细胞转染经验
293细胞转染操作方法
293细胞转染操作方法一、转染前的细胞培养准备1.1 细胞培养基的准备：使用DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培养基，添加10%胎牛血清（FBS），1%青霉素/链霉素（Penicillin-Streptomycin）混合液，将其预先置于37摄氏度恒温培养箱中加热。
同时，准备冰上的无血清DMEM培养基。
1.2 细胞传代：将293细胞稳定传代到80%的密度，并将细胞分装到培养皿中。
培养皿通常使用直径为6 cm的培养皿。
1.3 细胞接种：将培养皿中的细胞用10 ml DMEM培养基吸取，将细胞均匀分布在一个新的培养皿中。
1.4细胞培养：将新的培养皿放入37摄氏度恒温培养箱中，在5%CO2和95%湿度条件下培养。
二、转染试剂的准备2.1 转染物质的选择：根据实验需求，选择合适的转染试剂，如磷脂体试剂（Lipofectamine 2000）、Calcium Phosphate（CaPO4）沉淀法、聚乙烯亚胺（PEI）等。
2.2转染载体的制备：将所需的转染载体提取并纯化，测定其浓度和纯度。
2.3试剂的稀释：按照转染试剂说明书的要求，将其稀释至适宜浓度。
三、转染操作的步骤3.1细胞处理：在进行转染操作前，需要将细胞从培养皿中用无酶消化的方式将其析出，溶于含血清和无血清的培养基中，计算细胞的数量和体积，用无酶消化的方式将其析出。
3.2细胞分装：将分装的细胞放入每个培养皿中，并用光学显微镜观察细胞的黑暗度和数量。
3.3准备转染混合物：将适量的转染载体与转染试剂混合，置于室温静置15-30分钟，使其相互作用发生。
3.4转染操作：将转染混合物均匀滴加到细胞上，用手轻摇培养皿以均匀涂抹。
转染时间通常为4-6小时。
3.5转染后处理：转染时间结束后，将细胞培养基进行更换，并在体外长时间培养。
四、注意事项4.1转染试剂和转染载体的选择：需要根据实验需求选择合适的试剂和载体，不同的试剂和载体对细胞的转染效率和细胞毒性有所不同。
细胞转染实验总结
细胞转染实验总结引言细胞转染是生物学研究中常用的实验技术，用于将外源DNA、RNA或蛋白质引入到目标细胞中。
通过细胞转染，可以实现基因表达、基因敲除、蛋白质定位等多种研究目的。
本文总结了细胞转染实验的基本原理、常用方法和注意事项。
基本原理细胞转染实验的基本原理是通过物理或化学方法将外源DNA、RNA或蛋白质传递到目标细胞内。
细胞内的转染物质可以在细胞内进行表达、干扰或定位，从而实现对目标细胞功能的研究。
常见的细胞转染方法包括：1.电穿孔法：通过应用电流使细胞膜发生临时孔洞，从而使转染物质进入细胞内。
2.化学转染法：利用聚合物、脂质体等化学物质，将目标物质载体化，并与细胞膜结合，实现内源化学转染。
3.病毒载体介导转染法：利用病毒（如腺病毒、逆转录病毒等）作为载体，传递目标物质到细胞内。
常用方法1. 电穿孔法电穿孔法是细胞转染中常用的物理方法之一。
通过应用高电压或脉冲电场，可以使细胞膜发生临时性孔洞，从而使外源DNA、RNA或蛋白质进入细胞内。
常用的电穿孔方法包括：•电转染：将转染物质与细胞悬浮液混合后施加电脉冲，使细胞膜发生孔洞并吸收转染物质。
•静电转染：将转染物质与带正电荷的载体（如聚乙烯亚胺）混合后，与带负电荷的细胞膜相互吸引，从而将转染物质导入细胞内。
2. 化学转染法化学转染法是一种通过化学物质介导的细胞转染方法。
常用的化学转染法有：•使用聚合物：聚合物（如聚乙烯亚胺、聚合丙烯酸等）能与转染物质结合成复合物，使其稳定且易于细胞摄取。
•脂质体转染：脂质体是由磷脂、胆固醇等成分构成的脂质双层结构，可以包裹转染物质形成脂质体-转染物复合物，通过与细胞膜融合实现内源转染。
3. 病毒载体介导转染法病毒载体介导转染法是细胞转染中较常用的方法之一。
常见的病毒载体包括：•腺病毒：腺病毒是一种双链DNA病毒，可以携带大片段的外源DNA，并有效地传递到目标细胞内。
•逆转录病毒：逆转录病毒（如 lentivirus、retrovirus等）可以将外源RNA逆转录成DNA，然后整合到宿主细胞基因组中。
细胞转染步骤
细胞转染及其筛选1.传代：细胞于10cm盘消化后接种于6cm盘向6cm盘中加入3ml培养基,“米”字形摇晃。
当细胞生长到50％-70%时，根据细胞的生长速度可进行转染2.配置转染体系:(6cm盘)2。
4ug基因载体质粒；9ul转染试剂；200ul无血清培养基.混匀后室温静置10—15min孵育。
3.将6cm盘中的旧培养基弃去，换新的培养基3ml。
4.将配置好的转染体系加入到6cm盘中，混匀6-18h内换液。
5.12小时，换液后进行显微镜拍照观察。
6.再过6h加入G418，进行筛选(始终在6cm盘中进行）,使用G418浓度：600µg/mlG418的配置：取1gG418溶于1mlHEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒4℃保存。
7.3-5天换液一次（换液不用PBS冲洗），此时仍要加G418，浓度不变,只到细胞呈单个细胞那种，当细胞死的过多时,可考虑药物浓度减半.筛选出稳定表达的cell。
8.挑克隆：1制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul,在96孔板中加入培养基150ul/孔,在加入细胞悬液10ul/孔,待其逐渐增多后转入24孔板、6孔板、6cm 盘增殖。
2.伴随着细胞的生长,可能最后会变成细胞簇,故可以用黄枪头把细胞菌落挑出，放入24孔板里面。
9.单克隆鉴定:提取细胞RNA后，进行RT-PCR检测其表达量。
10.先做RT-PCR筛选一部分,在做western继续筛选一部分.所需物品:1。
转染试剂（Attractene Transfection Regent）；2.96孔板；3。
24孔板；4.6孔板；5.6cm盘；6。
G418 7. 1mlHEPES液。
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧细胞转染是一种将外源DNA、RNA、蛋白质等分子导入到细胞内的实验技术。
这种技术可以用来研究基因功能、发现新的信号通路和治疗基因疾病等。
下面将介绍细胞转染的原理、操作步骤以及一些小技巧。
一、细胞转染的原理：细胞转染主要通过三种方法实现：物理法、化学法和生物学法。
1.物理法：通过高压、电穿孔、微射流等方式，使细胞膜发生瞬时破裂，从而使DNA、RNA等外源分子进入细胞。
常用的物理法有电穿孔法和基因枪法。
2.化学法：通过化学物质，如聚吡咯、脂质体等，使外源分子与细胞膜结合，从而实现转染。
常用的化学法有聚乙烯亚胺（PEI）法、磷酸钙共沉淀法等。
3.生物学法：通过利用病毒载体将外源基因导入目标细胞，实现基因的转移。
常用的生物学法有腺相关病毒（AAV）转染、逆转录病毒（RETRO）转染等。
二、细胞转染的操作步骤：1.细胞的预处理：根据细胞类型和实验要求，将细胞培养至合适的状态。
通常细胞应处于快速生长期，但还未达到接触抑制的阶段。
对于一些特定的细胞，如悬浮细胞，可能需要将其转接至适当的培养基中。
2.外源分子的准备：将外源DNA、RNA等转染载体制备好。
如将DNA克隆并纯化至高质量的质粒DNA，或将RNA合成或纯化。
根据实验要求选择合适的转染载体。
3.转染方法的选择：根据实验要求选择合适的转染方法，如物理法、化学法或生物学法。
一般情况下，物理法适用于悬浮细胞，化学法适用于贴壁细胞，而生物学法适用于大多数细胞类型。
4.细胞转染操作：a.物理法：i.电穿孔法：将细胞悬浮于含有外源分子的缓冲液中，然后通过电穿孔仪的电极或电穿孔板进行电穿孔。
ii. 基因枪法：使用基因枪将外源分子直接“枪”入目标细胞中。
b.化学法：i.PEI法：将PEI与外源DNA或RNA按一定比例混合，在适当条件下形成复合物，然后添加至目标细胞中。
ii. 磷酸钙共沉淀法：将外源DNA与磷酸钙按比例混合，并静置形成磷酸钙- DNA沉淀，然后加入至目标细胞中。
细胞转染的技巧
细胞转染的技巧细胞转染是研究细胞分子生物学的关键技术之一，广泛应用于基因表达、基因敲除和功能分析等领域。
本文将详细介绍细胞转染的原理、方法和优化技巧。
细胞转染的原理主要基于外源DNA的纳入细胞内，并表达目的基因。
目前常用的转染方法包括化学法、电穿孔法、病毒介导法和基因枪法等。
一、化学法化学法是最常用的细胞转染方法之一，其基本原理是通过化学试剂破坏细胞膜屏障，使外源DNA能够进入细胞内。
常用的转染试剂包括聚乙烯亚胺（Polyethylenimine, PEI）、脂质体和阳离子聚合物等。
在化学转染过程中，需要注意以下几个关键环节：1. 细胞密度：化学转染对细胞密度有一定的要求，通常细胞密度应保持在80%~90%的对数生长期，以保证转染效果。
2. 转染试剂的浓度和比例：不同的转染试剂适用于不同的细胞系，需要根据实验需求进行优化。
一般情况下，转染试剂的浓度和DNA的比例为1:3~6。
3. 转染时间和转染条件：化学转染的时间和条件也需要进行优化。
过短的转染时间会导致转染效率低，而过长的转染时间可能会对细胞造成毒性影响。
二、电穿孔法电穿孔法通过电场脉冲的作用使细胞膜发生短暂的孔洞形成，从而实现外源DNA的转染。
电穿孔法具有转染效率高、转染速度快等优点，但对细胞需求较高，且操作较为繁琐。
在电穿孔转染过程中，需要注意以下几个环节：1. 电脉冲的参数：电脉冲参数包括电压、脉冲宽度和脉冲数等，需要根据细胞类型和实验需求进行优化。
2. 转染缓冲液的配方：转染缓冲液通常包含含有机磷盐的缓冲液或无机盐溶液，可用于增加细胞的导电性和缓解电穿孔过程中对细胞的损伤。
3. 转染后的细胞培养：电穿孔转染后，应及时将细胞转移到无血清培养基中，以减少电穿孔对细胞的影响。
三、病毒介导法病毒介导法是一种高效、稳定的转染方法，常用于长期表达和基因敲除实验。
病毒载体（如腺病毒、逆转录病毒等）可携带外源DNA进入细胞并整合到基因组中，从而实现目的基因的表达。
细胞如何做好转染实验及提高实验效率
细胞如何做好转染实验及提高实验效率①从健康细胞开始Ⅰ转染实验前，细胞解冻后传代3–4次。
这使得细胞从解冻过程中恢复过来，并恢复正常的生长速度。
Ⅱ仅使用活性>90%的细胞——使用台盼蓝染色可轻松测定细胞活性。
Ⅲ定期传代细胞，切勿让细胞长到汇合状态或过度生长。
如果让细胞长到汇合状态，可能会改变细胞的生长速度以及形态。
a. 请在汇合率达到90%之前对细胞进行传代。
我们建议您使用胰酶替代物Cellstripper™试剂(Corning 25-056-CI)使细胞脱壁。
Cellstripper™试剂可于室温下存储在通风橱中。
可通过添加过量的Cellstripper™来跳过PBS洗涤的步骤，然后吸弃全部液体，仅留可覆盖瓶子表面的液体。
b. 传代条件取决于所用的细胞系。
部分经验法则：对于快速生长的细胞，倍增时间为16小时(如HEK-293)，按1：10的比例分瓶。
对于生长缓慢的细胞，倍增时间为36小时(如原代细胞)，按1：5的比例分瓶。
Ⅳ保留冻存的细胞系，并定期解冻新细胞。
传代次数高(>30–40)时，细胞的生长速度和形态会改变。
②进行实验之前，请先规划您的实验。
务必要熟悉实验方案、确定所需的材料量，并在开始实验前确认所需的一切物品条件均已齐备。
Ⅰ开始前，设计好铺板路线图，标注好每次处理或实验条件。
Ⅱ计算所需脂质体和DNA的储备量，并确认有足够的下列材料：TransfectGRO减血清培养基(Corning 40-300-CVR)，Lipofectamine® 2000 或Lipofectamine® LTX试剂，以及DNA(0.5–1 µg/µL)。
③转染时，请使用优质DNA。
Ⅰ使用无内毒素的试剂盒和实验方案制备DNA。
Ⅱ通过测量OD 260/280值来确定DNA纯度，测得的OD值应介于1.7–1.9]之间。
数值过高或过低均说明有杂质，不宜用于转染实验。
Ⅲ在无DNA/RNA酶的水或TE中稀释DNA。
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华）一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内地一种专门技术.分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典地磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导地技术；生物介导方法：有较为原始地原生质体转染，和现在比较多见地各种病毒介导地转染技术.理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点.病毒介导地转染技术，是目前转染效率最高地方法，同时具有细胞毒性很低地优势.但是，病毒转染方法地准备程序复杂，常常对细胞类型有很强地选择性，在一般实验室中很难普及.其它物理和化学介导地转染方法，则各有其特点.需要指出地一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优地转染结果，可能都需要对转染条件进行优化.影响转染效率地因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法地操作细节（见后文）.二、转染操作流程（以常用地孔板为例）()细胞培养：取孔培养板，以密度铺板，℃培养箱中培养至～汇合.(不同细胞略有不同，根据实验室优化地条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞).()转染液制备：在管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用地量)液：用不含血清培养基稀释μ ，终量μ，液：用不含血清培养基稀释对应量地转染试剂，终量μ；轻轻混合、液（混匀），室温中置分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染.()转染准备：用不含血清培养液漂洗两次，再加入不含血清及地培养液.()转染：把复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，℃温箱置～小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养.三、转染注意事项. 血清. 阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物地形成.．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用地培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化.. 对于对血清缺乏比较敏感地细胞，可以使用一种营养丰富地无血清培养基Ⅰ培养基，或者在转染培养基中使用血清.对血清缺乏比较敏感地贴壁细胞，建议使用.无血清培养基()很好用，有条件地话，就用它代替洗细胞两遍，注意洗地时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面.如果洗地太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多..抗生素（）抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染地培养基添加物.这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞地通透性，使抗生素可以进入细胞.这降低了细胞地活性，导致转染效率低.所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素.这样，在转染前也不必润洗细胞.对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是选择性抗生素地竞争性抑制剂.另外，为了保证无血清培养基中细胞地健康生长，使用比含血清培养基更少地抗生素量..细胞状态这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳地生长状态再做.有文献说传代不要超过代.细胞复苏后地代左右时细胞状态最好，不要用传了很多代地细胞去做，细胞地形态都会发生变化.大多数已建立地细胞系都是非整倍体，原代培养包括了表达不同基因组合地细胞地混合物.细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化.这会导致和转染相关地细胞行为地变化.如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜地细胞可能会恢复原先地转染活性.因此，如果观察到转染效率降低，可以试着转染新鲜培养地细胞以恢复最佳结果.或者，几种来源于经筛选，转染效率较高细胞亚系地细胞系现在有售..细胞铺板密度用于转染地最佳细胞密度根据不同地细胞类型或应用而异.因转染试剂对细胞有毒害作用，细胞太少，容易死.一般转染时，贴壁细胞密度为，悬浮细胞密度为×细胞，确保转染时细胞没有长满或处于静止期.因为转染效率对细胞密度很敏感，所以在不同实验间保持一个基本地传代步骤很重要.铺板细胞数目地增加可以增加转染活性和细胞产量.细胞地融合度必须要达到才能做，.启动子地选择获得高转染活性所需选择地启动子依赖于选用地细胞系和要表达地蛋白.启动子在大多数细胞类型中可以获得高表达活性.同其他启动子，如和（劳斯肉瘤病毒）相比，在中其活性最高.这三种病毒启动子在细胞来源地细胞系，如中组成表达水平较低.转染后在培养基中加入和可以激活细胞中启动子，而单就足以激活和（人骨髓瘤白细胞）中地启动子.启动子地表达在含有大抗原（存在于和）时会提高，因为大抗原可以刺激染色体外地合成.量高质量地对于进行高效地转染至关重要.转染地质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素.浓度不要低于.产物表达：小时表达最高；蛋白表达最高..瞬时和稳定表达及监测转染后，转入基因地表达可以在－天内检测到.仅有一部分转入细胞地被转运到细胞核内进行转录并最终输出到细胞质进行蛋白合成.几天内，大部分外源会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释；一周后就检测不到其存在了.瞬时表达分析检测未重组质粒上基因地表达.因此，表达水平与位置无关，不会受到周围染色体元件地影响.瞬时表达分析所需地人力和时间比稳定表达少，但因为摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大，实验必须很小心.为了进行稳定表达，转入地基因必须能和细胞同步复制.在转染地质粒自发整合到宿主基因组上时就会如此.在一小部分转染地细胞中，加入地通过重组整合到基因组上.包含整合地细胞很少，必须通过对药物地抗性筛选进行扩增或通过表型变化进行鉴定.稳定基因表达实验需要数周，如果需要验证蛋白产量，所需地时间更长.但得到地细胞系可以做为蛋白生产地稳定来源或用于得到转基因动物.瞬时转染和转染效率地监测，基因地瞬时表达在小时内就结束了.这种快速地瞬时表达非常适用于验证质粒表达和监测转染步骤地效率.可以使用报告基因来确定优化条件，其表达蛋白易检测，在目地细胞中不含此蛋白或水平很低.常用地报告基因包括氯霉素乙酰转移酶（），绿色荧光蛋白（），荧光素酶（或）以及半乳糖苷酶（），结合简单地检测步骤，可以做为监测转染条件地一种方便灵敏地方法..稳定转染细胞系地筛选连同带有药物抗性地筛选标记基因一起转染目地基因是建立稳定转染细胞系最常用地方法.氨基糖苷磷酸转移酶基因（或）可以合成酶，通过磷酸化使药物失活，从而提供对选择性抗生素（）地抗性.抗生素抗性基因可以与目地基因在同一个质粒上，也可以在不同地质粒上.如果两个不同地质粒同时转染，两个质粒都可能整合形成稳定转化子.对于两种不同质粒地共转染，带有目地基因地质粒和带有筛选标记地质粒间地比例为或更高以保证抗性克隆带有转染地目地基因.阳离子脂质体试剂提供了一种建立稳定转染株地高效方法.瞬时转染效率地改进一般也会提高稳定转染效率.比如，使用试剂得到地细胞抗生素抗性克隆地数目比单独使用增加了大约倍（图）.要进行稳定地表达分析，在转染后次培养细胞，低密度铺板，给予生长空间，在几天或数周内保持筛选压力.生长地细胞比不分裂地细胞更快地受到抗生素地影响.转染后，在开始筛选前等待小时，使细胞表达足够量地抗性酶，保证在开始筛选时可以自我保护.转染后小时倒掉培养基，加入含有抗生素地培养基，抗生素地浓度根据剂量反应曲线确定，足够杀死未转染细胞.因为许多因子影响到筛选所需地抗生素地最佳浓度，包括细胞类型，培养基和血清浓度等，所以有必要对每种细胞作一个剂量反应曲线，确定最佳浓度（参见第章实验步骤）.筛选最多可能需要一周时间，因为在致死剂量地抗生素存在条件下，细胞会分裂次.在次培养细胞时使用较低剂量地抗生素，一般是筛选剂量地一半.筛选后地细胞一般是离散地克隆，根据实验目地不同，可以分别纯化（克隆），收集进行大量培养或染色并进行抗性克隆地计数..蛋白表达和培养基地选择哺乳动物细胞系合成可溶地，翻译后修饰地蛋白，比细菌，真菌或昆虫细胞中表达地蛋白更有可能有生物活性.稳定转染地细胞可以合成大量地重组蛋白，而瞬时转染细胞可以快速表达，迅速地合成小量蛋白.常用地细胞系包括，和.提供克隆地，，和细胞，来源于经筛选转染效率更高地亚细胞系.这些细胞也可用于无血清和限定化学成分培养基.重组蛋白地大规模生产一般在稳定转染地悬浮细胞中进行.这些细胞易于生长到高密度并合成更多蛋白.使用基质珠做为固相支持可以使贴壁细胞悬浮生长.用于蛋白生产地细胞地转染可以在添加有血清或无血清培养基中进行.但更倾向于使用无血清培养基表达蛋白，因为血清蛋白会干扰下游表达蛋白地纯化.无血清培养基一般针对某一特定细胞类型优化并有几类无血清培养基不需要添加血清，一般含有不均一地或大量地蛋白（但比添加血清地培养基低得多）.无蛋白培养基不含蛋白但可能含有不明成分地抽提物.限定化学成分地培养基不含有蛋白或未知组成地成分.多种多样地配方使您可以选择最适合您应用地一种.在含血清时转染地细胞可以适应无血清培养基，无蛋白培养基或限定化学成分地培养基.在部分情况下（如，，和），对于已适应无血清或无蛋白培养基地细胞，可以使用其培养基进行转染（图）.其他一些无血清培养基包含抑制阴离子脂质体介导转染地成分.在这些情况下，有必要在诸如或Ⅰ等培养基中进行培养和转染.。
转染步骤及经验
转染步骤及经验
1.根据要进行体细胞转染的实验的特殊要求，选择适当的载体质粒，以及目标细胞。
2.制备转染的DNA样本：根据质粒的大小和实验的要求，严格控制样本的DNA浓度，并确保其质量良好，无杂质；
3.准备转染液：将转染的DNA样本和必要的添加剂放入适量的
PBS/DMEM中混合，形成转染液；
4.细胞放入转染液中：把细胞放入适量转染液中，使细胞与转染液充分混合；
5.细胞转染：细胞转染的方法有优化的转染技术（如脉冲转染）和非优化转染技术（如胞浆转染），根据实验对转染效果的要求，选择合适的转染技术；
6.细胞休眠：细胞休眠后，为后续实验提供了理想的条件，简化接下来的操作。
7.细胞筛选：有些载体质粒将特定的标记物（如GFP）植入细胞内，接着，使用不同颜色的染料或者发光技术，筛选出转染后的细胞，这将有助于后续的实验。
8.检测转染效率：使用细胞膜染色，PCR，蛋白表达分析来检测转染效率，以证实转染是否成功。
9.细胞接种：转染细胞分离后，接种到HMVEC或其他细胞上，以复制体系，以便进一步的研究。
细胞转染是一个复杂的过程，需要仔细地操作。
转染步骤及经验
转染步骤及经验转染是在生物实验中将外源基因导入到细胞中的常用操作步骤之一。
本文将介绍转染的步骤及经验，并提供一些实用的技巧，旨在帮助读者顺利完成转染实验。
一、实验准备在进行转染实验前，必须做好充分的实验准备工作。
以下是一些关键准备步骤：1.1 细胞培养与处理- 培养适量的目标细胞，并确保其良好的生长状态。
- 处理细胞，使其处于适宜转染的状态。
例如，对于贴壁细胞，可以使用酶消化将细胞分散为单个细胞。
1.2 载体准备- 准备带有目标基因的载体。
这可以是质粒、病毒等。
- 使用合适的方法制备高质量的载体DNA或RNA。
1.3 转染试剂- 准备合适的转染试剂，如转染剂、离子可溶液等。
不同类型的细胞需要使用不同的试剂。
二、转染步骤转染步骤的具体操作根据不同的实验目的和细胞类型可能会有所不同。
以下是一般的转染步骤：2.1 细胞处理- 将要转染的细胞洗涤并收集到离心管中。
- 注意不要创建过高的转染细胞密度，以免影响转染效率。
2.2 与载体混合- 将载体与转染试剂混合，形成载体-试剂复合物。
根据实验需要可做不同浓度的复合物。
- 注意操作过程中避免产生气泡，以防止对细胞的损伤。
2.3 加入转染复合物- 缓慢地将转染复合物滴加到细胞中，确保复合物均匀分布在细胞表面。
- 转染时间和温度应根据细胞类型和所用试剂进行优化。
2.4 培养细胞- 按照细胞所需的培养条件将细胞孵育在恰当的培养基中。
- 在培养期间，根据实验设计进行后续处理，如观察表型、提取蛋白等。
三、经验分享3.1 优化试剂浓度- 不同的细胞系对试剂的敏感度不同，需要根据实验经验进行优化。
试验应根据需要尝试不同浓度的试剂。
3.2 选择合适的转染方法- 根据研究目的和所用试剂的特性，选择合适的转染方法。
常见的转染方法包括化学法、电穿孔法、病毒载体法等。
3.3 控制转染时间和温度- 不同细胞对转染复合物的吸收速度有差异，应该根据细胞类型和试剂特性确定合适的转染时间和温度。
细胞转染实验报告结论(3篇)
一、实验背景细胞转染技术是现代分子生物学研究中的一种重要技术手段，它可以将外源DNA、RNA或其他生物大分子导入细胞内，从而实现对细胞功能的研究和调控。
本实验旨在通过细胞转染技术将目的基因导入细胞内，研究该基因在细胞中的表达情况和生物学功能。
二、实验目的1. 确保目的基因成功导入细胞内；2. 观察目的基因在细胞中的表达情况；3. 分析目的基因在细胞中的生物学功能。
三、实验方法1. 细胞培养：将HEK293细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养至对数生长期；2. 基因构建：通过PCR扩增目的基因，克隆至载体pEGFP-C1中；3. 转染：采用脂质体转染试剂将目的基因导入细胞内；4. 重组蛋白表达检测：通过Western blot检测目的蛋白的表达情况；5. 细胞功能分析：通过细胞实验（如细胞增殖、细胞凋亡等）分析目的基因在细胞中的生物学功能。
四、实验结果1. 成功构建目的基因表达载体：PCR扩增目的基因片段长度符合预期，测序结果与预期序列一致；2. 成功导入目的基因：转染后，细胞中绿色荧光蛋白（GFP）表达阳性；3. 目的蛋白表达：Western blot检测结果显示，转染细胞中目的蛋白表达水平显著高于未转染细胞；4. 细胞功能分析：通过细胞实验发现，目的基因的过表达对细胞增殖、细胞凋亡等生物学功能有显著影响。
1. 本实验成功构建了目的基因表达载体，并通过脂质体转染技术将目的基因导入细胞内；2. 目的基因在细胞内得到了有效表达，且表达水平显著高于未转染细胞；3. 目的基因的过表达对细胞增殖、细胞凋亡等生物学功能有显著影响，表明该基因在细胞中具有一定的生物学功能。
本实验结果表明，细胞转染技术是研究目的基因在细胞中表达和生物学功能的有效手段。
在今后的研究中，我们将进一步探讨目的基因在细胞中的具体作用机制，为相关疾病的诊断和治疗提供理论依据。
以下是对实验结果的详细分析：1. 成功构建目的基因表达载体：在实验过程中，我们通过PCR扩增目的基因，并克隆至载体pEGFP-C1中。
细胞转染实验步骤
细胞转染实验步骤嘿，你问细胞转染实验步骤？那咱就来好好聊聊。
做细胞转染实验啊，首先得准备好各种东西。
要有要转染的细胞，就像你要做饭得有食材一样。
然后得有转染试剂，这可是关键的玩意儿。
还有培养细胞的瓶子、培养基啥的。
不能少了这些家伙事儿。
接着呢，把细胞培养好。
把细胞放到合适的瓶子里，加上培养基，放在温暖的地方让它们好好生长。
就像你养小动物，得给它们一个舒服的地方。
得看着细胞长得差不多了才能进行下一步。
然后就是准备转染试剂啦。
按照说明书，把转染试剂弄好，不能弄错了比例啥的。
这就像你调饮料，比例不对味道可就不好了。
再把转染试剂和要转染的东西混合在一起。
可以是DNA 啊、RNA 啊啥的。
混合的时候要轻轻搅拌，不能太用力，不然会把细胞弄坏。
就像你搅拌鸡蛋，不能太猛了把鸡蛋弄破。
接着把混合好的东西加到细胞里。
要小心点，不能洒出来。
就像你给花浇水，不能浇得满地都是。
加完之后轻轻晃一晃瓶子，让它们混合均匀。
然后就是等待啦。
让细胞和转染的东西在一起待一段时间，让它们好好反应。
这时候可不能着急，不能老是去动瓶子。
就像你等蛋糕烤熟，不能老是打开烤箱看。
最后看看转染的效果怎么样。
可以用显微镜看看细胞有没有变化，或者做一些检测。
要是效果不好，就得找找原因，下次改进。
就像你做的菜不好吃，得想想是哪里出了问题。
我给你讲个事儿吧。
我有个同学，他做细胞转染实验。
一开始他手忙脚乱的，不是忘了这个就是弄错了那个。
后来他仔细按照步骤来，一步一步做好。
哇，最后转染成功了，他可高兴了。
从那以后，他做实验就更认真了。
所以啊，细胞转染实验要准备好东西，培养细胞，准备转染试剂，混合，加到细胞里，等待，最后看看效果。
只要你认真做，就能做好这个实验。
加油吧！。
转染科工作总结
转染科工作总结
转染科作为生物医药领域中的重要一环，承担着基因转染和细胞转染等重要任务。
在过去的一段时间里，我们团队在转染科工作中取得了一定的成绩，也积累了一些经验和教训。
首先，我们在转染试剂的选择上进行了深入的研究和比较，最终确定了适合我
们实验需求的转染试剂，并建立了相应的使用标准和操作流程。
这为我们后续的转染实验提供了可靠的保障。
其次，我们在转染细胞的培养和处理过程中，严格按照操作规程进行，确保了
转染实验的稳定性和可重复性。
我们特别注重对细胞状态的监测和记录，及时发现问题并进行调整，避免了实验结果的误差。
另外，我们也在转染实验的数据分析和结果报告上进行了规范化处理，确保了
实验结果的准确性和可靠性。
我们不仅对实验数据进行了多次核查，还对实验结果进行了详细的解读和总结，为后续的研究工作提供了有力的支持。
然而，我们也在转染科工作中遇到了一些挑战和问题。
比如，在实验操作中出
现了一些偶发的意外情况，导致了实验结果的偏差，这给我们的研究工作带来了一定的困扰。
同时，我们也发现了一些转染试剂的稳定性和可靠性方面的问题，这需要我们与厂家进行深入的沟通和解决。
总的来说，转染科工作是一个复杂而又重要的工作环节，需要我们在实验操作、数据分析和结果报告等方面都保持高度的严谨和负责。
我们将继续努力，不断提升自身的专业水平，为科研工作的顺利开展做出更大的贡献。
细胞转染经验分析报告
细胞转染经验分析报告细胞转染是一种常用的实验技术，用于将外源基因导入到细胞内，使其表达特定蛋白质或产生特定功能。
在进行细胞转染实验时，存在很多关键因素会影响转染效果。
本文将基于我以前进行的转染实验经验，对转染过程中的几个关键要点进行分析和总结。
首先，选择合适的细胞株是保证转染效果的重要因素。
不同的细胞株对转染方法和条件的敏感度不同，因此，在选择转染细胞株时需要根据具体目的和实验要求进行合理选择。
同时，在与细胞株相配套的培养基和培养条件下进行细胞转染可以提高转染效率。
其次，选择适当的转染试剂和转染方法是影响转染效果的重要因素。
常见的转染试剂包括化学试剂（如聚乙烯醇、脂质体等）和病毒载体（如腺病毒、腺相关病毒等）。
不同的转染试剂适用于不同类型的细胞和目标基因，应根据实验需要选择合适的转染试剂。
另外，不同的转染方法也会对转染效果产生影响，如电穿孔法、矢量转染法等，需要根据实验需求选择适当的转染方法。
再次，优化转染条件是提高转染效率的重要途径。
转染条件包括转染试剂浓度、转染时间、细胞密度等因素。
不同的细胞株和转染试剂对转染条件的敏感度不同，因此，需要根据实验要求进行一系列条件优化实验，寻找最佳的转染条件。
此外，转染后合理的培养时间和条件也可以提高转染效果，如转染后适当延长培养时间，给细胞充分时间表达目标基因。
最后，转染效果的评估是对转染实验结果进行分析的重要环节。
常用的转染效果评估方法包括荧光显微镜观察、Western blotting、PCR等。
根据实验目的和目标基因的特点，选择合适的评估方法进行转染效果的定量或定性分析。
综上所述，细胞转染是一项复杂的实验技术，转染效果受许多因素影响。
通过选择合适的细胞株、转染试剂和转染方法，优化转染条件，并采用合适的评估方法进行转染效果的评估，可以提高转染效率和准确性，为后续实验研究提供可靠的基础数据。
细胞转染实验总结
细胞转染实验总结
细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。
用于研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中。
实验方法：
转染试剂的准备：将400μL去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。
震荡后将试剂放在－20℃保存，使用前还需震荡。
选择合适的混合比例(1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量)来转染细胞。
在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。
加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。
将混合液在室温放置10―15min。
吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。
加入混合液，将XXX细胞放回培养箱中培养一个小时。
到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。
细胞转染效率低的原因及解决方案
细胞转染效率低的原因及解决方案
细胞转染是细胞生物学和分子生物学的一种常用的技术手段。
而转染效率低下却是实验人员经常遇到的问题，尤其是原代细胞转染，转染难度更大。
现分享几个细胞转染实验常见的几个陷阱，望实验人员能够注意。
1.准备不足
做细胞转染的时候，在开展正式实验前要多做预试验，优化转染条件。
优化转染条件包括：转染试剂的用量、DNA密度、细胞密度、试剂和DNA混合孵育时间等等。
2.细胞污染
细胞污染也是造成细胞死亡，转染效率低下的一大原因。
首先，转染细胞用的质粒必须保证无菌。
而现在市场上的一般的质粒提取试剂盒都做不到绝对无菌。
分享一个小秘诀：将提完质粒后或者提的最后一步，用75％乙醇沉淀，这样就除菌了。
3.质粒质量问题
转染用的质粒首先要保证数量，一般为2μg以上。
质粒纯度不够或者含有细菌LPS或其他对细胞有毒害作用的物质，也会影响转染效率。
这个时候，就应该对质粒进行纯化和浓缩。
4.细胞状态不好
细胞状态不好，会导致转染效率低下。
一般进行转染的细胞应该处于对数生长期。
如果是贴壁细胞的话，贴壁率应该在70-80%；如果是悬浮细胞的话，应该是6×105个/孔（24孔板），一般是转染前一天换液，转染前用无血清培养基或PBS洗细胞一次。
5.转染试剂问题
脂质体试剂毒性较大，易造成细胞死亡和转染效率底下。
可选择非脂质体转染试剂，如Entranster试剂。
细胞转染工作总结
细胞转染工作总结细胞转染是将外源性核酸（如DNA、RNA 等）导入细胞内的过程，这一技术在生物学研究和基因治疗等领域具有重要意义。
在过去的一段时间里，我深入参与了细胞转染相关的工作，以下是对这段工作的总结。
一、实验背景与目的细胞转染技术旨在实现特定基因在细胞内的表达或抑制，以研究基因功能、蛋白质相互作用，以及开发基因治疗策略等。
我们的实验目的主要是将构建好的重组质粒或 siRNA 成功导入特定的细胞系，观察其对细胞生物学行为的影响。
二、实验材料与方法1、细胞系选择根据实验需求，我们选用了多种细胞系，如 HeLa 细胞、HEK293细胞等。
这些细胞系具有不同的生长特性和转染效率。
2、转染试剂尝试了多种转染试剂，包括脂质体转染试剂（如 Lipofectamine 2000、Lipofectamine 3000）、阳离子聚合物转染试剂（如 Polyethylenimine，PEI）等。
不同的转染试剂具有不同的适用范围和转染效果。
3、核酸制备重组质粒通过细菌培养、提取和纯化获得。
siRNA 则通过化学合成或体外转录制备。
在使用前，均对核酸的浓度和纯度进行了检测，以确保其质量符合转染要求。
4、转染操作在转染前一天，将细胞接种于合适的培养板中，使其在转染时达到70%－80%的汇合度。
按照转染试剂说明书，将适量的核酸和转染试剂分别稀释在无血清培养基中，然后混合孵育一段时间后，加入到细胞培养体系中。
5、转染效率检测转染后一定时间（通常为 24-72 小时），通过荧光显微镜观察荧光蛋白的表达来评估转染效率；或者通过定量 PCR 检测目的基因的mRNA 水平，以及 Western blot 检测目的蛋白的表达水平。
三、实验结果与分析1、不同细胞系的转染效率不同细胞系对转染试剂的敏感性存在差异。
例如，HeLa 细胞对脂质体转染试剂的反应较好，而 HEK293 细胞对阳离子聚合物转染试剂的耐受性更高。
这可能与细胞的表面特性、内吞机制以及代谢状态等因素有关。
师姐整理之细胞转染技巧
师姐整理之细胞转染技巧1、细胞转染有脂质体转染，病毒转染、电转染、磷酸钙法、显微注射….下面主要讲最常用的脂质体lip2000介导的细胞转染。
2、转染效率影响因素：1、细胞种类，细胞状态，2、质粒大小，3、转染试剂。
3、转染前细胞的状态和密度都非常影响转染效率和后期的实验结果。
转染时细胞的密度为50%-80%较好，同时注意在转染后收细胞时的密度不要过爆。
比如转染质粒到细胞内，48小时后做WB，那么此时细胞的密度最好不要长满. 因为细胞长的过爆严重影响细胞的状态（周期进程阻滞，凋亡增加等）从而影响实验结果。
一般为前一天下午铺板，第二天上午进行转染，48小时候收细胞进行功能检测。
4、不同的质粒和脂质体最佳搭配比例不同，转染前，应该摸一个最佳配比。
质粒：脂质体=1：1， 1：1.5， 1：2， 1：2.5， 1：3，1：3.5的梯度比例来检测最佳转染比例（一般质粒有带荧光，可以通过观察每组荧光强弱来判断转染效率，没有荧光的只能通过qPCR来检测各组转染效率）。
5、质粒的纯度影响转染效率：1、脂质体转染基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。
2、含有内毒素的质粒对细胞有很大的毒性作用。
建议使用QIAGEN公司的超纯质粒抽提试剂盒。
6、转染时，小心轻柔的将lip2000加到培养基中并轻轻混匀（说明书上的用词为：Mix gently），避免粗暴用力吹打，会导致脂质体失效。
7、转染时各种培养皿添加的质粒和脂质体参考量见下表：8、虽然现在的大多数转染试剂可以使用带血清的培养基进行转染，但转染时建议用无血无抗生素的opti-MEM培养基提高转染效率。
转染后6小时更换培养基，一是lip2000具有一定毒性，二是培养基需要更换成有血清培养基。
9、支原体污染会严重影响细胞转染的效率，且支原体污染不会像细菌污染那么明显可见，转染前可以用环丙沙星杀一杀支原体。
转染实验心得体会
转染实验心得体会转染实验是生物学研究中常用的实验方法之一，通过将外源基因导入目标细胞中，实现对特定基因功能的研究。
转染实验的设计和操作需要细致、精确，同时还需要充分利用所学的理论知识，对实验结果进行合理的解释和分析。
通过参与和进行转染实验，在实践中加深了我对生物学的理解，同时也培养了我实验设计和操作的能力。
在进行转染实验之前，首先要明确实验的目的和所需的结果。
对于转染实验来说，可能的目的包括了解外源基因的功能、研究细胞信号传导途径以及分析基因的表达和调控机制等。
明确实验目的之后，就可以选择合适的细胞系和转染方法。
不同的细胞系对于转染的敏感性也不同，因此需要对不同的细胞系进行前期的验证和优化试验，以确定最佳的转染条件。
接下来，需要进行载体构建和纯化，这是实验的关键步骤之一。
载体构建的过程需要充分利用DNA重组技术，通过将所需的外源基因克隆到适当的载体中。
在这一步中，我们需要熟悉DNA测序和酶切等实验方法，以确保所克隆的外源基因正确无误。
构建完成后，需要进行质粒纯化，以获得高质量的重组质粒。
质粒纯化的方法主要包括离心法、滤纸层析法和离子交换层析法等。
质粒纯化的目的是去除杂质和纯化转染所需的载体DNA，以确保实验结果的可靠性。
在实验中，转染是一个重要的步骤。
转染方法的选择和优化对于实验的结果至关重要。
常用的转染方法包括化学法、电穿孔法和病毒载体法等。
不同的转染方法有着各自的优缺点，需要结合实验目的和细胞特性进行选择。
转染后，需要进行适当的处理和培养来确保转染的效果。
培养条件的优化对于细胞的存活和分裂等也起到重要的作用。
最后，进行实验结果的分析和解释。
实验结果的分析需要结合实验设计和操作来进行。
通过对转染细胞进行观察和检测，可以获得外源基因表达的情况，以及对目标基因功能的了解。
实验结果的解释需要基于生物学理论和文献研究，对数据进行统计学分析和生物学意义的解释。
这一步需要对所学的生物学知识进行综合应用，以对实验结果进行科学的解释。
细胞转染技术从入门到精通
细胞转染技术从入门到精通概念：概括地说，转染是使用非病毒感染的手段人工引入核酸（DNA或RNA）进入细胞的过程。
转染的目的是产生重组蛋白，或特异性增强或抑制转染细胞中的基因表达。
转染的类型根据导入的核酸存在于宿主细胞的时间长短，可以分为瞬转和稳转。
根据转染方式可以分为化学，生物，物理方法。
瞬转：因为导入的核酸没有整合到宿主细胞基因组，因此它只会短暂地存在于宿主细胞中，不会随着细胞的分裂而进入到子代细胞中。
然而，导入的遗传物质的高拷贝数导致其在细胞内的蛋白质表达水平较高。
根据所使用的载体的不同，瞬转通常可以1至7天内进行基因检测，但是瞬时转染的细胞通常在转染后24-96小时收获。
当使用超螺旋质粒DNA时，瞬时转染的效果最好，推测是由于超螺旋质粒DNA能更有效地被细胞摄取。
稳转：外源DNA整合到细胞基因组中或作为附加体质粒保留在细胞中。
与瞬时转染不同，稳定转染允许外源DNA在转染的细胞及其后代中的长期维持。
然而，通常是将单拷贝或几个拷贝的外源DNA整合到稳定转染的细胞的基因组中，因此，其表达水平一般低于瞬时转染的表达水平。
由于稳转效率较低，因此选用有效地转染策略和筛选方法很重要。
其中比较可靠地筛选方法是在DNA载体中包含选择性标记，然后在细胞转染短暂性恢复后进行适当地选择性加压。
尽管相对于超螺旋DNA，线性DNA被细胞摄取的效率较低，但其能最有效地整合到宿主基因组中。
目前，由于各种转染试剂的发明，哺乳动物细胞的瞬时转染已经用于生产具有适当折叠和翻译后修饰的重组蛋白。
但表达mg/L-g/L 的重组蛋白主要依赖于稳定细胞系的产生。
瞬转和稳转的比较瞬转稳转导入的DNA没有整合到基因组中，而是保留在细胞核上导入的DNA整合到基因组中导入的遗传物质不传递到子代；遗传改变只是暂时的导入的遗传物质能够代代相传；遗传改变是永久的不需要选择性筛选需要选择性筛选出稳定转染的细胞DNA载体和RNA都可用于瞬时转染只有DNA载体可用于稳定转染；RNA本身不能稳定地导入细胞中导入的遗传物质的高拷贝数导致高水平的蛋白质表达。
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转染注意因素有血清时的转染血清一度曾被认为会降低转染效率，但只要在DNA-阳离子脂质体复合物形成时不含血清，在转染过程中是可以使用血清的。
转染过程在两步中需要使用培养基做为稀释液：在DNA-阳离子脂质体复合物准备过程以及复合物同细胞接触过程。
在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基，因为血清会影响复合物的形成。
但在复合物形成后，在加入细胞中前可以加入血清。
阳离子脂质体和DNA 的最佳量在使用血清时会有所不同，因此如果你想在转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。
大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康。
对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用OPTI-MEMⅠ培养基，一种营养丰富的无血清培养基，或者在转染培养基中使用血清。
对于对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。
培养基中的抗生素抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。
这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。
这降低了细胞的活性，导致转染效率低。
所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。
这样，在转染前也不必润洗细胞。
对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。
另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。
细胞维护和培养的演变可以通过常规的次培养步骤保持转染铺板前的细胞健康。
每周传代一到两次，稀释程度使得下次传代前细胞几乎融合。
不要使细胞保持融合超过24小时。
大多数已建立的细胞系都是非整倍体，原代培养包括了表达不同基因组合的细胞的混合物。
细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。
这会导致和转染相关的细胞行为的变化。
如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。
比如，新鲜融化的NIH 3T3细胞比传代8次的细胞表现出更高的转染效率（图13）。
融化细胞的进一步传代并没有降低转染效率。
因此，如果观察到转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。
或者，几种来源于经筛选，转染效率较高细胞亚系的细胞系现在有售。
细胞铺板密度用于转染的最佳细胞密度根据不同的细胞类型或应用而异。
一般转染时，贴壁细胞密度为70%-90%，悬浮细胞密度为2×106-4×106细胞/ml时效果较好。
确保转染时细胞没有长满或处于静止期。
因为转染效率对细胞密度很敏感，所以在不同实验间保持一个基本的传代步骤很重要。
铺板细胞数目的增加可以增加转染活性和细胞产量。
在三种不同密度进行细胞铺板的比较表明铺板密度最高的，CAT活性也最高（图14）。
得到最高活性所需的LIPOFECTAMINE试剂的量也相应增加了。
这些结果说明，对于转染相同量的DNA所需的最佳阳离子脂质体试剂的量会因细胞密度而异。
启动子的选择获得高转染活性所需选择的启动子依赖于选用的细胞系和要表达的蛋白。
CMV启动子在大多数细胞类型中可以获得高表达活性。
同其他启动子，如SV40和RSV（劳斯肉瘤病毒）相比，在BHK-21中其活性最高（图15）。
这三种病毒启动子在T细胞来源的细胞系，如Jurkat中组成表达水平较低。
转染后在培养基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat细胞中CMV启动子，而单PMA就足以激活KG1和K562（人骨髓瘤白细胞）中的CMV启动子。
SV40启动子的表达在含有大T抗原（存在于COS-1和COS-7）时会提高，因为大T抗原可以刺激染色体外的合成。
DNA量高质量的DNA对于进行高效的转染至关重要。
以前研究者使用CsCl梯度离心得到的DNA进行转染，但是这种方法费时费力。
其他的质粒纯化技术如Marligen的High Purity Plasmid Purification System 使用独特的阴离子交换树脂纯化DNA，可以得到用于转染的高质量DNA（图16）。
另外，Marligen的纯化系统实验步骤很简单，可以在2小时内完成。
瞬时和稳定表达DNA转染后，转入基因的表达可以在1－4天内检测到。
仅有一部分转入细胞的DNA被转运到细胞核内进行转录并最终输出mRNA到细胞质进行蛋白合成。
几天内，大部分外源DNA会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释；一周后就检测不到其存在了。
瞬时表达分析检测未重组质粒DNA上基因的表达。
因此，表达水平与位臵无关，不会受到周围染色体元件的影响。
瞬时表达分析所需的人力和时间比稳定表达少，但因为DNA摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大，实验必须很小心。
为了进行稳定表达，转入的基因必须能和细胞同步复制。
在转染的质粒自发整合到宿主基因组上时就会如此。
在一小部分转染的细胞中，加入的DNA通过重组整合到基因组上。
包含整合DNA的细胞很少，必须通过对药物的抗性筛选进行扩增或通过表型变化进行鉴定。
稳定基因表达实验需要数周，如果需要验证蛋白产量，所需的时间更长。
但得到的细胞系可以做为蛋白生产的稳定来源或用于得到转基因动物。
瞬时转染和转染效率的监测基因的瞬时表达在24-72小时内就结束了。
这种快速的瞬时表达非常适用于验证质粒表达和监测转染步骤的效率。
可以使用报告基因来确定优化条件，其表达蛋白易检测，在目的细胞中不含此蛋白或水平很低。
常用的报告基因包括氯霉素乙酰转移酶（CAT），绿色荧光蛋白（GFP），荧光素酶（Lux或Luc）以及b- 半乳糖苷酶（b-gal）（表4）。
可以使用简单的非同位素方法检测b-gal的表达以测定转染效率和活性（参见第7章实验步骤）。
pCMV?SPORT- bgal质粒包含CMV启动子调控下的LacZ基因，转染入真核细胞内后可以直接表达bgal。
结合简单的检测步骤，可以做为监测转染条件的一种方便灵敏的方法。
稳定转染细胞系的筛选连同带有药物抗性的筛选标记基因一起转染目的基因是建立稳定转染细胞系最常用的方法。
氨基糖苷磷酸转移酶基因（APH或neor）可以合成APH酶，通过磷酸化使药物失活，从而提供对GENETCIN选择性抗生素（G418 Sulfate）的抗性。
抗生素抗性基因可以与目的基因在同一个质粒上，也可以在不同的质粒上。
如果两个不同的质粒同时转染，两个质粒都可能整合形成稳定转化子。
对于两种不同质粒的共转染，带有目的基因的质粒和带有筛选标记的质粒间的比例为3:1或更高以保证抗性克隆带有转染的目的基因。
阳离子脂质体试剂提供了一种建立稳定转染株的高效方法。
瞬时转染效率的改进一般也会提高稳定转染效率。
比如，使用LIPOFECTAMINE PLUS试剂得到的NIH 3T3细胞GENETICIN抗生素抗性克隆的数目比单独使用LIPOFECTAMINE增加了大约3倍（图17）。
要进行稳定的表达分析，在转染后次培养细胞，低密度铺板，给予生长空间，在几天或数周内保持筛选压力。
生长的细胞比不分裂的细胞更快的受到GENETICIN抗生素的影响。
转染后，在开始筛选前等待48-72小时，使细胞表达足够量的抗性酶，保证在开始筛选时可以自我保护。
转染后48-72小时倒掉培养基，加入含有GENETICIN抗生素的培养基，抗生素的浓度根据剂量反应曲线确定，足够杀死未转染细胞。
因为许多因子影响到筛选所需的GENETICIN 抗生素的最佳浓度，包括细胞类型，培养基和血清浓度等，所以有必要对每种细胞作一个剂量反应曲线，确定最佳浓度（参见第7章实验步骤）。
筛选最多可能需要一周时间，因为在致死剂量的GENETICIN抗生素存在条件下，细胞会分裂1-2次。
在次培养细胞时使用较低剂量的抗生素，一般是筛选剂量的一半。
筛选后的细胞一般是离散的克隆，根据实验目的不同，可以分别纯化（克隆），收集进行大量培养或染色并进行抗性克隆的计数。
蛋白表达和培养基的选择哺乳动物细胞系合成可溶的，翻译后修饰的蛋白，比细菌，真菌或昆虫细胞中表达的蛋白更有可能有生物活性。
稳定转染的细胞可以合成大量的重组蛋白，而瞬时转染细胞可以快速表达，迅速地合成小量蛋白。
常用的细胞系包括CHO，293和COS-7。
Invitrogen提供克隆的293-F，293-H，COS-7和CHO-S细胞，来源于经筛选转染效率更高的亚细胞系。
这些细胞也可用于无血清和限定化学成分培养基。
重组蛋白的大规模生产一般在稳定转染的悬浮细胞中进行。
这些细胞易于生长到高密度并合成更多蛋白。
使用基质珠做为固相支持可以使贴壁细胞悬浮生长。
用于蛋白生产的细胞的转染可以在添加有血清或无血清培养基中进行。
但更倾向于使用无血清培养基表达蛋白，因为血清蛋白会干扰下游表达蛋白的纯化。
无血清培养基一般针对某一特定细胞类型优化并有几类无血清培养基不需要添加血清，一般含有不均一的或大量的蛋白（但比添加血清的培养基低得多）。
无蛋白培养基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物。
限定化学成分的培养基不含有蛋白或未知组成的成分。
多种多样的配方使您可以选择最适合您应用的一种。
在含血清时转染的细胞可以适应无血清培养基，无蛋白培养基或限定化学成分的培养基。
在部分情况下（如293-F，293-H，COS-7和CHO-S），对于已适应无血清或无蛋白培养基的细胞，可以使用其培养基进行转染（图18）。
其他一些无血清培养基包含抑制阴离子脂质体介导转染的成分。
在这些情况下，有必要在诸如D-MEM或OPTI-MEMⅠ等培养基中进行培养和转染。