植物组织培养技术手册
01植物组织培养校本教材
植物组织培养目录一.植物组织培养综述1.1概念1.2 研究历史1.3技术原理1.4培养特点二. 实验实施预先准备2.1培养基贮备液配制2.2各种植物激素配制2.3各种培养基配制和灭菌三、植物组织培养过程3.1接种过程3.2试管苗的培养3.2.1丛生芽诱导培养3.2.2继代增殖培养3.2.3生根诱导培养3.2.4 移栽定植植物组织培养一.植物组织培养综述1.1概念植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
狭义组织培养是指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。
1.2 研究历史如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活；1902年，德国植的预言。
近几十年来植物组织培养技术已经发展成为一项新兴无性繁殖技术。
1.3技术原理植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）、组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株。
1.4培养特点1.4.1培养条件可以人为控制组培采用的植物材料完全是在人为提供的培养基和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。
1.4.2生长周期短，繁殖率高组培是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。
另外，植株也比较小，往往20-30天为一个周期。
植物组织培养实用技术
龙牙百合属百合科、百合属、百合种， 药食兼用，是上等的滋补佳品，栽培经 济效益(jīnɡ jì xiào yì)好。百合繁殖方法 主要有分球繁殖、鳞心繁殖、鳞片繁殖 等，但经多代无性繁殖以后，导致病毒 积累、种性退化，严重地制约着百合产 量和质量的提高。利用组织培养与脱毒 技术相结合，能够迅速去除无性繁殖体 内病毒，复壮品种，并可加快百合的快 速繁殖速度。
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一．外植体的选择 (xu1ǎ、nz文é)献资料综述(zōngshù)
茎尖是一种较好的外植体，出愈率最高、繁殖速度 快，但取材有限、灭菌很易产生药害。
幼叶、幼叶柄、花梗作为外植体，可诱导产 生愈伤组织，但是诱导成苗难。
花托是非洲菊组织培养中比较理想的外植体，其 好处在于花托较大，易于剥取，并有花被包裏， 污染程度轻，易于消毒，污染率低
龙牙(lónɡ yá)百合的许多器官、组织都可作为外植体， 如鳞片、花梗、叶片、茎尖、腋芽、花瓣、花托、花丝、 花药、胚、子房、根尖等，其中采用鳞片作外植体的较 多。
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以鳞片为例，在选取外植体时，要选择具备龙牙百合 品种特征、无病虫害危害的种球。外部鳞片易污染要 将其剥离，中部鳞片肉质厚，生长势强，易诱导小鳞 茎，是最佳的外植体。内部鳞片幼嫩(yòu nèn)，诱 导率低，不易产生小鳞茎，故不宜采用。就季节性而 言，以秋、冬季的鳞片分化成小鳞茎的能力最强，
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注意(zhù yì)
1、在初级培养和继代培养时，降低MS中的氮素营养 会导致芽的发生率降低，铵态氮和硝态氮之比为1：2 时对非洲(fēi zhōu)菊芽的增殖最好。
2、随BA浓度的提高，增殖速度相应提高。但在较高的 BA浓度条件下芽苗会变细、变弱，且随BA浓度进一步 提高，芽苗变得更加丛生、细弱。
《植物组织培养技术》组培基本操作技术
《植物组织培养技术》组培基本操作技术模块介绍掌握组培基本操作技术是做好组织培养工作的前提和关键。
本模块介绍了培养基制备、无菌操作等组培基本操作技术，主要内容包括培养基的种类、成分、特点和配制技术，以及外植体处理、接种方法、无菌操作规程等理论知识和技术方法。
两个项目共设计6个工作任务，以工作任务为载体，开展项目实践活动，旨在培养学生无菌意识、团队精神和操作技能，使学生初步具备培养基制备工、接种工的基本素质与工作能力。
模块结构设计见表1。
表1 模块结构设计项目1 培养基制备一、学习目标（一）终极目标能够根据培养对象和培养目的准确配制培养基。
（二）促成目标1．准确识记组培药品及其作用；2．熟记植物激素的种类、生理作用、理化性质与配制要求；3．清楚常用基本培养基的种类与特点；4．掌握母液和培养基的配制目的与操作流程，能够熟练配制母液和培养基；5. 熟练使用相关设备与用具；6. 具备无菌意识，具有团队精神、创新意识和和责任心。
二、学习内容1．培养基的种类、特点与成分；2．激素种类、理化性质、生理作用与配制要求；3.母液配制目的与方法；4．培养基配制的目的与方法；5. 培养基灭菌方法。
三、知识点1．培养基的种类、特点与成分；2．母液配制目的与方法；3．培养基配制的目的与方法；4. 培养基灭菌方法。
四、技能点1.母液配制；2.培养基配制；3.培养基灭菌。
五、教学重点1.培养基的种类、成分与特点；2.激素种类、理化性质、生理作用；3.母液和培养基配制的目的与方法；4.培养基灭菌方法。
六、教学难点1.MS大量元素母液、激素母液和铁盐母液的配制；2.培养基配制操作的规范度和熟练度；3.影响培养基湿热灭菌效果的因素；4.培养基中加入活性炭、抗生素的作用；5.配制螯合铁的目的。
七、教学设计八、拓展学习1.MS干粉培养基；2.螯合剂与鳌合物；3.培养基保存；4.培养基不凝固的原因；5.无土栽培营养液与组培培养基的区别。
九、学习建议1.重视培养基制备。
植物组织培养技术
植物组织培养技术植物组织培养技术是一种在无菌条件下通过培养组织和细胞的方式来繁殖和研究植物的方法。
它可以被广泛应用于植物育种、生产和研究等领域。
本文将介绍植物组织培养技术的基本原理、培养基组成和培养过程，并简要介绍其在实际应用中的一些重要方面。
一、基本原理植物组织培养技术基于植物细胞的分裂和分化能力。
在无菌条件下，取自植物的幼嫩组织、芽尖、胚乳或种子中的胚或胚乳端胚发育相对较低的部分，通过体外培养的方法，将其置于适当的培养基中，利用培养基中的植物生长激素和营养物质，可以诱导组织再分化和器官发生，从而实现对植物的繁殖和研究。
二、培养基组成植物组织培养过程中的培养基主要由无机盐、有机物、糖类和植物生长调节剂等组成。
无机盐提供了植物细胞所需的矿质元素，有机物则作为植物细胞的能量来源和原料。
糖类则提供能量和调节物质，植物生长调节剂在培养基中的加入可以调节细胞分裂、分化和器官发生等过程。
三、培养过程植物组织培养过程一般分为前处理、组织分离、无菌处理、培养和转地培养等几个步骤。
1. 前处理前处理包括新鲜植株的选择、幼嫩组织或胚的提取、洗涤和消毒等步骤。
新鲜植物材料能提供较高的活力和分裂能力，幼嫩组织或胚则更易于培养。
2. 组织分离在无菌条件下，通过手工或酶解的方法将所需的幼嫩组织或胚提取出来。
组织分离需要注意操作的轻柔和对组织的保护，以确保分离出的细胞和组织能够在后续的培养中保持较高的生活力。
3. 无菌处理在培养过程中，保持无菌状态是一项关键工作。
这包括对器皿、培养基和工具等进行高温高压处理或酒精灯烧烤，同时采取合适的工作台、手套箱、无菌技巧等。
4. 培养和转地培养将提取的幼嫩组织或胚块置于含有适当生长激素和营养物质的培养基中，暴露于合适的光照和温度条件下。
在培养过程中，可以通过调整培养基的成分和组织的处理方式来促进细胞分裂和分化，实现器官发生和植株生长。
如果需要将培养物转移到土壤中，还需要进行转地培养的处理，以适应土壤环境。
植物组织培养实训指导书
植物组织培养实训指导书《植物组织培养技术》是生物技术及应用专业的工学结合核心课程之一。
本课程采取“项目引领，任务驱动”的教学模式，使学生掌握植物组织培养技术的职业知识和职业技能，能够在实际工作中具备实验方案设计能力、培养基制备能力、无菌操作能力、组培苗驯化移栽能力及组培苗工厂化生产能力。
实训一：实训室的灭菌与玻璃器皿的清洗一、目的要求1.通过实训，使学生了解各种洗涤液的特性；2.掌握酸液的配制方法和组织培养中常用器血的洗涤技术；3.通过实训，培养学生良好的卫生习惯，建立组织培养的无菌意识；4.会配制新杰尔灭溶液。
二、材料用具1.灭菌用具：2%新洁尔灭、高镒酸钾、甲醛、70%酒精、洗涤剂、各种培养血、工作服、口罩、手套、试管刷。
2.洗涤用具：肥皂液、洗衣粉、重铬酸钾粉末、1%HCL、70%酒精、瓶刷等。
三、方法步骤（一）培养室的灭菌1、地面、墙面和工作台的灭菌2、无菌室和培养室的灭菌（二）玻璃器皿的洗涤（酸洗）玻璃器血的洗涤一般要经过浸泡、刷洗、浸酸和清洗四个步骤。
重铬酸钾洗涤（三种）液配制：重铬酸钾508，加工蒸馏水，加热溶化，冷却后再缓缓加入工业浓硫酸90ml。
1、新玻璃器血的洗涤用1%HCL的溶液浸泡一昼夜，再用清水反复洗涤，最后用蒸馏水冲淋一遍，干燥后备用。
2、用过的玻璃器血先将器血中得残留物质除去，用清水冲洗，再用洗衣粉洗涤，最后用清水冲洗3—4遍，把字迹擦洗干净，干燥后使用。
3、污染的培养瓶的处理首先经高压蒸汽灭菌，再按（2）的步骤洗涤。
4、用过的吸管、滴管、容量瓶先放在重铬酸钾溶液浸泡2h以上，取出后经流水冲洗30min左右，干燥后使用。
四、实训报告①.植物组织培养室的灭菌方法步骤。
②.写出洗涤液的配置步骤。
③.记录各种培养瓶的洗涤方法。
实训二：组织培养工厂的设计一、目的要求通过实训，使同学们对现代组培苗生产模式有一个更为深刻的认识，能熟练的根据生产规模设计合理的厂房及工艺流程。
二、材料用具组培苗生产小工厂、绘图纸、绘图笔三、方法步骤（-）组培工厂的参观1.参观组培实验中心2.组培工厂的组成：准备室、灭菌室、缓冲室、无菌室、培养室、驯化室3.各室内仪器设备的种类及摆放（二）设计一 200m2组培工厂，要求给出大概的布局图。
《植物组织培养》实践教学指导书教程
《植物组织培养》实践教学指导书目录实验实训部分实验一植物组织培养实验室及常用仪器设备的构造及使用实验二无菌操作技术（选做）实验三接种训练实验四组培苗的移栽驯化实验五试管苗的转接与扩繁（选做）实验六生根培养（选做）实验七胡萝卜离体根的培养（选做）实验八茎尖的组织培养（选做）实验九茎段的组织培养实验十百合鳞茎的组织培养（选做）实验十一叶片的组织培养（选做）实验十二花药培养实验十三西葫芦子房的培养（选做）实验十四苹果胚（embryo）培养（选做）实验十五黄瓜下胚轴愈伤组织的诱导（选做）实验十微茎尖的剥离训练专业实训部分实训一培养基的制作实训二器官培养技能实训三果树、蔬菜、经济类植物组织培养一、果树类组织培养（一）苹果的组织培养（二）草莓微茎尖培养（三）枣的组织培养（四）树莓的组织培养二、蔬菜类组织培养（一）芦笋的组织培养（二）无籽西瓜的组织培养（三）大蒜的组织培养（四）马铃薯组织培养三、经济类组织培养（一）香石竹的组织培养（二）菊花茎段的组织培养（三）菊花微茎尖的组织培养（四）唐菖莆的组织培养（五）串红的组织培养（六）蝴蝶兰的组织培养附1：观看组织培养实验室和组培工厂化生产的录像或课件附2：组培技能考核标准实验实训部分实验一植物组织培养实验室及常用仪器的构造及使用一、目的要求（一）一般掌握组织培养常用仪器设备的结构与维护；（二）熟练掌握常用仪器设备的正确使用方法。
二、常用仪器设备分析天平；灭菌器；蒸馏水器等。
三、方法步骤（－）岛津进口电子分析天平的构造及使用1．构造：岛津进口电子分析天平主要由：天平机体、称重舱、天平盘、键板（包括4个键）、液晶显示屏等构成。
2．使用：（1）调平天平放稳后，转动脚螺旋，使水平气泡在水平指示的红环内；（2）自检在空载下，天平内部进行自检，显示屏上相继显示CHE3→0，CAL4→0，CAL，END，CAL，OFF；（3）全显示按“ON／OFF”键，液晶屏进入全显示态；（4）这时再按“ON／OFF’键，液晶屏进入预热状态，有绿色指示灯显示。
植物组织培养技术手册
植物组织培养技术手册金陵中学河西分校瞿大枞第一部分植物组织培养理论简介实验原理植物组织培养是指植物的任何器官、组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化并形成完整植株的过程。
其理论依据是植物细胞具有全能性。
组织培养的特点取材少，培养材料经济；人为控制培养条件，不受自然条件影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制。
应用领域1、快速繁殖2、种苗脱毒3、远缘杂交8、植物性药物和生物制品的生产7、基因工程6、种质保存4、突变育种5、单倍体育种胚状体发生途径外植体脱分化愈伤组织胚状体再生植株再分化器官发生途径外植体愈伤组织芽根再生植株脱分化再分化高生长素(1,2-D)高(生长素/细胞分裂素)低(生长素/细胞分裂素)胡萝卜离体根培养条件光照强度：1000lx ——1500lx黑暗条件：利于细胞、愈伤组织的诱导增殖光照条件：利于器官的分化光周期：常用的周期是16h 的光照8h 的黑暗温度：25℃湿度pH器材和药品高压灭菌锅超净工作台光照培养架1. 大型仪器和器材1.超净工作台：用于培养物的无菌操作（由鼓风机、滤板、操作台、紫外灯和照明灯组成）。
2. 高压灭菌锅：用于进行培养基和器械用具的灭菌。
小规模实验室可选用小型手提式高压灭菌锅。
3.光照培养架：用于植物材料的培养，其内有温度感受器，控制箱内温度到所调指标。
生化培养箱还配有光照装置。
4.电子分析天平：电子分析天平，用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品精确度为0.0001g1.镊子类常应用医疗上的镊子。
根据操作需要有各种类型2.剪刀类可采用医疗五官科用的中型剪刀。
主要用于切断茎段、叶片等。
也可以用弯形剪刀，由于其头部弯曲，可以深入到瓶口中进行剪切。
3.解剖刀切割较小材料和分离茎尖分生组织时，可用解剖刀。
刀片要经常调换，使之保持锋利状态，否则切割时会造成挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培养效果。
植物组织培养技术手册
植物组织培养技术手册引言:植物组织培养技术是一种用于植物繁殖、育种、生产以及研究的重要方法。
它通过植物的离体培养，可以实现无菌繁殖、株系保存、基因转化等多种目的。
本手册旨在介绍植物组织培养技术的基本原理、操作流程以及常见的培养方法，帮助读者更好地了解和应用植物组织培养技术。
一、植物组织培养的基本原理:植物组织培养是基于细胞分裂和分化的特性，通过提供适当的培养基和环境条件，实现植物组织或细胞的无菌培养和繁殖。
培养基中的植物激素可调节细胞分裂、分化和发育过程，从而实现植物的离体生长。
二、植物组织培养的操作流程:植物组织培养主要包括种子表面消毒、组织材料切割、组织培养基制备、无菌操作、培养和生长条件控制等步骤。
在进行培养前，必须保证实验室工作台、仪器及试剂无菌，并掌握基本的无菌技术。
三、植物组织培养的常见方法:1. 胚培养: 利用离体胚培养方法，通过改变培养基成分和激素配比，可实现胚的萌发、生根和生长等生理过程，从而获得大量繁殖后代。
2. 茎段培养: 将植物茎段无菌培养在含有适宜激素的培养基上，可诱导茎段发生分化、长出新芽或胚状体，进而形成新的植株。
3. 叶片培养: 利用植物叶片的组织分化和再生能力，通过无菌培养可实现新植株的繁殖和长出新叶片。
4. 胚性愈伤组织培养: 使用植物体内存在的愈伤组织分化能力，通过外部条件的调控，诱导愈伤组织的形成和萌发，进而向下分化和发育为新的植株。
5. 原基愈伤组织培养: 利用原基愈伤组织在培养基上的生长和分化能力，可以实现离体胚胎的形成和长成新植株。
四、植物组织培养的注意事项:1. 无菌操作: 在进行植物组织培养前，必须进行充分的无菌操作，保证实验材料和环境的无菌状态，避免细菌和真菌的污染。
2. 培养基配方: 不同植物组织或细胞具有不同的生理需求，需要根据具体物种和实验目的来调整培养基的成分和激素的配比。
3. 生长环境控制: 控制培养基的pH值、温度、光照强度和湿度等因素，可影响植物组织的生长和分化能力，需根据实际情况进行适当调节。
植物组织培养的基本技术
作用： VB1
促愈伤组织产生，提高活力
VB6
促根生长
Vpp
与代谢和胚发育有关
Vc
防组织褐变
第26页，共77页。
肌醇 (又叫环己六醇） 能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成 。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用， 对细胞壁的形成也有作用。 使用浓度一般为 50～lOOmg／L
第27页，共77页。
蔗糖
50
KH2PO4
400
pH
5.8
(NH4)2SO4
463
烟酸
0.5
KI
0.8
盐酸吡哆醇
0.5
H3BO3
第22页，共77页。
水
碳源
培
无机盐（大量元素、微量元素、铁盐）
养
基
有机物（维生素、肌醇、氨基酸）
成
分
植物激素
培养体支持材料
辅助性物质
第23页，共77页。
碳源
碳源主要为细胞提供合成新化合物的骨架，为细胞的呼 吸代谢提供底物与能源，此外还能维持一定的渗透压。
常用的碳源主要是蔗糖，使用浓度在10-50g/L，此外果 糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也 常用于植物组织培养。 但在胚培养时采用40-150g/L的高浓
Mg2SO4 ·7H2O
Mg2SO4 ·7H2O
FeNa2-EDTA
H3BO3
MnSO4
CuSO4
Na2MoO4 ·2H2O
CaCl ·2H O 2 第25页，共77页。
2
维生素
种类： VB1 （盐酸硫胺素 ）、 VB6（ 盐酸吡哆醇 ）、 Vpp（ 烟酸 ）、Vc(抗坏血酸 ）
浓度：0.1-1.0mg/L
植物组织培养的基本知识及操作技术
氨基酸 (almino acide）
3、有机附加物 （天然复合物）
10%—20%
150-200ml／L
150—200g／L
0.01%-0.05%
浓度：
有机附加物
椰乳
香蕉
马铃薯
酵母提取液
植物生长调节物质(hormone)
01
赤霉素（gibberellic acid）
02
细胞分裂素类 ( cytokinin )
第一节 植物组织培养的一般原理
器官发生
胚胎发生
细胞全能性的实现 实现条件：离体；培养条件 经历的过程：脱分化----再分化---- 再分化的方式
离体的植物组织在组培条件下形成吴根苗、根、芽等器官的过程称为器官发生。
发生类型
发生方式
直接途径
间接途径
先芽后根
先根后芽
根芽同时发生
植物细胞未经过性细胞的融合而通过与合子胚发生类似的途径形成完整植物的过程称为胚胎发生。
缓冲室
培养室
无菌室（一）
无菌室（二）
主要单元功能介绍：
准备室：
洗涤区：排水良好、地板耐湿
灭菌区：地面、墙面防潮、耐高温；绝缘
化学实验区：器皿洗涤、干燥、保存；药品称量、溶解；培养基配制；材料预处理；培养材料观察分析等。主要设备包括：工作台、药品柜、冰箱、烘箱、天平、蒸馏水器等。
无菌操作室：
灭菌锅
普通医用灭菌锅 大的高压灭菌锅 培养基、水、各种器皿的消毒灭菌
烘箱（干燥箱） 80℃ 测定植物组织干重 80-100 ℃ 烘干物品 150-160 ℃ 干热灭菌
冰箱 试剂和母液的贮藏；细胞及其他材料的冷藏保存；植物材料的处理等。
酸度计 培养基及酶制剂的pH值调整
植物组织培养技术最新版本
一、培养基的组成和配制法
1 培养基的成分 （1）无机营养物 （2）有机物质 （3）植物生长刺激物质 （4）其它 附加物 （5）其它对生长有益的未知复合成分：如椰子汁、酵母提 取液、麦芽浸出液等。
培养基中如加入0．5～1％的琼脂即为静止培养的固体 培养基，否则为悬浮培养的液体培养基。不同植物材料常 需要改变配方，如维持生长和诱导细胞分裂和分化的培养 基配方就不同，因此配方的种类很多，目前以Ms （Murashige and Skoog）培养基配方为最常用的一种基 本培养基，它利于一般植物组织和细胞的快速生长。
.ห้องสมุดไป่ตู้
番茄无菌苗愈伤组织培养
1 培养基配制 2 接种和培养
接种－－在无菌条件下，将灭过菌的材料，经适 当切割，转移到培养基上。
.
植物组织培养技术
植物组织培养（plant tissue culture）： 是指在无菌条件下，将离体的植物器官 （如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）， 组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细 胞、胚乳等），细胞（如大孢子、小孢 子、体细胞等）以及原生质体，在人工 控制的环境里培养成完整植株的一门生 物学技术。
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三、选材和灭菌方法
从低等的藻类到苔藓、蕨类、种子植物等高等植物的 各类、各部分都可采用作为组织培养的材料，一般裸子 植物多采用幼苗、芽、韧皮部细胞，被子植物采用胚、 胚乳、子叶、幼苗、茎尖、根、茎、叶、花药、花粉、 子房和胚珠等各个部分。
由于植物在自然条件下，表面常被霉菌和细菌污染， 故材料必须进行灭菌处理。一般用漂白粉溶液（1～10 ％）、次氯酸钠溶液（0．5～10％）、升汞溶液 （0．01％）、乙醇（70％）或过氧化氢（3～10％）等 处理后，再用无菌水反复冲洗至净，然后在无菌室内， 将所取的组织迅速培养在固体培养基上。在适宜的条件 下，受伤组织切口表面不久即能长出一种脱分化的组织 堆块，称为愈伤组织（Callus）。
植物组织培养常规技术
多种多样，如椰乳、马铃薯汁、麦芽浸出物、酵母提取物等 。
种类：
有时必不可少，但使用要慎重。在定性研究中可行，但不能应用于定量化研究。
应用
01
02
（三）植物生长调节物质
植物生长调节物质对于调节细胞分化、形态发生致关重要，是组培中的关键物质。
种类： 生长素类 细胞分裂素类 赤霉素类 乙烯 脱落酸
1．光周期 :一般采用周期性关照的方法。但对不同植物、不同培养物的特性、不同培养阶段所采取的措施不同。 通常在愈伤组织诱导阶段，一般采用三种方法：全暗、周期性光照、散射性光照。多数植物适宜全暗或弱光下培养；而在器官分化阶段，则需要一定时间的光照。 一般每天10~16h的光照即可满足大多数培养的需要； 2.光照强度 ：一般光强在1000~3000lx；一般在培养的后期如生根阶段增强光照强度。 3.光质 ：离体培养条件下，一般采用日光灯进行光照，光谱成分主要是蓝紫光，光谱的波长为419~467nm。
对灭菌剂的要求
01
02
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灭菌效果好：彻底、安全、高效。
对植物材料伤害小；
灭菌剂易消除或易分解
表面灭菌方法
灭菌剂的使用
经常打扫，保持清洁； 接种室消毒： 室内空气消毒：熏蒸灭菌法紫外灯照射灭菌 喷雾降尘 室内地面、墙壁、桌面等：用消毒液（2%的新洁尔 或70%的酒精）擦拭灭菌。 接种台消毒: 紫外灯照射 70%-75%的酒精喷雾或擦拭台面。 使用超净工作台:
应注意的问题 灼烧应均匀充分 ； 灼烧一次不宜使用过久，应多次反复灼烧； 灼烧后冷却再用。
采用灭菌器灭菌
（五）培养室环境灭菌
定期打扫，保持整洁；
空气灭菌：紫外灯照射 ； 定期熏蒸灭菌（改用乙二醇 ） 喷雾灭菌。
植物组织培养基本技术
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2.细胞分裂素（CTK）： （1）作用： ①促进细胞分裂； ②诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长； ③抑制顶端优势，延缓离体组织衰老； ④对根的生长一般起抑制作用 （2）常用的细胞分裂素：6-苄基腺嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、玉米素（ZT）
等。 （3）使用浓度：一般0.1~10.0mg/L
（4）有些生长调节物质不溶于水，2,4-D 、NAA 、 IAA 、GA3等在配制时可先用少量95%的乙醇溶 解。KT、6-BA等可先溶解于少量1mol/L的盐酸 中。叶酸则可先用少量稀氨水溶解。
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3、配制好的母液贴上标签 标签：注明母液的名称、配制倍数、配制日期、配制人员及配1L培养基时
应移取的量。 注意：母液要低温保存，储存时间不易过长，有沉淀或霉菌，则不可再用。
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（三）有机营养物质： 培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基（basic medium)。 为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成 分主要有以下几类：
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1、碳水化合物——碳源： 可作为碳源的有蔗糖，葡萄糖和果糖最常用的碳源是蔗糖，蔗糖使用浓度
在2%—5%，常用3%（30g/L），即配制一升培养基称取30g蔗糖，有时可用 2.5%。
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（三）计算： 1.欲配制1L MS＋6-BA 0.5mg/L+NAA1.0mg/L＋3%蔗糖+0.6%琼脂培养基，已知
MS母液已经配制完成，其浓度分别是：大量元素10倍，微量元素200倍，铁盐 100倍，有机物500倍， 1.0mg/ml 6-BA，0.1mg/ml NAA。 （1）计算各种母液、蔗糖和琼脂的用量 （2）叙述培养基的配制过程
植物组织培养手册
MS 培养基母液的配制 母液是指含有各种必需成分的液体混合物，须按以下药品顺序依次添加，可以一次配制，多次使用。
配制好的母液置于冰箱中备用。
母液I 、Ⅱ、Ⅳ的配制方法是：精确称取各成分，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后将它们依次混合，最后定容到1 L 。
母液Ⅲ的配制方法是：将称好的4FeSO ·O H 27和EDTA Na -2·O H 22分别放到适量蒸馏水中，不断搅拌使它们溶解，然后把4FeSO ·O H 27溶成的溶液缓缓加入到溶EDTA Na -2液中，边加边搅拌，最后定容到1 L ，保存在棕色玻璃瓶中。
各母液配制完后，分别贮存在玻璃瓶中，贴上标签，保存于冰箱冷藏室中。
MS 的母液成分如下：大量元素(母液Ⅰ)NH 4NO 333. 000 g/L KNO 338 .00 g/L CaCl 2·2H 2O 8 .80 g/L MgSO 4·7H 2O7 .400 g/L KH 2PO 4 3 .400 g/L微量元素(母液Ⅱ)KI0.166g/L H 3BO 31.240 g/L MnSO 4·4H 2O4.460g/L ZnSO 4·7H 2O1.720 g/L Na 2MoO 4·2H 2O0.050 g/L CuSO 4·5H 2O0.005 g/L CoCl2·6H2O 0.005g/L铁盐(母液Ⅲ)FeSO 4·7H 2O 5.560g/LNa 2-EDTA·2H 2O 7.460g/L有机成分(母液Ⅳ)Inositol 20.000g/L Nicotinic acid 0.100g/LPyridoxine·HCL 0.200g/LThiamine·HCL 0.200g/LGlycine 0.400g/LMS培养基的制备制备1LMS培养基，需取母液Ⅰ50 mL，母液Ⅱ5 mL，母液Ⅲ5 mL和母液Ⅳ5 mL，有时根据需要，还要加入一定浓度的激素，后混合均匀定容到1L，加热煮沸后再加入浓度为30g/L的蔗糖和一定的琼脂（根据培养物定）,用0.1摩尔每升盐酸或氢氧化钠调节pH 值到6.0左右，再定容至1L，以下数据单位均为g/L 1L所需量500mL所需量母液ⅠNH4NO3 33 .000 16.500KNO3 38.000 17.000MgSO4·7H2O 7 .400 3.700KH2PO4 3 .400 1.700CaCl2·2H2O 8 .800 4.400注意：CaCl2·2H2O 单独配成溶液母液ⅡKI 0.166 0.083H3BO3 1 .240 0.620MnSO4·4H 2O 4 .460 2.230ZnSO4·7H2O 1 .720 0.860Na2MoO4·2H2O 0.050 0.025① CuSO4·5H2O 0.005 0.0025②CoCl2·6H2O 0.00 5 0.0025注意：①②应先配成100mL、0.5g/L的溶液，再稀释。
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植物组织培养技术手册金陵中学河西分校瞿大枞第一部分植物组织培养理论简介实验原理植物组织培养是指植物的任何器官、组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化并形成完整植株的过程。
其理论依据是植物细胞具有全能性。
组织培养的特点取材少，培养材料经济；人为控制培养条件，不受自然条件影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制。
应用领域1、快速繁殖2、种苗脱毒3、远缘杂交8、植物性药物和生物制品的生产7、基因工程6、种质保存4、突变育种5、单倍体育种胚状体发生途径外植体脱分化愈伤组织胚状体再生植株再分化器官发生途径外植体愈伤组织芽根再生植株脱分化再分化高生长素(1,2-D)高(生长素/细胞分裂素)低(生长素/细胞分裂素)胡萝卜离体根培养条件光照强度：1000lx ——1500lx黑暗条件：利于细胞、愈伤组织的诱导增殖光照条件：利于器官的分化光周期：常用的周期是16h 的光照8h 的黑暗温度：25℃湿度pH器材和药品高压灭菌锅超净工作台光照培养架1. 大型仪器和器材1.超净工作台：用于培养物的无菌操作（由鼓风机、滤板、操作台、紫外灯和照明灯组成）。
2. 高压灭菌锅：用于进行培养基和器械用具的灭菌。
小规模实验室可选用小型手提式高压灭菌锅。
3.光照培养架：用于植物材料的培养，其内有温度感受器，控制箱内温度到所调指标。
生化培养箱还配有光照装置。
4.电子分析天平：电子分析天平，用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品精确度为0.0001g1.镊子类常应用医疗上的镊子。
根据操作需要有各种类型2.剪刀类可采用医疗五官科用的中型剪刀。
主要用于切断茎段、叶片等。
也可以用弯形剪刀，由于其头部弯曲，可以深入到瓶口中进行剪切。
3.解剖刀切割较小材料和分离茎尖分生组织时，可用解剖刀。
刀片要经常调换，使之保持锋利状态，否则切割时会造成挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培养效果。
4.解剖针解剖针可深入到培养瓶中，转移细胞或愈伤组织。
也可用于分离微茎尖的幼叶，可以自制。
2. 小型仪器和器材组培瓶---要求透光度好，能耐高压高温, 以试管、三角瓶、培养皿等使用较多。
三角锥瓶---适用于各种培养（如固体培养、液体培养、大规模培养或一般培养）。
培养皿---适于作单细胞的固体平板培养、胚和花药培养和无菌发芽。
试管---适合于用少量培养基及试验各种不同配方时选用。
3. 玻璃器皿次氯酸钠消毒液, 75%的酒精,0.2％的升汞溶液.1 N 盐酸,1 N NaOH,0.8%的琼脂,3%的蔗糖.0.1 mg/ml 的2,4-D 溶液：取25 mg 的2,4-D ，加入少量95%的酒精和1 N 的NaOH 溶解，再加蒸馏水定容至250 ml 。
0.1 mg/ml 的6-BA 溶液：取25 mg 的6-BA ，用少量1 N 的盐酸溶解，再加蒸馏水定容至250 ml 。
4. 常用试剂的配置标准的组织培养实验室包括洗涤室（准备室）配置室灭菌室接种室培养室观察室等准备室缓冲间(过渡室)接种室(外设缓冲间)培养室第二部分植物组织培养实验操作目的与要求：熟悉MS 培养基的组成，掌握贮备液的配制方法。
实验步骤：称量分别溶解混合定容实验一培养基贮备液（母液）的配制一、MS 培养基的组成1.大量成分→贮备液Img/LNH 4NO 31650KNO 31900MgSO 47H 2O 370KH 2PO 4170CaCl 22H 2O （单溶后加入）440配制20倍浓度贮备液500mL.2.微量成分→贮备液IImg/LKI 0.83H 3BO 36.2MnSO 44H 2O 22.3ZnSO 47H 2O 8.6Na 2MoO 42H 2O 0.25CuSO 45H 2O 0.025CoCl 26H 2O0.025配制100倍浓度贮备液100mL.3.铁盐→贮备液III mg/LFeSO 47H 2O 27.8Na 2EDTA 2H 2O 37.3（长时间放置可能长菌，需要灭菌）4.有机成分→贮备液IVmg/L肌醇100烟酸0.5盐酸硫胺素(VB 1)0.1盐酸吡哆醇0.5甘氨酸2配制100倍浓度贮备液100mL.配制100倍浓度贮备液100mL.二、常用生长调节剂6-BA ：1mg/mL(溶于少量1N 盐酸后以蒸馏水定容）。
NAA:1mg/mL （先用少量95%乙醇溶解后以蒸馏水定容）。
2,4-D 溶液：0.1 mg/ml （取25 mg 的2,4-D ，加入少量95%的酒精和1 N 的NaOH 溶解，再加蒸馏水定容至250 ml ）。
贮备液I(g)贮备液III(mg)MgSO 47H 2O 3.70500mL FeSO 47H 2O278 100mLNH 4NO 316.50Na 2 EDTA 2H 2O373CaCl 22H 2O 4.40生长调节剂KNO 319.006-BA 50mg 50mL KH 2PO 41.70NAA50mg 50mL 贮备液II(mg)贮备液IV(mg)KI 8.3 100mL 肌醇1000 100mL H 3BO 362 烟酸 5 MnSO 44H 2O 223 盐酸硫胺素 1 ZnSO 47H 2O 86 盐酸吡哆醇 5 Na 2MoO 42H 2O2.5 甘氨酸20CuSO 45H 2O 0. 25 称量溶解混合定容CoCl 26H 2O0. 25一、实验目的：学习、掌握植物组织固体培养基的配制和灭菌方法。
二、实验步骤：称量混合调pH 值灭菌实验二固体培养基的配制与灭菌称量：按每瓶培养基终体积50mL计，称取适量的琼脂（常用量8g/L）和蔗糖（常用量30g/L），置于大烧杯中，加蒸馏水至需配培养基终体积的3/4左右，（加热）使之溶解。
混合：分别加入一定量的贮备液I、II、III 、IV 和生长调节物质及其它特殊补加物，再加蒸馏水直至需配培养基的终体积。
调pH值：充分混合后，在60℃水浴条件下用0.1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的HCl调节培养基的pH值至5.8。
灭菌：封严培养容器口后，120 ℃灭菌20 min后，将培养基取出，置于水平台子上，在室温下冷却，备用。
实验三外植体材料的预处理、消毒及接种一、实验目的：熟悉外植体材料的预处理，掌握其消毒和接种方法。
二、方法步骤：（一）对采来的植物材料进行适当的预处理。
除去不需要的部分，将所需部分切割至适当大小，置自来水龙头下流水冲洗几分钟至几小时，主要视植物材料清洁程度而定。
这在污染严重时特别有用。
（二）用洗衣粉水（1~2角匙洗衣粉/100 ml水）等浸洗上述植物材料约5 min，再用自来水冲净洗衣粉水。
这是进一步减少污染的处理。
同时配制消毒液：50%次氯酸钠溶液。
（三）将接种用具、无菌水等从80℃烘箱中或直接从高压灭菌器中取出，置于超净工作台上。
打开超净工作台中的紫外灯，在进行紫外线灭菌处理至少30 min后关掉紫外灯。
（四）操作人员洗手擦干，换上洁净工作服，戴上帽子以免头发散落以及带来污染。
坐到超净台前，并将装有经湿热灭菌培养基的培养瓶、配好的消毒液、洗净沥干的植物材料置于超净工作台上，用70%酒精棉球擦手与器具外壁，即可对经上述预处理的植物材料进行表面灭菌处理，自此以后各步均须在超净工作台上操作。
（五）具体首先将经上述预处理、沥干水的植物材料放入广口瓶或烧杯，向其中倒入新鲜配制、浓度一定并且加有一定量（通常为灭菌剂消毒液的0.5%，或每100 mL 消毒液滴加10~15滴）Tween-80（土温-80）等表面活性剂的消毒液适量（液面高度超出植物材料至少0.5 cm），开始计算灭菌时间。
也可在使用上述灭菌剂之前，先将植物材料浸于70%乙醇灭菌10~30秒。
（六）在持续灭菌时间内定时用玻璃棒轻轻搅动，以促进植物材料各部分与消毒液充分接触，驱除气泡，使灭菌彻底。
在灭菌时间结束前1 min时，即可开始用玻璃棒等轻轻压住植物材料将消毒液慢慢倒入废物缸，注意勿使植物材料滑出。
接着立即倒入适量无菌水，轻搅植物材料以清洗去除灭菌剂残留。
一般表面灭菌时间的计算是从倒入消毒液开始，到倒入无菌水为止。
无菌水的清洗时间每次约3 min；清洗5次。
（七）倒出、沥去最后一次清洗用水，开始进行植物材料的切割及接种。
逐一取出经上述灭菌处理的植物材料，置于下面垫有经灭菌处理的培养皿（或小白瓷碟）的无菌纱布或滤纸上，左手拿小镊子，右手拿解剖刀，切除各切段或切块上被灭菌剂毒坏的部分。
如有必要，也可再行切分。
在完成切割后，将解剖刀和小镊子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后放回原处，以便待冷却后下一切割再用。
（八）接着，左手拿培养瓶，将培养容器口外壁在靠近酒精灯外焰处转燎数秒，以将其可能带有的微生物等固定于原处；在酒精灯焰附近处，用右手拇指与食指配合将瓶塞打开，并将其夹于左手无名指与最小指之间；再将培养瓶口在酒精灯焰上轻转灼烧灭菌；以右手拇指与食指配合，用大镊子夹紧一外植体准确送入培养容器，并将其轻轻地半插入固体培养基；将大镊子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后放回原处，以便待冷却后下一操作再用；将培养瓶口及瓶塞分别在酒精灯焰上小心地轻转灼燎数秒；盖好瓶塞，旋紧，将其置于超净工作台的适当位置。
（九）在完成了该第一只培养容器的外植体接种操作后，用70%乙醇对超净工作台的台面进行擦拭灭菌，接着再进行第二只培养容器的外植体接种及超净台台面的灭菌，直至全部完成。
实验四枝芽增殖培养基的设计与配制一、实验目的：学习、掌握枝芽增殖培养基的设计、配制方法。
二、方法步骤：（一）称取4g琼脂和15g蔗糖，加蒸馏水至需配培养基终体积500mL的3/4，加热使之溶解，并在80℃热水浴中保温。
（二）分别加入一定量的MS培养基贮备液I、II、III和IV及NAA0.25mg，然后1~5各小组再分别加入各自不同量的BA （0.25；0.5；0.75；1及1.5mg ）。
（三）充分混匀后，用0.1mol/L的NaOH和0.1mol/L的HCl调节培养基的pH至5.8。
定容至500mL。
（四）将培养基分装到所选用的培养容器中，每个容器的装量不超过其最大容量的1/3。
拧紧瓶盖。
（五）将装有培养基的培养容器置高压灭菌器中高压灭菌（120℃，20min）。
灭菌结束后从高压灭菌器中取出，置于平台上冷却，备用。
实验五枝芽增殖培养的外植体处理与接种一、实验目的：学习、掌握枝芽增殖培养外植体的处理、接种方法。
二、方法步骤：（一）将经湿热灭菌装有培养基的培养容器、接种用具等置于超净台上，打开超净台的紫外灯，灭菌处理30min。
（二）操作人员坐到超净台前，用浸有70%酒精的棉球擦超净台面、操作者手等部分。