绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用

绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用

田　涛,王　琦3

(中国农业大学农学与生物技术学院,北京　100094)

摘　要　荧光染料在微生物学中的应用受到广泛的关注。近年来,来源于发光性生物的荧光蛋白进一步丰富了微生物学的研究手段。其中绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP,来源于水母)具有独特的应用价值。在活体研究中,GFP相对于其它报告蛋白(如β2半乳糖苷酶)在原位、实时的微生物生理生化研究中有很多优越性。对GFP作为分子标记物在微生物学中的应用进行回顾,对GFP在微生物与宿主相互作用、生物膜(biofilm)、生物降解、细菌与原生动物相互作用、基因转导、基因表达、蛋白质定位以及生物传感器等领域的应用进行讨论,并扼要介绍了一些应用于荧光观察和定量分析的方法。

关键词　绿色荧光蛋白;标记;微生物;表达

中图分类号　Q93-31 文献标识码　A 文章编号　1005-7021(2005)01-0068-06

The Application of G reen Fluorescent Protein(GFP)as

Molecular Marker in Microbiology

TIAN Tao,WAN G Qi

(Coll.of A gron.&Biotech.Chi na A gric.U niv.Beiji ng100094)

Abstract　The application of fluorescent dyes in microbiology has been paid close extensive attention.Recently,flu2 orescent proteins originated from bioluminescent organisms have enriched research means in microbiology,among them green fluorescent protein(GFP)stemmed from jellyfish possesses unique application values.Study in vivo, GFP has many superiorities over other reported proteins,sayβ2galactosidase,in microbio2physiological and biochemi2 cal studies in situ and real time.In this paper,the applications of GFP as molecular marker in microbiology were re2 viewed,the applications of it on interactions between microbes and hosts,bio2membrane,biodegradation,interac2 tions between bacteria and protozoa,gene transfer,gene expression,protein location,as well as biosensors were also discussed.S ome observation and quantitative analysis methods applied on fluorescence were also briefly introduced. K eyw ords　green fluorescent protein(GFP);marker;microbe;expression

自然界中的许多生物都具有发光的能力,如细菌、真菌、萤火虫、深海鱼类和腔肠动物等。它们的发光能力是由一类称为“荧光蛋白”的蛋白质赋予的。这些蛋白质由不同基因编码,不具有同源性,其发光机制在进化上也不相同。GFP标记系统是首次发现的不需要其他辅助条件的生物发光标记系统。GFP的激发光谱和发射光谱在活体和离体条件下完全相同,而虫荧光酶素的发射光谱在离体和活体条件下并不相同[1]。

天然的GFP是一种多肽,由238个氨基酸组成,分子量27ku。能够将蓝光转化成绿色荧光[2,3]。Inonye和Tsuji证实GFP的活性发色团是一个三肽,其成熟过程需要有氧的参与[4,5]。野生型的GFP无论是在发光生物中,还是在提纯后的溶液中都具有395nm的最大吸收峰和510nm的最大发射峰[6]。Cormack等用定点突变的技术将包围Ser2Tyr2G ly生色团的20个氨基酸进行突变,得到一系列吸收峰红移的突变体。

　收稿日期:2004-03-20

　作者简介:田涛　男,硕士。现从事植病生防与植物微生态学方向研究工作。

3　通讯作者

86微生物学杂志　2005年1月第25卷第1期　JOURNAL OF MICROBIOLO GY Jan.2004Vol.25No.1

这些突变体相对于野生型蛋白具有更高的折叠效率,荧光强度增强30～100倍,使GFP的应用前景更加广阔[5]。

作为报告基因,gf p基因具有很多优良的特性:它表达出来的GFP折叠效率高,可以在多种生物体内表达;无论是直接表达还是以融合蛋白形式表达,GFP对宿主细胞或组织均无毒害作用;GFP的激发不消耗生物能量,不需要任何底物或辅因子;稳定性好,能耐受穿透、毒素、光漂白等不利因素,在甲醛固定、65℃处理0.5h以及p H值6～12范围内均十分稳定;用荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞仪、荧光分光光度计等仪器,可以对标记的目标微生物进行实时、原位的监测,或定量计算其荧光强度[7]。

上述特性使得GFP作为分子标记物在基因工程微生物(G enetically engineered microorgan2 isms,GEMs)中得到广泛的应用。目前GEMs在有害生物综合治理、有毒化学物质及重金属污染修复、污水处理等领域发挥着重要的作用。GEMs处理相对于化学或物理的处理更加经济有效,并且可以降低给环境带来的潜在的危害。虽然如此,基于安全性考虑,GEMs进入自然环境后的命运引起研究人员的关注。过去由于缺乏有效的手段区分GEMs和土著微生物,有关GEMs在自然环境中的存活与扩展并不清楚。近来分子生物学的发展为我们带来全新的技术手段去区分、检测、计量接种到含有大量土著菌的自然环境中的GEMs。例如基因探针、分子杂交、PCR、报告基因等。这些分子生物学的方法有助于我们监测有特定表型或序列的GEMs。其中gf p基因以其特有的性质引起研究人员的更多兴趣。现已建立起来一套成熟的gf p基因标记系统[8]。本文回顾了GFP作为分子标记物应用于微生物学研究的进展。

1　GFP在微生物与宿主相互作用研究中的应用

早期的研究者用荧光抗体检测宿主中的微生物,后来发明了用荧光染料直接包被微生物以研究其在活体细胞中的作用方式。由于这些方法严重影响微生物的生理功能,而且在细菌裂殖的过程中荧光信号会不断的减弱,所以很难实现对微生物的长期跟踪[9]。GFP标记系统和荧光显微镜的出现,使研究者能够对微生物和宿主相互作用进行长期的监测。

Raphael等在1995年构建了两套gf p基因表达系统,分别在鼠伤寒杆菌和海分枝杆菌中高效表达GFP,并结合使用落射式荧光显微镜对病菌侵染其哺乳动物宿主吞噬细胞的过程进行实时追踪。实验表明,GFP的表达没有对细菌的存活造成不利影响,也没有降低其侵染能力及在吞噬细胞中的存活能力[10]。G age等借助穿梭载体p TB93F在苜蓿根瘤菌里组成型表达gf p基因,并观察到根瘤菌侵染根系及根瘤形成的全过程[11]。Epel等将gf p基因与烟草花叶病毒运动蛋白基因在烟草花叶病毒中融合表达,观察到病毒运动蛋白与宿主细胞肌动蛋白的结合,通过植物的亚细胞结构-胞间连丝完成细胞间的侵染循环。表明是病毒与植物组分间的相互作用促进了病毒在植物体内的局部传播[12]。1997年,Tombolin等用自杀质粒将吸收峰红移的突变gf p基因整合到荧光假单胞菌的染色体上。由于使用了强启动子(PpsbA)和荧光增强型gf p基因,其表达宿主的荧光更强也更稳定,他们利用激光共聚焦扫描显微镜在忘忧树根的表皮观察到单个的标记细胞[13]。Qazi等(2000)把从枯草芽孢杆菌中克隆到的核糖体识别位点、木聚糖启动子(PxylA)与gf p基因连接,在革兰氏阳性菌中(李斯特单核增生菌、金黄葡萄杆菌、枯草芽孢杆菌等)成功表达出GFP,并对李斯特单核增生菌侵染哺乳细胞的全过程进行跟踪[14]。近年来,我国科研人员也成功地用gf p基因标记对固氮菌、根瘤菌、枯草芽孢杆菌进行研究[15,16]。本实验室成功地用gf p 基因标记蜡质芽孢杆菌A247等,并对其与宿主间的相互作用进行研究。

由于天然的GFP不易被细胞内的蛋白酶系统降解,所以在使用GFP标记系统研究基因的瞬时表达方面受到限制。K eiler等证明:蛋白质C 末端特定的寡肽延伸使一些稳定的蛋白质容易被细胞内原有的蛋白酶系统降解[17]。Qazi等把不同的寡肽连接到GFP的C末端,构建出一系列半衰期的短GFP突变体。其半衰期从60min到300min不等。为研究微生物与宿主间的蛋白质

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1期 田涛等:绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用