药品分析方法建立及验证_从质量控制出发

分析方法验证——验证项目
验证项目 ChP
准确性 精密度 耐用性 线性 范围 专属性 检测限 定量限
鉴别试验 杂质定量
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-不强制要求
杂质限度 活性测定
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+必须进行
含量测定
+ + + + + + -
限度、鉴定等定性或半定量试验，无标准曲线，不作精密度、准确度要求。
健康元生物医药有限公司
药品分析方法建立及验证
——从质量控制出发
2016.03.23
目录
•方法开发考虑 •方法哪里来 •开发什么方法 •检测方法初识 •分析方法验证 •分析方法确认及再验证
方法考虑原则
预期的监督机构期望 产品质量参数对安全性和有效性的预期影响 分子的具体开发经验 来自之前以开发的类似分子的平台经验
方法开发考虑
从不同正交试验或从主要和辅助试验所得的杂质量 并不是可以累加的
生物制品需要多项检测来检量其多种特性，如电荷、 分子大小等
如果一个分子包含多种修饰，则它将被多次计算， 但是降解的分子仍然只有一个
所以不同检测所得到的值是不能累加的
方法开发考虑
很多时候，峰并不能达到基线分离 可容许实验误差较大 定量限较高
分析方法验证——精密度
定义：对均一样品重复取样检测每个检测结果间的接近程度，RSD%,CV% 重复性repeatability：短时间内同一分析人员使用同一仪器 中间精密度intermediate precision:在同一实验室内的变化，如不同分析时 间、不同分析人员、不同分析仪器 重现性reproducibility:在不同实验室内重复
资料6.质量研究资料，临床前有效性及安全性研究资料 （1）质量研究及注册标准研究资料； （2）检定方法的研究以及验证资料； （3）与同类制品比较研究资料； （4）产品抗原性、免疫原性和动物试验保护性的分析资料； （5）动物过敏试验研究资料； （6）动物安全性评价资料。
分析方法验证——法规要求
1.6探索性研究及其检验结果分析 1.6.1开展探索性研究项目及其目的。叙述开展探索性研究的项目，研究目的，采用 的主要方法。 1.6.2探索性研究及其检验结果分析。逐项叙述探索性研究项目详细研究方法，样品 与对照品的典型图谱或照片，研究结果与结论。 该项目的方法学按中国药典附录验证，详细方法学验证内容在附件中列出。
线性（linearity） 范围（range）
检测限（detection limit） 定量限（quantitation limit）
耐用性（robustness）
机构（organization） USP,EP,ChP,ICH ISO 17025 USP,EP,ChP,ICH
ICH,ChP,ISO 17025 ICH,ChP
分析方法验证——验证项目
验证项目 USP
I类
准确度
+
精密度
+
源自文库
专属性
+
检测限
-
定量限
-
线性
+
范围
+
-不强制要求
II类
定量
限度检查
III类
IV类
+
*
*
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+
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+
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+
+
*
+
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*
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+
*
*
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+必须进行 * 根据不同的方法特点也可能需要
❖I类方法：制剂中原料药或活性成分（包括防腐剂）的定量分析方法； ❖II类方法：原料药中杂质或制剂中降解化合物的分析方法；包括定量方法和限度检查； ❖III类方法：药物性能特征分析方法：溶出，药物释放 ❖IV类方法：鉴别实验
USP,ChP,ICH,ISO 17025 USP,EP,ChP,ICH,ISO 17025 USP,EP,ChP,ICH,ISO 17025
USP, ChP,ICH USP,EP,ChP,ICH,ISO 17025 USP,EP,ChP,ICH,ISO 17025
USP,EP,ChP, ISO 17025
3. 对酸、碱、高温、冻融等不稳定，保存、运输条件不当会影 响药品质量，并可能导致方法转移困难或失败。
4. 标准物质：活性标准品、含量标准品、理化对照品，根据情 况可能分别制备，保存、运输条件相对较高，需对其稳定性进 行认真分析与评价。
方法哪里来
标来准自方参法考（文或献正的式方方法法、法定方法） 一是指般在是指专已业有杂国志家或标著准作的上质发控表方并法介，绍W的H方O法，推一荐般的要质认控方真法对待也此可
分析方法验证——专属性
定义：指一种方法在有可能的干扰物质（如杂质、降解产物和基质）存在时， 能够准确无误地评估被分析物的能力
鉴别:确保可以鉴别被分析物 纯度检查：确保所有的分析过程能够为杂质的含量提供准确的数据，如相关
物质检查、重金属限度检查、有机挥发性杂质检查等 含量测定：提供准确的检测结果以保证含量样品中被分析物的含量或效价值
方法开发考虑
如何解释不是针对完整分子而是针对裂解部分所进行的 检测而获得的数据
有时有必要将一个蛋白分子裂解为所需的片段，然后对 所关注的片段进行分析，如用于蛋氨酸氧化测定肽图
多数时候片段并非以简单直接或线性的方式与完整分子 相关联（不再是1：1）
需要明确地确定完整分子的片段进行分析而得到的某些 参数的报告值
用另外一种官方的标准或经验证的方法对样品和经降解的样品分析，比较两种方法得 到的杂质概况 使用其他技术对峰纯度进行检查，如二极管阵列检测器、MS等 含量测定：被分析物与其他干扰峰完成分离。向样品中加入一定量的干扰物，含量测定 的结果不受干扰；检查主峰的纯度
鉴别：采用与被测物结构类似的化合物以及被测物分别进行鉴别试验。被测物为正反应。 被测物结构类似的化合物为负反应。测物结构类似的化合物可选用中间体、副产物或降 解产物等。
方法开发考虑
折叠结构可以防止生物制品降解，但同时使分子的 某些部分难以被检测到
被结构所保护的易受影响基团延缓了降解过程（氧 化、脱酰胺基、切断和聚合）
完整结构使得分析方法很难检测到内部的变化
在某些分析中保持三维结构是很重要的（如SEC）， 但在其他一些分析中则需拆开折叠结构（如变性凝 胶电泳）
的成立基础。
若一应采般进用认一与为步产该验品方证相法被似的检工特测艺异物进中性行其较处它好理物。后质为再能表免否明
一般采用相似物、不含API空白样品 疫细引动起胞非物测特，定异则方性所法免获的疫得特反抗异应体性。的，特可异进性行更相好关。试
作为阴性对照，以标准品或经认可样 另验外进，行产验品证中，存如在加的入大抗量体目或的特蛋异白抑可制能剂
开发什么方法
适用于特定分子的方法 活性测定
Elisa（体外评价） 动物实验 （体内评价） 中和实验 （细胞测定特定表位）
降解物测定
HPLC/MS（基于标准样校正或自身对照） 凝胶电泳 （基于特异分子带） SEC/荧光光谱 （解聚或聚合）
开发什么方法
检测方法初识——电泳及毛细管电泳
分析方法验证——法规要求
分析方法验证——法规要求
分析方法验证——法规要求
第十二条 质量控制的基本要求： （四）检验方法应当经过验证或确认； 第二百二十三条 物料和不同生产阶段产品的检验应当至少符合以下要求： （二）符合下列情形之一的，应当对检验方法进行验证：
1.采用新的检验方法； 2.检验方法需变更的； 3.采用《中华人民共和国药典》及其他法定标准未收载的检验方法； 4.法规规定的其他需要验证的检验方法。 （三）对不需要进行验证的检验方法，企业应当对检验方法进行确认，以 确保检验数据准确、可靠；
方法 100％浓度≥6次 3浓度×3次
分析方法验证——准确度
定义：方法的检测结果与真实值的接近程度。 －方法：
原料药：分析已知含量的对照品；第二种确定的方法分析，结果比较 制剂：加样回收；第二种确定的方法分析，结果比较 应在方法的范围内 计算回收率：3浓度×3次
作类为方重法要，参并考需进。行此全类面方的法验在证被确。定应为说标明准参方考法文前献已的经出过处了，适附当原的文 验及译证文。。申报者应说明方法的来源，并附具体方法。研制单位在首 自己次建采立用的此方类法方法前，也应对该方法进行适当的验证，如进行专属 性对和于精某些密产度品的验，尤证其，是以创便新证性明产在品实来际讲的，使由用于条缺件少下可该参方考法的也方是法适， 用通的常。需要自己建立一种新的分析方法，对于这类方法需进行全面 标准而方严法格的的替验代证方。法 此类方法系指由申报者提出的可取代标准方法的替代方法。申报 者在决定采用此类方法时应持慎重的态度，并需提供表明新方法 等同于或优于原方法的依据以及全面的验证资料，包括两种方法 的比较性资料。
对于所要分析的蛋白质物种，通常无法获得纯的样品 用来进行加样/回收的物质是所要分析的蛋白质物种
（杂质）的富集物，而不是纯化物
方法开发考虑
基质（配方组成）或酸碱度变化、自由巯基的出现等， 可能在分析过程中形成原来并不存在的杂质
通过溶液交换消除基质影响
减少暴露于过高或过低酸碱度溶液的时间
在某些特定方法中，自由巯基会导致分析方法造成的杂 质
适用于所有分子的方法 分子大小概况
SEC（原始状态） 凝胶电泳法（非折叠（变性）状态）
病毒样颗粒概况
电镜（局部原始状态，人为影响因素大） DLS（原始状态，分辨率差，大小精准） SEC（原始状态，流动相会影响蛋白状态）
开发什么方法
适用于所有分子的方法 杂质残留量
HPLC（基于标准样校正或自身对照） GC（对残留溶剂） ICP/AAS （对元素测定） Elisa （宿主蛋白、杂蛋白测定） Southern Blot/荧光光谱 （残留DNA）
检测方法初识——SEC
检测方法初识——DAD光谱
检测方法初识——荧光光谱
检测方法初识——HPLC肽图
检测方法初识——UV Cp-Temp
检测方法初识——HPLC肽图
睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)
检测方法初识——ESI-MS
分析方法验证——法规要求
品作为阳性对照。
影的响封残闭余实宿验主等蛋。白如的果测成定品，中应加进入行了相可关能
验影证响以活排性除测此定种的影辅响料。，应进行相关验证
以排除此种影响。
分析方法验证——专属性
定性分析（鉴别）：样品阳性结果＋空白阴性结果＋结构相似物质的阴性结果； 杂质检查（对照品可得）：将可能的杂质对照品加入样品中； 杂质检查（对照品不可得）：
这些都是要设法避免
方法开发考虑
1. 生物学活性：是反映生物技术药物质量的重要指标，通常使 用细胞或动物进行测定，误差相对较大。不同批细胞、血清、 或其它易变性物质对测定方法的准确度和精密性均有影响。
2. 生物技术药物多为生物大分子药物，具有分子量大、结构多 样性和可变性等特点，结构的细微变化可影响药物的活性和质 量。
准确无误
分析方法验证——专属性
例如：
在其他成分（杂质、降解产物、辅料 如采用细E免L胞疫IS测印A法定迹检方试测法验重检进组行测产生品物的制活残品性余的，宿鉴应 等）存在下，采用的分析方法能够正 主首别蛋先，白说应含明首量被先，测对可物所采质使用与与特抗表定体达的体细特系异胞相性应同进答的行之 确测定被测物的能力。作为分析方法 宿间分主的析细相；胞关若的性供蛋，试白如品作二中为者还免的存疫在相原其关制它性备组较抗分好体，，则
开发什么方法
适用于特定分子的方法 分子鉴定
肽图 （纯度较高） Western Blot （使用范围广） 紫外扫描图 （纯度及基质要求高） 氨基酸测序 (纯度及基质要求高，样品末端无封闭）
偶联密度
ADC （抗体药物偶联物） 抗原与载体蛋白偶联物（疫苗类药物）
结合力 抗原与佐剂相互作用
分析方法验证——验证项目
参数（parameler) 专属性/特异性（specificity）
选择性（selectivity） 精密度（precision） 重复性（repeatability） 中间精密度（intermediate precision） 重现性（reproducibility） 准确度（accuracy）
开发什么方法
适用于所有分子的方法 蛋白浓度或含量
紫外/可见光光度法（基于消光系数，灵敏度低，干 扰物多）
高效液相色谱法（基于标准样校正） BCA/TCA/G250（基于标准样校正，基质有可能干
扰)
电荷概括
离子交换色谱（原始状态） 毛细管等电聚焦法（原始状态和局部变性状态）
开发什么方法