胞的典型区室化有直接的关系 。 ３．３ 参与气孔运动调节 Ｋａｌｄｅｎｈｏｆ 将 ＡｔＰＩＰＩｂ 基因的启动 子与汗葡糖昔酸酶 （ ＧＵＳ） 基因构建成融合基因转化拟南 芥， 发现 ＡｔＰＩＰＩｂ 主要存在于分化的细胞 及 新 形 成的 组 织 中， 且在保卫细胞中也发现了 ＧＵＳ 的存在［５］。Ｓｕｎ 等分别利 用原位杂交技术证明在蚕豆和向日葵保卫细胞中有类水孔 蛋 白 基 因 液 泡 膜 水 孔 蛋 白 基 因 ＳｕｎＩＰ７ 和 ＳｕｎＴＩＰ２０ 的 ｍＲＮＡ 信号［６］。这些研究进一步证实了保卫细胞中存在水孔 蛋白。 ３．４ 可 降 低 根 部 细 胞 到 细 胞 途 径 的 水 分 传 导 阻 力 王 生 毅 、邓 西 平 等 通 过 ＨｇＣｌ２ 抑 制 试 验 认 为 ， 干 旱 胁 迫 、正 常 生 长株根系存在大量对 ＨｇＣｌ２ 敏感的水孔蛋白， 并且干旱胁 迫根系水孔蛋白可能在数量、活性上发生变化， 导致根系径 向水分运输阻力增大， 使根系在较大的静水压力下， 大量的 水分通过质外体途径［７］。Ｂａｒｒｏｗｃｌｏｕｇｈ 等研究了洋葱不同根 段水分导度变化， 结果表明仅发育形成内皮层凯氏带的较 嫩根端部的 Ｌｐ 低， 而具有木 栓 化 外皮 层 的 根 中 部 ， 以 及 内 皮层已木栓化的根基部的 Ｌｐ 明显较高。 ３．５ 参 与 渗 透 胁 迫 Ｓｕｌｅｙｍａｎ 等 用 ０．５ ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ 处 理 聚 球藻时发现， 初期 ＰＳ 的电子传递和 ＰＳ 的氧气释放活性均 可逆的快速下降， 后期则呈不可逆的缓慢下降［８］。这是由于 盐胁迫导致 Ｎａ＋向胞内流动， 而水分则通过 ＡＱＰ 流向胞外， 因 而 胞 内 Ｎａ＋和 Ｋ＋， 可 能 还 有 ＣＩ－ 浓 度 均 升 高 ， 以 致 光 系 统 失活。并且认为， 可逆下降由渗透效应引起， 而不可逆下降 则由离子效应引起， ＡＱＰ 参与这种可逆下降过程。从细胞水 平来说， ＰＩＰ 负责水分的吸收与外排， ＴＩＰ 负责调节膨压， 因 而细胞结构的完整性得以维持。 ３．６ 运输其他小分子物质 ＡＱＰ 对水具有高度选择性， 一 般不允许其他物质通过， 但目前发现在植物中， ＡＱＰ 除了对 水具有专一性外， 还可以提高细胞对丙三醇、尿素或二氧化 碳等的通透性 （ 如烟草水孔蛋白 ＮｔＡＱＰ１ 具有较高的二氧 化 碳 膜 渗 透 性） ， 还 可能 对 氨 和 氨 基 盐 、硼 、过 氧 化 氢 、酒 精 等 具 有 渗 透 性 ［９］。 ３．７ 参与栓塞的修复 近年来， 人们发现根的轴向导水阻 力受木质部导管中栓塞的影响很大， 栓塞的形成可显著降 低导管导水率［１０］。在栓塞的修复中， 由于栓塞的形成仅在导 管的管壁及纹孔场壁覆盖一层水膜， 因此溶液浓度高， 水势 低， 当 ＡＱＰ 被木质部薄壁细胞质中高浓度 Ｃａ２＋激活开启后， 水分就可从薄壁细胞流入导管。 ４ 调控 ４．１ 磷 酸 化 作 用 植 物 水 孔 蛋 白 磷 酸 化 作 用 是 调 控 水 跨 膜运输的重要手段。 菜豆种子的活性与磷酸化的关系已 在非洲爪蟾卵母细胞中得到验证， 当 α"ＴＩＰ 被磷酸化后， 活 性提高 １～１．５ 倍， 运输水的能力也相应提高［１１］。含羞草的突 变 体 分 析 表 明 ＭｐＰＩＰ１； １ 虽 然本 身 没 有 活 性 ， 但 它 的 Ｓｅｒ"