植物组织培养技术手册

植物组织培养技术手册

金陵中学河西分校瞿大枞

第一部分

植物组织培养理论简介

实验原理

植物组织培养是指植物的任何器官、组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化并形成完整植株的过程。其理论依据是植物细胞具有全能性。

组织培养的特点

取材少，培养材料经济；

人为控制培养条件，不受自然条件影响；

生长周期短，繁殖率高；

管理方便，利于自动化控制。

应用领域

1、快速繁殖

2、种苗脱毒

3、远缘杂交8、植物性药物和生物制品的生产

7、基因工程

6、种质保存4、突变育种

5、单倍体育种胚状体发生途径

外植体

脱分化

愈伤组织

胚状体

再生植株

再分化

器官发生途径

外植体

愈伤组织

芽根再生植株

脱分化

再分化

高生长素(1,2-D)高(生长素/细胞分裂素)

低(生长素/细胞分裂素)胡萝卜离体根

培养条件

光照强度：1000lx ——1500lx

黑暗条件：利于细胞、愈伤组织的诱导增殖

光照条件：利于器官的分化

光周期：常用的周期是16h 的光照8h 的黑暗

温度：25℃湿度pH

器材和药品

高压灭菌锅

超净工作台

光照培养架

1. 大型仪器和器材

1.超净工作台：用于培养物的无菌操作（由鼓风机、滤板、操作台、紫外灯和照明灯组成）。

2. 高压灭菌锅：用于进行培养基和器械用具的灭菌。小规模实验室可选用小型手提式高压灭菌锅。

3.光照培养架：用于植物材料的培养，其内有温度感受器，控制箱内温度到所调指标。生化培养箱还配有光照装置。

4.电子分析天平：电子分析天平，用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品精确度为0.0001g

1.镊子类常应用医疗上的镊子。根据操作需要有各种类型

2.剪刀类可采用医疗五官科用的中型剪刀。主要用于切断茎段、叶片等。也可以用弯形剪刀，由于其头部弯曲，可以深入到瓶口中进行剪切。

3.解剖刀切割较小材料和分离茎尖分生组织时，可用解剖刀。刀片要经常调换，使之保持锋利状态，否则切割时会造成挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培养效果。

4.解剖针解剖针可深入到培养瓶中，转移细胞或愈伤组织。也可用于分离微茎尖的幼叶，可以自制。

2. 小型仪器和器材

组培瓶---要求透光度好，能耐高压高温, 以试管、三角瓶、培养皿等使用较多。三角锥瓶---适用于各种培养（如固体培养、液体培养、大规模培养或一般培养）。培养皿---适于作单细胞的固体平板培养、胚和花药培养和无菌发芽。

试管---适合于用少量培养基及试验各种不同配方时选用。

3. 玻璃器皿

次氯酸钠消毒液, 75%的酒精,0.2％的升汞溶液.

1 N 盐酸,1 N NaOH,0.8%的琼脂,3%的蔗糖.0.1 mg/ml 的2,4-D 溶液：取25 mg 的2,4-D ，加入少量95%的酒精和1 N 的NaOH 溶解，再加蒸馏水定容至250 ml 。

0.1 mg/ml 的6-BA 溶液：取25 mg 的6-BA ，用少量1 N 的盐酸溶解，再加蒸馏水定容至250 ml 。

4. 常用试剂的配置

标准的组织培养实验室包括

洗涤室（准备室）配置室灭菌室接种室培养室观察室等

准备室

缓冲间(过渡室)

接种室(外设缓冲间)

培养室

第二部分

植物组织培养实验操作

目的与要求：

熟悉MS 培养基的组成，掌握贮备液的配制方法。实验步骤：

称量分别溶解混合定容

实验一培养基贮备液（母液）的配制

一、MS 培养基的组成1.大量成分→贮备液I

mg/L

NH 4NO 31650KNO 3

1900MgSO 47H 2O 370KH 2PO 4

170CaCl 22H 2O （单溶后加入）

440

配制20倍浓度贮备液500mL.

2.微量成分→贮备液II

mg/L

KI 0.83H 3BO 3

6.2MnSO 44H 2O 22.3ZnSO 47H 2O 8.6Na 2MoO 42H 2O 0.25CuSO 45H 2O 0.025CoCl 26H 2O

0.025

配制100倍浓度贮备液100mL.

3.铁盐→贮备液III mg/L

FeSO 47H 2O 27.8Na 2EDTA 2H 2O 37.3（长时间放置可能长菌，需要灭菌）

4.有机成分→贮备液IV

mg/L

肌醇100烟酸

0.5盐酸硫胺素(VB 1)0.1盐酸吡哆醇0.5甘氨酸

2

配制100倍浓度贮备液100mL.

配制100倍浓度贮备液100mL.

二、常用生长调节剂

6-BA ：1mg/mL(溶于少量1N 盐酸后以蒸馏水定容）。

NAA:1mg/mL （先用少量95%乙醇溶解后以蒸馏水定容）。

2,4-D 溶液：0.1 mg/ml （取25 mg 的2,4-D ，加入少量95%的酒精和1 N 的NaOH 溶解，再加蒸馏水定容至250 ml ）。

贮备液I(g)贮备液III(mg)MgSO 47H 2O 3.70

500mL FeSO 47H 2O

278 100mL

NH 4NO 316.50Na 2 EDTA 2H 2O

373

CaCl 22H 2O 4.40生长调节剂

KNO 319.006-BA 50mg 50mL KH 2PO 4

1.70NAA

50mg 50mL 贮备液II(mg)贮备液IV(mg)

KI 8.3 100mL 肌醇1000 100mL H 3BO 3

62 烟酸 5 MnSO 44H 2O 223 盐酸硫胺素 1 ZnSO 47H 2O 86 盐酸吡哆醇 5 Na 2MoO 42H 2O

2.5 甘氨酸20

CuSO 45H 2O 0. 25 称量

溶解

混合

定容

CoCl 26H 2O

0. 25

一、实验目的：

学习、掌握植物组织固体培养基的配制和灭菌方法。

二、实验步骤：

称量

混合

调pH 值

灭菌

实验二固体培养基的配制与灭菌