绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用
绿色荧光蛋白在细胞成像中的应用
绿色荧光蛋白在细胞成像中的应用生物医学研究中，细胞成像的应用非常广泛。
而绿色荧光蛋白(GFP)因为可溶性、稳定性、表达方便等优点，已成为生物荧光成像研究中较为常见的标记基因。
下面我们从GFP的来源、结构、特点以及在细胞成像中的应用等几个方面来分析这一常用工具。
GFP的来源及结构GFP最初被从荧光海葵(Aequorea victoria)中发现，并被用于标记蛋白质的表达。
GFP经过多年的研究，现在已经应用于生物医学研究中的细胞成像、NGS等领域。
GFP分子由238个氨基酸组成，可以折叠成11个β转角和一个层状的环形。
其中β转角通过大量蛋白质交联形成β桶结构，环形结构中则存在一个由三个氨基酸组成的柔性环（5-8咪单元环），它能够在荧光染色分子进入柔性环的情况下，自发地形成苯环，同时改变自己的电子排布，从而发出强烈的绿色荧光信号。
GFP的特点与其他荧光染色物相比，GFP有以下几个特点：1. 可重复性：GFP的表达是稳定的，可以在不同的实验中使用。
2. 可控性：GFP标记可以通过表达载体进行控制，允许调整GFP的表达水平和特定部位的表达。
3. 可视性：GFP标记可直接被观察到，无需显微镜观察或临床检查，对于生物诊断和治疗研究具有很大的价值。
4. 可变化性：GFP有多种突变的形式，因此可以用于定量研究。
5. 无毒性：GFP标记物不会对健康产生影响。
GFP在细胞成像中的应用由于GFP的绿色荧光强度和GFP蛋白质的表达量之间的相对线性关系，因此GFP被广泛用于细胞成像的研究。
GFP也可以同时标记多个蛋白质，以便研究他们之间的交互作用。
在细胞成像中，GFP可以用来确定细胞形态、位置、运动和信号传导等特定事件。
例如，GFP透过标记膜蛋白的方法，可以标记出特定结构如细胞膜、线粒体、内质网、细胞核、胞板等等。
此外，GFP可以标记蛋白质酶、膜转运蛋白、核酸酶、激酶等多种细胞分子，具有非常丰富的变化形式，如分子翻译、效果、降解等等。
绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白GFP的研究与应用摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一种极具潜力的标记物，有着广泛的应用前景。
通过阅读吴沛桥的《绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用》这篇文献，对GFP有了进一步了解。
关键词：绿色荧光蛋白（GFP）；性质；原理；应用1 引言发光是海洋无脊椎动物中普遍存在的现象，一些腔肠动物包括水母、水螅和珊瑚等受到机械性干扰时都可发射绿色荧光，而栉水母类发射蓝色荧光。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。
1962 年,Shimomura 等从维多利亚多管水母（Aequoria victoria）中分离纯化生物发光蛋白质——水母蛋白, 并观察到一个在紫外光下发出“非常明亮, 浅绿色荧光”的副产物。
1974 年,Shimomura等纯化得到了这种自发荧光的蛋白（即GFP）。
2008年10月8日，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会将2008年度诺贝尔化学奖授予日裔美国科学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁·查尔非(Mratin Chalfie)以及美国华裔科学家钱永健(Rorge Y.Tsien)，他们三人因为在绿色荧光蛋白的发现以及改造方面做出了突出成就。
2 GFP的理化性质从水母体内分离到的GFP基因，长达2.6kD，由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸。
GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。
GFP性质极其稳定，耐高温，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。
其变性需在90℃或pH<4.0或pH>12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。
更重要的是，它们在pH7.0~pH12.2的范围内的吸收、发射光谱也是相同的。
绿色荧光蛋白——结构及应用
绿色荧光蛋白——结构及应用孙艺佩【摘要】绿色荧光蛋白(GFP)有稳定、灵敏度高、无毒害、载体便于构建等优点,因此在各个领域已经有了广泛的应用,在细胞生物学与分子生物学领域中,基因常被用作一个报导基因作为生物探针,拿来映证某些假设的实验方法;在医学领域,常用利用绿色荧光蛋白观测肿瘤发生、生长和转移等过程.本文就绿色荧光蛋白的发现与应用背景、结构、生色机理、相对于其他荧光分子的优点和在各领域的应用进行了综述.【期刊名称】《化工中间体》【年(卷),期】2017(000)008【总页数】2页(P124-125)【关键词】绿色荧光蛋白(GFP);荧光生色机理;生色团;技术应用【作者】孙艺佩【作者单位】山东省实验中学山东 250000【正文语种】中文【中图分类】Q绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）是一类能被蓝紫光激发而发出绿色荧光的蛋白，1962年，下村修等人于维多利亚管状水母中第一次发现并提取出了绿色荧光蛋白。
1994年，马丁·查尔菲首次在实验中成功表达GFP基因，向人们展示了绿色荧光蛋白作为遗传标签的价值。
同年，钱永健与其同事提出GFP生色团发光机理并改造GFP，使其更易作为标记物应用于各类试验。
2008年，诺贝尔化学奖授予钱永健、马丁·查尔菲和下修村，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白。
这一发现成果为生命科学的进步提供了更便捷的渠道。
从维多利亚多管水母中分离出来的野生型GFP由238个氨基酸残基组成，分子量约27kDa。
它具有β-桶的结构，几乎是个直径2.4nm，长4.2nm的完美圆柱。
11个β-折叠链形成β-筒的外周，筒两端分别被一些分子量较小的短α-螺旋覆盖，组成生色团的三个残基（Ser65-Tyr66-Gly67）与α-螺旋共价相连，位于圆筒中央螺旋中部。
β-圆筒与短α-螺旋形成致密的结构域，使配体不能扩散进入,生色团被严格保护在筒内，因此其性质稳定，不易被淬灭。
绿色荧光蛋白及其在细胞生物学研究中的应用
绿色荧光蛋白及其在细胞生物学研究中的应用绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）是一种从水母Aequorea victoria中分离出来的荧光蛋白质，可以发射绿色荧光。
由于GFP具有结构简单，对细胞无毒性和较强稳定性等特点，因此被广泛应用于细胞生物学和生命科学研究中。
以下是关于GFP及其在细胞生物学研究中的应用的介绍。
一、荧光蛋白及GFP的来源荧光蛋白质是一种含有环状芳香族氨基酸残基的蛋白质，能够吸收外部能量并将其转化为荧光发射。
GFP最初是在1955年，美国南加州大学的Osamu Shimomura研究水母发光机制时发现的。
GFP由238个氨基酸组成，分子量约27kDa。
GFP基因被克隆后即可在其他生物中表达，使它成为了生物体内最常用的荧光标记物之一。
二、GFP的结构和原理GFP的荧光由3个氨基酸残基Tyr（酪氨酸）、Ser（丝氨酸）和Gly（甘氨酸）构成的环状结构决定。
当氧气与Tyr形成共轭键时，便使荧光激发能量被吸收，并在GFP分子腔内缓慢扩散，直至荧光发射。
三、GFP在细胞生物学中的应用1、荧光定位GFP被广泛用于生命科学中细胞定位的研究。
由于GFP具有细胞膜透性和结构稳定性等特性，可以将其组装到生物体内，使其具有明亮的绿色荧光。
通过转化所需的基因序列来表达GFP，可以使研究人员直接在活细胞中观察到融合GFP蛋白质的定位和空间分布状况。
2、蛋白质交互作用GFP也被用作蛋白质交互作用的研究工具。
在这种情况下，GFP被连接到研究的蛋白质上，而研究人员观察到GFP与其他蛋白质结合的情况，从而确定蛋白质之间是否相互作用。
3、表达和异常行为GFP还可用于研究蛋白质的表达和异常行为。
通过表达GFP基因，可以探究研究对象的分泌情况、活动状态、质量控制和分解情况等。
4、细胞轨迹追踪GFP被广泛应用于细胞追踪研究中。
通过转染GFP基因，可以实时跟踪特定细胞类型的运动和位置，比如细胞分裂、游走和迁移等。
绿色荧光蛋白标记技术及其在基础临床研究中的应用
【 要 】 绿 色荧 光 蛋 白 （ ｒｅ ｌｏ ｅｃ ｎ ｒ ｔｉ ， Ｆ ） 为 一 个 监 测 完 整 细 胞 和 组织 内基 因表 达及 蛋 白定 位 的理 摘 ｇｅ ｎ ｆ ｒｓ ｅ ｔ ｏ ｅ Ｇ Ｐ 作 ｕ ｐ ｎ
想标记 物， 在受 到 紫 外 光 或蓝 光激 发 时可 高 效 发 射 清 晰 可 见 的 绿 光 ， 荧 光 性 质 稳 定 ， 其 它 标 记 物 相 比 ， 有 明 显 优 且 与 具 势 。 因而 广 泛 应 用 于 转 基 因 动 物 的 研究 、 合 标 记 、 因治 疗 、 白在 活 细 胞 内功 能 定 位 及 迁 移 变 化 、 原 菌侵 入 活 细 胞 融 基 蛋 病 的分 子 过 程 等 。Ｇ Ｐ作 为 新 一 代 的 基 因 转 移 报 告 物 和 ／ 定 位 标 记 物 ， 生命 科学 研究 中越 来越 受 到关 注 。 察 检 测 ， 细 胞 几 乎 无 伤 对
大 吸 收 峰 为 ３ ５ ｍ， 一 小 吸 收 峰 为 ４ ０ ｍ， 大 发 射 峰 为 ９ｎ 另 ７ｎ 最 ５ ９ ｍ， ５ ０ ｍ 处 有 一 肩 峰 。 由于 Ｇ Ｐ有 高 能 量 的 Ｂ态 和 ０ｎ 在 ４ｎ Ｆ
【 关键 词 】 绿 色荧 光蛋 白 基 础 与临 床 研 究
１ ９ 年 Ｐ ａｈ ｒ等¨ ９２ ｒｓｅ １ 隆 到 ＧＦ 的 ｃ Ａ， ９ ４ 年 克 Ｐ ＤＮ １９ Ｃ ａｆ 等 首 次 在 大肠 杆 菌 细 胞 中 表 达 了 能 发 射 绿 色 荧 光 的 ｈｌｅ ｉ 绿 色荧 光 蛋 白 ， 创 了 应 用 绿 色 荧 光 蛋 白 标 记 技 术 的 先 河 。 开 Ｇ Ｐ主 要 来 自两 种 海 洋 无 脊 椎 动 物 一 西 南 太 平 洋 水 母 （ ｅ Ｆ Ａ— ｑ ｏｅ ｉ ｏｉ） 佐 治 亚 沿 海 水 域 的 三 色 堇 （ ｅ ｉａ ｒｎｆ— ｕ ｒａ ｃ ｒ 和 ｖｔ ａ Ｒ ｎ ｌ ｅｉ ｌ ｏ ｍｉ Ｌ 。它 是 一 类 存 在 于 腔 肠 动 物 体 内 的 发 光 蛋 白 ， ｓ３ ） 当受 到 紫 外 光 或 蓝 光 激 发 时 ， 发 射 清 晰 可 见 的 绿 色 荧 光 ， 荧 光 性 质 能 且 稳 定 ， 种 属 限制 。其 次 ， Ｐ 的 检测 极 其 方 便 ， 它 与 目的 基 无 ＧＦ 将 因 连 接 后 ， 染 进 细 胞 ， 合荧 光 显 微 镜 、 式 细胞 仪 或 激 光 共 转 结 流
dfhbi 1t类绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）是一种具有绿色荧光的蛋白质，广泛应用于生物学领域的标记和成像技术中。
绿色荧光蛋白的研究和应用已经成为生命科学领域中的热点和前沿课题。
在这篇文章中，我们将深入探讨绿色荧光蛋白的种类、结构、功能和应用。
1. 绿色荧光蛋白的种类绿色荧光蛋白是由Aequorea victoria（水母）发光器官中分离出来的一种蛋白质。
根据不同的来源和结构特点，绿色荧光蛋白可以分为多种类别，包括标准GFP、改良GFP、超变荧光蛋白和环状GFP等。
每种类型的绿色荧光蛋白都具有不同的荧光特性和适用范围。
2. 绿色荧光蛋白的结构绿色荧光蛋白的结构是其功能的基础。
它是一个由238个氨基酸组成的蛋白质，包括一个β桶结构和一个共轭双键序列。
在特定的条件下，它可以通过自发性氧化反应形成荧光色团，并发出绿色的荧光。
绿色荧光蛋白的结构和光学特性为其在生物标记和成像领域的应用奠定了基础。
3. 绿色荧光蛋白的功能作为一种生物标记物，绿色荧光蛋白的主要功能是在转基因生物中标记特定的细胞、器官或组织，以便于研究者对其进行观察和分析。
通过转基因技术，研究人员可以将绿色荧光蛋白基因导入到目标生物体中，从而实现对其活体成像和实时监测。
绿色荧光蛋白在蛋白质定位、蛋白质-蛋白质相互作用和基因表达调控等方面也发挥着重要作用。
4. 绿色荧光蛋白的应用绿色荧光蛋白的广泛应用领域包括但不限于以下几个方面：a. 细胞成像与实时监测：通过转基因技术将绿色荧光蛋白标记到感兴趣的细胞中，可以实现对其活体成像和实时监测，从而揭示生物体内细胞的运动、分化和凋亡等过程。
b. 蛋白质定位与跟踪：通过融合绿色荧光蛋白与感兴趣蛋白质，可以实现对蛋白质在生物体内的定位与跟踪，从而研究其功能和代谢途径。
c. 蛋白质-蛋白质相互作用研究：利用双融合蛋白技术或FRET技术，可以实现对蛋白质-蛋白质相互作用的实时观察和分析，为研究蛋白质分子机制提供了有力工具。
绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白分子标记在环境微生物学研究中的应用摘要：荧光染料在微生物学中的应用受到广泛的关注。
近年来，来源于发光性生物的荧光蛋白进一步丰富了微生物学的研究手段。
其中绿色荧光蛋白(G reen fluorescent protein ，G F P ，来源于水母) 具有独特的应用价值。
G F P 及G F P 突变体在微生物降解污染物、生物膜菌群构架、环境生态学和环境检测生物传感器等研究领域取得了很好的应用效果。
关键词：绿色荧光蛋白，环境微生物，分子标记自然界中的许多生物都具有发光的能力，如细菌、真菌、萤火虫、深海鱼类和腔肠动物等。
它们的发光能力是由一类称为“荧光蛋白”的蛋白质赋予的。
G F P 标记系统是首次发现的不需要其他辅助条件的生物发光标记系统。
G F P 的激发光谱和发射光谱在活体和离体条件下完全相同，而虫荧光酶素的发射光谱在离体和活体条件下并不相同[1]。
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。
其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。
这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用[1]2008年10月8日，日本科学家下村修（伍兹霍尔海洋生物学研究所）、美国科学家马丁·查尔菲（哥伦比亚大学）和钱永健（加利福尼亚大学圣迭戈分校）因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年（2008）的诺贝尔化学奖。
天然的G F P 是一种多肽，由23 8 个氨基酸组成，分子量27 k u 。
能够将蓝光转化成绿色荧光[2-3]。
C orm ack 等用定点突变的技术将包围S er—T yr—G ly 生色团的2 0 个氨基酸进行突变，得到一系列吸收峰红移的突变体。
这些突变体相对于野生型蛋白具有更高的折叠效率，荧光强度增强3 0 ～100 倍，使G F P 的应用前景更加广阔[5]。
绿色荧光蛋白
GFP作为标记蛋白的优点
①荧光稳定 ②检测方便 ③无种属特异性，也无有细胞种类和位置的限制 ④GFP对受体细胞基本无毒害 ⑤易于构建载体，不受假阳性干扰 ⑥不需任何反应底物和辅助因子 ⑦可制成永久标本
绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白的分子生物学 及其应用
绿色荧光蛋白的研究史
1962年Shimomure等首先从维多利亚水母(Aequorea Victoria) 中分离出了GFP (Green-Fluorescent Protein) 。
维多利亚水母 (Aequorea Victoria)
A test tube containing a sample of a cyan (greenish-blue) fluorescent protein from a sea anemone illuminated by ultra-violet light from below.
பைடு நூலகம்
GFP发色团的骨架在左边。蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝色），子链的一部分 直接从中间穿过（绿色），发色团刚好在罐头盒的中间，它被保护起来以免受周围环境 的影响。这种保护对于发射荧光是必需的。一但发色团吸收一个光子，激活的水分子通 常就会夺取它的能量。但是在蛋白质内部改为发射能量稍低的光子来释放能量，使它得 到了保护。发色团（右图）由蛋白质链上的三个氨基酸：甘氨酸，酪氨酸和苏氨酸（或 丝氨酸）自发形成。
绿色荧光蛋白的研究史
1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了 GFP，开创了GFP应用研究的先河。
绿色荧光蛋白及其在细胞生物学中的应用
绿色荧光蛋白及其在细胞生物学中的应用绿色荧光蛋白(GFP)是一种由蛋白质基因编码的荧光标记物，可以在活细胞中可视化蛋白质的位置和移动。
GFP最初是从海葵中发现的，现在已被广泛应用于生物学研究中。
在细胞生物学中，GFP已成为一种重要的工具，用于研究细胞的结构、功能和信号转导。
GFP可以用于标记蛋白质，从而观察它们在细胞中的位置和运动。
通过将GFP基因与目标蛋白质基因融合，可以制造出发出绿色荧光的融合蛋白。
这种荧光标记可以在活细胞中使用显微镜观察。
因为GFP 是自发发光的，所以不需要其他化学试剂或光源，也不会伤害细胞。
此外，GFP的亚细胞定位可以通过不同的融合蛋白实现，比如细胞核、质膜、内质网、线粒体等。
除了用于观察蛋白质的位置和移动，GFP还可以被用于研究细胞的功能和信号转导。
例如，GFP可以用于标记细胞器，如细胞核、线粒体和内质网，从而研究它们的功能和相互作用。
此外，GFP还可以用于标记细胞信号分子，如钙离子和蛋白激酶，从而研究它们在信号传递中的作用。
总之，GFP已成为一个重要的工具，在细胞生物学研究中发挥着重要作用。
通过使用GFP融合蛋白标记，可以可视化细胞内蛋白质的位置和运动，研究细胞的功能和信号转导，以及研究细胞亚结构。
- 1 -。
对绿色荧光蛋白(GFP)的了解及应用
对绿色荧光蛋白的了解及应用学院：生命科学学院姓名：马宗英年级：2011学号：2011012923前言绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是一种具有奇妙特性的“光学蛋白质”。
这种蛋白质从成分和结构上来说，没有丝毫的特殊性，它的组成单元是20种常见的氨基酸，二级结构也是普通的α螺旋和β片层。
但是，这种蛋白质却具有一个非常特别的性质——发出绿色荧光。
【关键词】绿色荧光蛋白生命科学应用一、绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白最早是由下村修等人于1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现的。
其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，吸收蓝光的部分能量，发出绿色荧光。
野生型水母GFP的一级序列已由其cDNA序列推导出来[1]，它至少存在4种同源GFP，但这些突变并不影响GFP的基本功能，只是使突变的GFP具有了新的性质。
生色团是GFP发出荧光的物质基础，也是GFP结构中的一个重要组成部分。
GFP的生色团位于氨基酸序列64~69位的六肽内,65~67位的丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸通过共价键形成的对羟基苯甲基咪唑环酮是一个独特的、相当稳定的环状三肽结构,构成了GFP生色团的核心[2],见图1。
图2为生色团的形成机制。
图1 多管水母中GFP生色团的化学结构和附近序列图2生色团的形成机制目前人们对GFP的荧光发光机制并不十分清楚，大家只是认为，GFP是生物发光过程中的能量受体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机制也有很大差异。
二、GFP在生命科学中的应用1、作为蛋白质标签（protein tagging）利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（protein tagging），即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染到合适的细胞中进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内的活体观察。
GFP在生命科学中的应用
绿色荧光蛋白（GFP）在生命科学中的应用生命科学学院2011级2011012911 姜悦绿色荧光蛋白(GFP)是海洋生物水母体内的一种发光蛋白，最早是从华盛顿维多利亚水母体内克隆得到的。
GFP本身具有发光功能的荧光基团，无需特殊的辅助因子或其他蛋白的参与。
在近几年的生命科学研究中，GFP已经成为跟踪活组织或活细胞内基因表达及蛋白质定位的标记物，这一方法日益成熟，成为基因转录调控、时相表达、蛋白质定位、转基因动物、细胞骨架等研究的有效手段。
GFP在组织中表达产生内在的荧光，从而可以标记一些正常的细胞学过程，再借助一些高分辨率的显微荧光光学仪器就可以监控这些动态过程。
一、GFP基因作为报告基因在生命科学中的应用GFP基因是一种标志基因，带有该基因的物种会发生荧光反应。
GFP基因往往与其他物种的功能基因一起植入实验物种的细胞，转基因得到的新物种如果出现荧光反应，则与GFP基因同时植入的其他物种的基因也应该存在于转基因物种的细胞内。
《海洋科学》2011年第35卷第9期报道的《杜氏盐藻叶绿体ATP合酶α亚单位基因启动子的克隆及初步功能分析》（谷辉辉，冯书营，潘卫东，李杰，薛乐勋）中就利用GFP基因作为一种报告基因。
目前, 虽然已经利用盐藻的核转化系统表达了一些外源基因，但是外源基因在细胞核转化时容易发生基因沉默、表达量低等现象，为此，研究者进行了转化盐藻叶绿体而非转化细胞核的尝试。
研究者采用DraI、EcoRV、PvuII、ScaI、SmaI 和StuI六种内切酶消化杜氏盐藻叶绿体基因组DNA，与相应DNA接头连接, 构建成无载体连接的盐藻叶绿体GenomeWalker DNA文库。
利用长距离PCR技术从该文库中克隆得到ATP合酶α亚单位基因上游序列1347bp。
启动子特征分析显示该序列具有一般启动子的保守序列特征，根据这些特征设计引物，扩增4个5′端系列缺失的启动子片段，并用绿色荧光蛋白基因作为报告基因，构建启动子5′端系列缺失重组质粒，以期鉴定不同启动子片段驱动报告基因转录的活性。
化学生物学综合创新设计实验——大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白
３ 试 剂与 仪 器
３１ 试剂 ． 高保真 Ｔｑ酶 ，Ｎ Ｐ ， Ｔ 卡那霉 素， ａ ｄ Ｔ ｓＩ Ｇ， Ｐ 氯 化钙 ，４Ｄ Ａ连接酶 ， Ｔ Ｎ 限制性内切酶 Ｂｍ 和 Ｈｎ Ｉ ａ ＨＩ ｉｄＩ Ｉ
（ ａ ａ ａ ， 脂糖 ， 乙啶 ，Ｃ 纯化试剂 盒 （ ｍ ｇ ｉ ＴＫ Ｒ ）琼 溴 ＰＲ Ｏ ｅａＢｏ
１８ ６
江
西
农
业
学
报
２ ３卷
显微镜检测表达情况。
ｔ ，Ｎ Ｐ ｔ （ ． ｍ １ ，０ ｕｅ ｘ ｄ Ｔ ｓ Ｌ ２ ０ｍ ｏ） １ Ｂ ｆｒ ， Ｌ ２ｘ Ｘ ｆ２ 普通 Ｔｑ ａ 酶 ０２ （ ． Ｕ ， ． ２５ ）去离子水 １． 。反应条件 同４ １ ３３ ． 中条件。将反应后产物进行琼脂糖凝胶 电泳检测 ， 如果
验步骤。
收稿 日期 ： １ —０ ２ １ ６—２ ０ ５ ‘
笔者在任课教师 以往从事科研 的基础上 一 设计 ，
了该综 合 创 新 实 验 ， 绿 色 荧 光 蛋 白基 因 将 插 入 ｐ Ｔ ８ 表达系统 ， Ｅ ２ａ 进行绿色荧光蛋 白表达 ， 并使用荧光
基金项 目： 国家水体污染控制与治理科技重大专项 （０９ Ｘ ７２ — ０ ） 河南农业大学博士启动项 目（００ １ １ 。 ２０ Ｚ ０ ４３ ０３ ； ３ ３０７ ） 作者简介 ： 赵仲麟（９ Ｏ ）男 ， １ 一 ， 辽宁鞍山人 ， ８ 讲师 ， ， 博士 主要从事化学生物学及分子生物学的科研与教学工作。 通讯作者： 袁超。
江西农 业学报 ２ １ ，３ ８ ：６ ０ １ ２ （ ） １７～１８ ６
ＡｅａＡｇｉｕ ｕａ ｉｎ ｘ ｔ ｒｃ ｈ ｒｅＪａ ｇ ｉ
化 学生 物 学综 合创 新 设计 实验
绿色荧光蛋白及其应用
《生物工程进展》1999,V ol.19,No.2绿色荧光蛋白及其应用周盛梅1 孟凡国2 黄大年3 黄纯农1(1.杭州大学生命科学院 杭州 310012)(2.山东农业大学生化系)(3.中国水稻所基因工程系)摘要 许多海洋无脊椎动物体内都含有绿色荧光蛋白,这种蛋白质结构很特殊,在受到激发时可以发射绿色或蓝色荧光。
虽然对它的研究从本世纪六十年代才开始,但是它独特的性质逐渐引起了生物学界的广泛关注。
本文将就绿色荧光蛋白的结构、性质及其应用前景作一综述。
关键词 绿色荧光蛋白 荧光 生色基 GFP基因 荧光现象在许多海洋无脊椎动物中普遍存在着。
许多刺胞亚门的动物和几乎所有栉水母类的动物在受到刺激时都可以发出荧光:刺胞亚门的动物多发射绿色荧光,而栉水母类发射蓝色荧光。
1962年,Shimo mura和Johnson等人首先从水螅水母类动物Aequor ea V ictoria中分离、纯化出一种荧光物质,并将其定性为蛋白质,称为绿色荧光蛋白(Gr een Fluorescent Pro-teins,GFPs)。
此后,人们对绿色荧光蛋白的结构、性质进行了不断的深入研究,随着这些研究的进展,人们发现,从不同动物体内提取的荧光蛋白的结构、性质不尽相同,不同动物品种的荧光发生机理也有很大的差别。
目前研究得较为深入的是来自多管水母科(A equorea)和海紫罗兰科(R enilla)的荧光蛋白,即Aequorea GFP 和Renilla GFP(以下简称为A-GFP和R-GFP),其中对前者的研究相对更深入一些,应用也更为广泛。
1 绿色荧光蛋白及其性质A-GFP和R-GFP都是酸性、球状的蛋白质,它们的氨基酸组成也很相似。
前者是分子量为27,000-30,000道尔顿的单体,而后者则是分子量为54,000道尔顿的同型二聚体。
正常状态下这两种蛋白质的吸收光谱不同,A-GFP的最高吸收峰为395nm,肩峰为473nm,R-GFP 的最高吸收峰则为498nm,肩峰为470nm,但是它们的发射光谱却是相同的( max=508-509nm)。
gfp+细胞核的亲和免疫沉淀
gfp+细胞核的亲和免疫沉淀摘要：一、GFP简介及其在生物学研究中的应用二、细胞核免疫沉淀技术概述三、GFP与细胞核亲和免疫沉淀的原理四、实验操作步骤及注意事项五、应用案例及意义正文：一、GFP简介及其在生物学研究中的应用GFP（绿色荧光蛋白）是一种在荧光显微镜下能发出绿色荧光的蛋白质，最早从jellyfish 中分离得到。
GFP 在生物学研究中具有广泛的应用，它作为一种标记物，可以方便地用于检测目标蛋白在细胞内的定位、表达量和动态变化。
通过GFP标签，研究人员可以实时观察目标蛋白在细胞内的运输、降解等过程，为研究细胞生物学提供了有力工具。
二、细胞核免疫沉淀技术概述细胞核免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）技术是一种用于研究蛋白质与DNA相互作用的实验方法。
该技术通过特异性抗体与目标蛋白质结合，再利用抗原-抗体反应的原理，将目标蛋白质与其结合的DNA 一同沉淀下来，从而实现对特定基因表达调控因子与其目标DNA片段的亲和沉淀。
三、GFP与细胞核亲和免疫沉淀的原理GFP作为一种荧光标记物，可以与目标蛋白融合表达。
在实验过程中，通过将GFP标签引入到目标蛋白中，使其在细胞内发出绿色荧光。
利用ChIP技术，可以将带有GFP标签的目标蛋白与其结合的DNA一同沉淀下来，随后进行进一步的实验分析。
这样，研究人员可以研究目标蛋白在特定基因调控中的作用及其动态变化。
四、实验操作步骤及注意事项1.细胞培养：将细胞培养在含有适当抗生素的培养基中，待细胞密度达到适宜水平后，进行后续实验。
2.转染：将含有GFP标签的目标蛋白质粒转染到细胞中，使其在细胞内表达出带有GFP标签的目标蛋白。
3.染色：利用甲醛固定细胞，将细胞核染色以便于后续的免疫沉淀实验。
4.免疫沉淀：将细胞悬液与特异性抗体混合，孵育后加入沉淀剂，通过离心将目标蛋白与其结合的DNA一同沉淀下来。
5.洗脱：将沉淀物进行洗涤，去除未结合的抗体和其他杂质，以减少后续实验的干扰。
绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学中的应用
专题介绍 ＲＥＶＩＥＷ
绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学中的应用
吴瑞 张树珍 ＊
中国热带农业科学院热带生物技术研究所， 海口， ５７１１０１ ＊ 通讯作者， ｚｈａｎｇｓｚ＠ｐｕｂｌｉｃ．ｈｋ．ｈｉ．ｃｎ
１．２ ＧＦＰ 的改进
由于野生型 ＧＦＰ 折叠受温度影响，发光较弱； 其次， -./ 基因在植物细胞内的表达频率并不高， 甚 至 在 某 些 植 物 细 胞 中 并 不 表 达 （Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ａｍｏｓ， １９９５）。因此人们运用定点突变、 ＤＮＡ－ｓｈｕｆ－ ｆｌｉｎｇ 等技术对野生型 ＧＦＰ 进行改造。
１ ＧＦＰ 的基础研究
绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学中的应用 ２４１ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
１．１ ＧＦＰ 性质
从多管水母 !"#$%&’( )’*+%&’, 中分离出的 ＧＦＰ 是由 ２３８ 个氨基酸残基组成的单体蛋白，呈酸性， 是一种球状蛋白， 分子量为 ２７￣３０ｋＤ。其中央是一 个 ! 罐（"－ｃａｎ）结构（Ｏｒｍｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。ＧＦＰ 生色团 ＧＦＰ 的 生 色 团 位 于 是其发出荧光的物质基础， ６４￣６９ 的六肽内。 生色团在翻译后 ２￣４ｈ 内自动催化 形成， 而 ＧＦＰ 在合成后需经过一定的折叠过程形成 正确的构象后才有功能。 ＧＦＰ 生色团的形成需要 Ｏ２， 并使 ６６ 位氨基酸残基的 #、 $ 键间脱氢。因此， 厌氧条件下 ＧＦＰ 不能形成荧光。 ＧＦＰ 在 ４５０￣４９０ｎｍ 蓝光下最稳定，在 ３４０￣３９０ｎｍ 或 ３９５￣４４０ｎｍ 的范 围内，会发生光漂白现象；强还原剂如 ５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＳＯ４ 或 ２ｍｍｏｌ／Ｌ ＦｅＳＯ４ 能使 ＧＦＰ 转变为非荧光 形式，但重新暴露在空气中时， ＧＦＰ 荧光便会立即 恢复；弱还原剂和中度氧化剂对 ＧＦＰ 荧光影响不 大； 在离体状态下， ＧＦＰ 对高温 （７０! ）、 碱、 除垢剂、 盐、 有机溶剂和大多数普通酶有较强抗性（Ｗａｒｄ ａｎｄ 在 Ｂｏｋｍａｎ， １９８２）。ＧＦＰ 荧光在 ｐＨ７．０￣１２．０ 时稳定， ｐＨ５．５￣７．０ 时 开 始 受 到 影 响 （Ｂｏｋｍａｎ ａｎｄ Ｗａｒｄ， 在高温 （＞７０" ）、 极端 ｐＨ 或胍基氯化物条件 １９８１）； 下， ＧＦＰ 会发生变性， 而使荧光消失， 一旦外界条件 恢复正常，荧光将部分恢复 （Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｂｏｋｍａｎ， 目前对 ＧＦＰ 的荧光发光机制还不清楚， 人们 １９８２）。 推测其生色团的形成必须经过氧化脱氢步骤， 并且 不同的生物发光机制各不相同， 不同的突变体发光 机制也有很大差异（Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。ＧＦＰ 有 ２ 个 次峰在 ４７５ｎｍ； 有一个发射 吸收峰， 主峰在 ３９５ｎｍ， 峰在 ５０８ｎｍ。ＧＦＰ 的生色团至少由 ２ 种不同的化学 组分组成， 即中性酚和阴离子酚。４７５ｎｍ 峰随 ＧＦＰ 分子生色团的去质子化或阴离子生色团的增加而 增加， ３９５ｎｍ 则随着 ＧＦＰ 分子生色团的质子化或中 性生色团的增加而增加。 野生型 ＧＦＰ 在室温或低于 ＧＦＰ 几乎都能正确而快速地折叠， 室温下表达时， 但当高于室温时，折叠速度剧烈下降 （ 汪恒英等 ， ２００４， 生物技术， １４（３）： ７０－７２）。
GFP的简介和应用
GFP的简介和应用【摘要】源于多管水母属等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白（GFP），是一种极具应用潜力的标记物，有着极其广泛的应用前景。
本文就GFP的理化性质、荧光特性、改进以及它在科学研究中发挥的作用进行了综述。
【关键词】绿色荧光蛋白（GFP）、标记物、荧光特性、进展、改进、应用、干细胞移植【正文】一、GFP的简介1. GFP的理化性质，荧光特性及其改进1.1 GFP的理化性质从水母体内分离到的GFP基因，长达2.6kD，由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸。
GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。
Aequoria GFP分子量约27×103，一级结构为一个由238 个氨基酸残基组成的单链多肽；而Renilla GFP是分子量为54kD的同型二聚体。
两种GFP有不同的激发光谱，Aequoria GFP在395 nm具有最高光吸收峰，肩峰为473 nm；Renilla GFP在498 nm具有强烈的光吸收，肩峰为470 nm。
两种GFP含有相同的生色团，发射光谱基本相同（λmax= 508~ 509 nm）。
GFP性质极其稳定，易耐受高温处理，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。
其变性需在90℃或pH<4.0或pH>12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境，或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。
更重要的是，它们在很大的pH范围内的吸收、发射光谱也是相同的。
Renilla GFP的稳定性就更为显著。
它在上述一系列的变性条件下都很稳定，不易变性。
根据Sheen等的研究，GFP在受体内表达时，其稳定性并不亚于CAT 蛋白，因而可以得到持续时间较长的荧光。
1.2 GFP的荧光原理GFP的性质和发射光谱的稳定性是同其生色团结构的稳定性密不可分的。
GFP表达后折叠，在氧存在的条件下，使66位氨基酸残基的α、β键间脱氢。
gfp在生物学中的应用(一)
gfp在生物学中的应用(一)GFP在生物学中的应用什么是GFPGFP（Green Fluorescent Protein），即绿色荧光蛋白，是源自于荧光珊瑚的一种蛋白质，可以自发地发出绿色荧光。
GFP在生物学研究领域中有着广泛的应用。
GFP的特性•GFP可以自发的发出绿色荧光，无需外界光源的刺激。
•GFP的分子量较小，只有27kDa，不会对宿主生物产生影响。
•GFP可以作为标记蛋白质，将其与其他蛋白质进行融合，使其绿色荧光便可被用于追踪蛋白质的位置及运动路线。
•GFP结构稳定且易于复制。
GFP在生物学研究中的应用细胞检测GFP可以与其他蛋白质进行融合，它的荧光特性可以用于追踪蛋白质的位置及移动。
通过对GFP标记的蛋白质进行跟踪，研究人员可以了解细胞结构及动态变化。
例如可以用于观察染色体的行为、了解某个蛋白质在细胞内的表达以及分布情况等。
基因转移与表达通过将GFP的编码序列融合到其他基因中，形成GFP-fusion基因，可以将GFP结合到靶基因的表达区域。
这种方法可以追踪转基因生物DNA 在体内的表达、开展基因治疗等应用。
药物筛选将GFP插入到某些植物或动物的细胞中，打荧光后可以连续目测该生物体细胞的活性或死亡情况，来评价药物对其的保护性及毒性影响。
这种方法可以用于筛选小分子化合物、药物等。
营养安全性鉴定将GFP插入到某些微生物中，例如大肠杆菌，可用于监控它们在食品生产及生态学方面的存在情况，进一步指定微生物对人体及环境的安全与污染等。
结论GFP由于其优越的特性，成为生物学研究的强劲有力的武器之一，这种蛋白质不仅较为稳定，而且与其他蛋白质的融合方便，具有灵活性和广泛应用领域。
存在的问题虽然GFP具有广泛的应用前景，但在实际应用中仍存在一些问题，例如：•GFP不能在某些特殊条件下自发发出荧光，例如在正常的酸碱环境以外，其荧光强度会下降甚至消失。
•GFP的荧光峰值与标记的蛋白的特性相似，会造成光谱重叠困扰。
绿色荧光蛋白在生物医学研究中的应用
绿色荧光蛋白在生物医学研究中的应用绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）是一种广泛应用于生物医学研究中的蛋白质标记物。
它最初来源于海葵（Aequorea victoria）中的一个蛋白质，因其绿色荧光而被人们发现，并被广泛用于标记生物分子的研究中。
本文将介绍绿色荧光蛋白在生物医学研究中的应用及其优缺点。
I. GFP技术在药物筛选中的应用药物筛选是一种重要的生物医学研究手段，它通过筛选大量的化合物，找到具有治疗作用的药物。
GFP技术则可以帮助科学家在筛选过程中更加方便地观察细胞中的药物靶点。
以前的药物筛选往往需要使用化学荧光染料，这些染料的发光可能会被药物所抑制，影响筛选结果。
而使用GFP标记靶点，则可以直接观察靶点在细胞内的表达情况，无需使用化学荧光染料。
此外，GFP标记靶点也使得科学家可以在单个细胞的水平上观察相应的实验结果，增加了研究的可靠性和精度。
因此，GFP技术在药物筛选中有着广泛的应用前景。
II. GFP技术在细胞成像中的应用GFP技术在细胞成像中也有着广泛的应用。
在一些研究中，科学家将GFP标记在细胞组织或器官中的某一种蛋白质上，以追踪其在细胞中的运动情况。
由于GFP具有高度的特异性和稳定性，因此可以准确的观察标记蛋白质的表达情况。
这种技术使得科学家可以观察特定细胞或组织的病理生理进程，并为疾病的提早诊断和治疗提供了可能性。
III. GFP技术在基因治疗中的应用基因治疗是一种新兴的治疗疾病的手段，其目的是通过简单而直接的方式将治疗的基因导入到细胞中，来治疗一些疾病。
GFP技术可以帮助科学家更好的观察基因治疗的效果。
在基因治疗过程中，科学家可以使用GFP将目标基因标记出来，然后通过观察GFP标记的表达情况，来判断基因治疗的效果。
这种方法非常简单、直接，而且可以提供非常可靠的数据支持，为基因治疗的推广打下了坚实的基础。
IV. GFP技术的优缺点GFP技术具有许多优点，其中最重要的一点是其易于使用和轻松操作。
绿色荧光蛋白分子标记在环境微生物学研究中...
第一作者:叶海仁,男,1979年出生,在读硕士研究生,主要从事基因工程及应用微生物研究。
3国家自然科学基金项目(20276070)及国家863计划项目(2002AA 649310)绿色荧光蛋白分子标记在环境微生物学研究中的应用3叶海仁 钟卫鸿 陈建孟(浙江工业大学生物与环境学院, 杭州310032)摘要 绿色荧光蛋白(green fluo rescent p ro tein ,GFP )分子标记是现有遗传标记中最简单方便的一种方法,GFP 及GFP 突变体在微生物降解污染物、生物膜菌群构架、环境生态学和环境检测生物传感器等研究领域取得了很好的应用效果。
关键词 绿色荧光蛋白 环境微生物 分子标记Application of green f luorescen t prote i n marker i n the research on env ironm en t al m icrobiology Y e H airen ,Z hong W eihong ,Chen J ianm eng .Colleg e of B iolog ical &E nv ironm ental E ng ineering ,Z hej iang U niversity of T echnology ,H ang z hou 310032Abstract :T he characteristics of GFP and its app licati ons as a mo lecular m arker in environm ental m icrobi o logy research w ere discussed .T he GFP m ay be the mo st si m p le and convenient mo lecular m arker in environm ental m i 2croo rganis m s .It w as found that the GFP m arkers p lay a key effect on the research of m icrobe structure in bi ofil m ,m icrobes bi odegrati on ,p lant 2m icrobe interacti ons ,bacterial 2p ro tozoan interacti ons and bi o senso rs .Keywords :Green fluo rescent p ro tein Environm ental m icroo rganis m s M o lecular m arker 基因工程微生物(genetically engineered m icroo rgan 2is m s ,GE M S )越来越多地被用于农业害虫控制和污染环境的生物修复,其进入开放的环境后对人类健康和环境的影响引起了人们的广泛关注。
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绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用田 涛,王 琦3(中国农业大学农学与生物技术学院,北京 100094)摘 要 荧光染料在微生物学中的应用受到广泛的关注。
近年来,来源于发光性生物的荧光蛋白进一步丰富了微生物学的研究手段。
其中绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP,来源于水母)具有独特的应用价值。
在活体研究中,GFP相对于其它报告蛋白(如β2半乳糖苷酶)在原位、实时的微生物生理生化研究中有很多优越性。
对GFP作为分子标记物在微生物学中的应用进行回顾,对GFP在微生物与宿主相互作用、生物膜(biofilm)、生物降解、细菌与原生动物相互作用、基因转导、基因表达、蛋白质定位以及生物传感器等领域的应用进行讨论,并扼要介绍了一些应用于荧光观察和定量分析的方法。
关键词 绿色荧光蛋白;标记;微生物;表达中图分类号 Q93-31 文献标识码 A 文章编号 1005-7021(2005)01-0068-06The Application of G reen Fluorescent Protein(GFP)asMolecular Marker in MicrobiologyTIAN Tao,WAN G Qi(Coll.of A gron.&Biotech.Chi na A gric.U niv.Beiji ng100094)Abstract The application of fluorescent dyes in microbiology has been paid close extensive attention.Recently,flu2 orescent proteins originated from bioluminescent organisms have enriched research means in microbiology,among them green fluorescent protein(GFP)stemmed from jellyfish possesses unique application values.Study in vivo, GFP has many superiorities over other reported proteins,sayβ2galactosidase,in microbio2physiological and biochemi2 cal studies in situ and real time.In this paper,the applications of GFP as molecular marker in microbiology were re2 viewed,the applications of it on interactions between microbes and hosts,bio2membrane,biodegradation,interac2 tions between bacteria and protozoa,gene transfer,gene expression,protein location,as well as biosensors were also discussed.S ome observation and quantitative analysis methods applied on fluorescence were also briefly introduced. K eyw ords green fluorescent protein(GFP);marker;microbe;expression 自然界中的许多生物都具有发光的能力,如细菌、真菌、萤火虫、深海鱼类和腔肠动物等。
它们的发光能力是由一类称为“荧光蛋白”的蛋白质赋予的。
这些蛋白质由不同基因编码,不具有同源性,其发光机制在进化上也不相同。
GFP标记系统是首次发现的不需要其他辅助条件的生物发光标记系统。
GFP的激发光谱和发射光谱在活体和离体条件下完全相同,而虫荧光酶素的发射光谱在离体和活体条件下并不相同[1]。
天然的GFP是一种多肽,由238个氨基酸组成,分子量27ku。
能够将蓝光转化成绿色荧光[2,3]。
Inonye和Tsuji证实GFP的活性发色团是一个三肽,其成熟过程需要有氧的参与[4,5]。
野生型的GFP无论是在发光生物中,还是在提纯后的溶液中都具有395nm的最大吸收峰和510nm的最大发射峰[6]。
Cormack等用定点突变的技术将包围Ser2Tyr2G ly生色团的20个氨基酸进行突变,得到一系列吸收峰红移的突变体。
收稿日期:2004-03-20 作者简介:田涛 男,硕士。
现从事植病生防与植物微生态学方向研究工作。
3 通讯作者86微生物学杂志 2005年1月第25卷第1期 JOURNAL OF MICROBIOLO GY Jan.2004Vol.25No.1这些突变体相对于野生型蛋白具有更高的折叠效率,荧光强度增强30～100倍,使GFP的应用前景更加广阔[5]。
作为报告基因,gf p基因具有很多优良的特性:它表达出来的GFP折叠效率高,可以在多种生物体内表达;无论是直接表达还是以融合蛋白形式表达,GFP对宿主细胞或组织均无毒害作用;GFP的激发不消耗生物能量,不需要任何底物或辅因子;稳定性好,能耐受穿透、毒素、光漂白等不利因素,在甲醛固定、65℃处理0.5h以及p H值6～12范围内均十分稳定;用荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞仪、荧光分光光度计等仪器,可以对标记的目标微生物进行实时、原位的监测,或定量计算其荧光强度[7]。
上述特性使得GFP作为分子标记物在基因工程微生物(G enetically engineered microorgan2 isms,GEMs)中得到广泛的应用。
目前GEMs在有害生物综合治理、有毒化学物质及重金属污染修复、污水处理等领域发挥着重要的作用。
GEMs处理相对于化学或物理的处理更加经济有效,并且可以降低给环境带来的潜在的危害。
虽然如此,基于安全性考虑,GEMs进入自然环境后的命运引起研究人员的关注。
过去由于缺乏有效的手段区分GEMs和土著微生物,有关GEMs在自然环境中的存活与扩展并不清楚。
近来分子生物学的发展为我们带来全新的技术手段去区分、检测、计量接种到含有大量土著菌的自然环境中的GEMs。
例如基因探针、分子杂交、PCR、报告基因等。
这些分子生物学的方法有助于我们监测有特定表型或序列的GEMs。
其中gf p基因以其特有的性质引起研究人员的更多兴趣。
现已建立起来一套成熟的gf p基因标记系统[8]。
本文回顾了GFP作为分子标记物应用于微生物学研究的进展。
1 GFP在微生物与宿主相互作用研究中的应用早期的研究者用荧光抗体检测宿主中的微生物,后来发明了用荧光染料直接包被微生物以研究其在活体细胞中的作用方式。
由于这些方法严重影响微生物的生理功能,而且在细菌裂殖的过程中荧光信号会不断的减弱,所以很难实现对微生物的长期跟踪[9]。
GFP标记系统和荧光显微镜的出现,使研究者能够对微生物和宿主相互作用进行长期的监测。
Raphael等在1995年构建了两套gf p基因表达系统,分别在鼠伤寒杆菌和海分枝杆菌中高效表达GFP,并结合使用落射式荧光显微镜对病菌侵染其哺乳动物宿主吞噬细胞的过程进行实时追踪。
实验表明,GFP的表达没有对细菌的存活造成不利影响,也没有降低其侵染能力及在吞噬细胞中的存活能力[10]。
G age等借助穿梭载体p TB93F在苜蓿根瘤菌里组成型表达gf p基因,并观察到根瘤菌侵染根系及根瘤形成的全过程[11]。
Epel等将gf p基因与烟草花叶病毒运动蛋白基因在烟草花叶病毒中融合表达,观察到病毒运动蛋白与宿主细胞肌动蛋白的结合,通过植物的亚细胞结构-胞间连丝完成细胞间的侵染循环。
表明是病毒与植物组分间的相互作用促进了病毒在植物体内的局部传播[12]。
1997年,Tombolin等用自杀质粒将吸收峰红移的突变gf p基因整合到荧光假单胞菌的染色体上。
由于使用了强启动子(PpsbA)和荧光增强型gf p基因,其表达宿主的荧光更强也更稳定,他们利用激光共聚焦扫描显微镜在忘忧树根的表皮观察到单个的标记细胞[13]。
Qazi等(2000)把从枯草芽孢杆菌中克隆到的核糖体识别位点、木聚糖启动子(PxylA)与gf p基因连接,在革兰氏阳性菌中(李斯特单核增生菌、金黄葡萄杆菌、枯草芽孢杆菌等)成功表达出GFP,并对李斯特单核增生菌侵染哺乳细胞的全过程进行跟踪[14]。
近年来,我国科研人员也成功地用gf p基因标记对固氮菌、根瘤菌、枯草芽孢杆菌进行研究[15,16]。
本实验室成功地用gf p 基因标记蜡质芽孢杆菌A247等,并对其与宿主间的相互作用进行研究。
由于天然的GFP不易被细胞内的蛋白酶系统降解,所以在使用GFP标记系统研究基因的瞬时表达方面受到限制。
K eiler等证明:蛋白质C 末端特定的寡肽延伸使一些稳定的蛋白质容易被细胞内原有的蛋白酶系统降解[17]。
Qazi等把不同的寡肽连接到GFP的C末端,构建出一系列半衰期的短GFP突变体。
其半衰期从60min到300min不等。
为研究微生物与宿主间的蛋白质961期 田涛等:绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用 相互作用提供了有力的工具[14]。
2 GFP在研究开放环境中微生物的应用 近年来,研究人员已经构建出多种GFP表达系统,用于在开放环境中微生物的研究。
1996年,Burlge等用Tn5转座子将gf p基因插入恶臭假单胞菌的染色体,以研究细菌的迁移规律。
实验证明,可以成功地利用荧光分光光度计精确地检测细菌的迁移率。
Eberl等(1997)用gf p基因标记恶臭假单胞菌以研究其在活性污泥中的存活。
在接种后,很快就观察到在活性污泥絮状物间自由游动的接种菌。
2min后观察到原生动物捕食标记的细菌。
但是3d后,虽然在絮凝物中有大量的微生物,但是在絮凝物之外却几乎观察不到标记的细菌。
这表明絮凝物起到保护细菌不被原生动物捕食的作用[18]。
Olofsson等结合使用落射荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜,研究gf p基因标记的大肠杆菌和粘质沙雷氏菌在活性污泥中的定殖。
研究发现,菌体表面的疏水性物质是决定其在絮凝物上粘附能力的关键因子;三维的图像显示,2种菌在絮凝物上的附着模式完全不同;细菌可以通过孔洞穿过絮凝物。
他们的研究揭示了细菌在活性污泥中的附着机制,有助于提高污水处理的效率[19]。
1999年Unge 等使用gf p2l ux双标记系统对标记菌的代谢活性和荧光强度同时进行原位检测,展示了双标记系统在环境样本原位检测中的应用前景[20]。