western blot条带分析
westernblot条带分析
w e s t e r n b l o t条带分析(总6页)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除近几天回答了蛋白版几个有关压片和显影的帖子，发现在这一块还没有比较系统的论述。
特贡献了western显影常见问题及解决方案，是我的经验总结，以供大家参考。
其中绝大部分问题是我所遇到过的，其他个别我没遇到过的是参照pierce公司的说明书。
限于字数，语言比较简洁，如对其中内容有疑问或建议可跟帖。
Western荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—显影和定影效率这一系统。
我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光则压10~30s，看不到则同时压两张，10~30min洗一张，如果无则再补一张,1h后洗。
再无，则压过夜。
共3张片，根据每次结果调整。
其中两张片子的压法如下描述: 先剪一张比膜长2~3厘米的片子（以供贴胶带），然后剪2片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。
这样就固定了第一张胶片，就不会因为放、取第二张胶片而使第一张移动了。
然后放第二张胶片，与第一张片子贴在一起就行，注意片子要干燥，压片前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。
取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一张错开了，不要用手抠，否则下面一张也移动了。
在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带，否则在胶带的地方会影响显影。
荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减，所以下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。
现象-- - - - - - - - - - - - - - - - - - --原因 - - - - - - - - - - - - - - - - --- -- -- --- -- ---解决反影(白色条带,黑色背景) ---- -- -1 HRP过高(背景较高) - - - - - - - - ---- - - - 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1显影后膜上条带处变为黄色---- - -2 HRP过高(敏感性太高)- - - - - - - - - ---- -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2信号弱或无---- - - - - - - - - - ---- 3 HRP过高引起底物迅速耗竭- - - - - -- - - -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3--- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --4 抗体-抗原系统敏感性过低- --- - - - - - - 提高抗体浓度/蛋白上样量*注4- - - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --5 转膜不充分/过转- -- -- - - -- - - - - ---- -优化转膜条件*注5-- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - - -6 HRP或底物活性降低---- - - -- - - -- - ----测试活性或选用敏感底物 *注6高背景---- - - - - - - - - - - - - - - -7 HRP过高(背景较高) - -- - - - - - - - - - -- 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7---- - - - - - - - - - - - - - --- - - ----8 封闭时间不足- - - - - - - - - - - -- - - - -- 延长封闭时间4度过夜最好*注8--- - - - - - - - - - - - - - --- - -- -- -9 抗体与封闭液有交叉----- - - - - - - - - - -更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9--- - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -10 TBST洗脱不足 - - - - - - - ---- - --- - - -增加洗脱时间、次数、用量*注10---- - - - - - - - - - - - - - -- - -- - --11 暴光时间过长 - - - - - ---- - - ------ -- --降低暴光时间*注11- - - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----12 抗原-抗体浓度过高 - - - - - - -- --- - - - 降低抗体浓度或蛋白上样量*注12条带内无显影的白点----------------13 转膜不良（如有气泡在胶-膜之间) -- --精细操作*注13--- - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----14 膜平衡不均/油脂污染- - - - - - - - - - - 按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注14---- - - - - - - - - - -- ------------ -- 15 膜与X光片间有气泡- -- - - - - - - - - - --显影前去除气泡*注15非特异性条带- - - - - --------- -- - -16 抗体交叉反应- - - - - - - - - - - -- -- - --至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注16- - - - - - - - - - - - - - - --- ---- - - -17 SDS非特异性结合蛋白条带 - - --- - ---使用无SDS转膜液*注17散在小圆斑 - - - - - -- - -- -- - - ---18 封闭液有杂质颗粒- -- - --------- ------- 静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层*注18*注1 其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带.形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。
western-blot条带分析报告及解决方法
持续发光一段时间使胶片感光为黑色。
这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。
如果没有背景则就是原因3的现象。
在暗室可以看到文案大全条带周围荧光而条带处为暗。
如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。
也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。
还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。
其分析和解决同上。
*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。
如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。
如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。
但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。
但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。
原因1和3若如是则解决也是一样的。
*注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。
主要出现在HRP极高的情况下，来不及压片就已耗竭底物，往往伴有原因2的现象。
Western blot 条带判定和图片处理标准流程
Western条带判定的标准流程
1、确认目的蛋白的理论分子量
2、通过Uniprot，确认蛋白是否有信号肽，酶切位点，异构体，糖基化修饰位点（一个糖
基化修饰能增加5KDa左右），磷酸化几乎不影响分子量大小。
3、进行肽链氨基酸的分子量判定：
计算出未修饰的全长肽链的分子量（uniport中的有），即理论分子量
计算分子中修饰基团的分子量。
目的蛋白实际分子量=异构体理论分子量-信号肽+糖基化位点数*5KDa，得到一个最大的分子量。
6、最后一步，将实验误差10%考虑进去，即得到一个蛋白的分子量对应的位置范围。
例如实际分子量为50kda，这目的蛋白实际分子量在45-55kda之间，均可接受。
7、最终每个指标的目的蛋白大小参考abcam、cst、novus、abcam4个公司做的实际分子量大小，如无较大出入则可，和别家公司有较大出入，则需进一步验证自己做出来的条带是否正确，通过阴性，阳性对照，KO实验，证明自己做的条带是真实的，即可上传官网。
1.在image lab中将原始图片调对比度，和亮度后，使图片背景干净，条带清晰，有微弱泳道痕迹即可，导出图片
2放入ppt中，剪切成大小合适，字体均用Arial 11号，黑色，短线均用0.6cm，黑色图片边框0.75磅，黑色，图片高度，宽度以目的条带为核心，上下无杂带尽量保留全maker。
3.图片另存为jep格式，A2016对应的货号为K0002354P,图片命名为K002354P-EIF5A-1/1000.。
Fusion灰度分析半定量WesternBlot条带步骤
Fusion灰度分析半定量WesternBlot条带步骤Fusion灰度分析半定量Western Blot条带步骤1、打开图片
备注：此时可以调节图片灰度情况，但是对最终的结果影响不大
看到一下界面：
2、圈出要分析的条带
方法（1）整条一起圈出来，用于连续条带，条带位置差距不大，宽度差距不大的
方法（2）每个条带分别圈出来
3、下一步
4、去背景
5、下一步
出现一下界面：
6、分隔条带：对软件自动识别的条带进行修正，删除不必要的条带（Delete separation）或增加新的条带（Add separation）
7、指定作为100%参考量的参考条带
8、输出结果
9、结果分析
相对灰度计算：目的条带的Volume／内参的Volume
10、三次重复实验，归一
11、统计软件进行统计。
western blot总结前人的经验
汇报人：
实验室安全规定：遵守实验室安全规定确保实验安全
操作规范：按照操作规范进行实验避免操作失误
防护措施：穿戴防护服、手套、口罩等防护用品避免接触有害物质
实验废弃物处理：妥善处理实验废弃物避免环境污染
实验室安全培训：定期进行实验室安全培训提高安全意识和操作技能
实验室安全检查：定期进行实验室安全检查确保实验室安全
汇报人：
,
01
02
03
04
05
06
蛋白质印迹：将样品中的蛋白质分离并转移到膜上
抗体结合：特异性抗体与目标蛋白质结合
显色反应：通过化学反应使结合的抗体显色
结果分析：通过显色区域确定目标蛋白质的存在和含量
孵育：加入一抗进行孵育
孵育二抗：加入二抗进行孵育
显色：加入ECL发光液进行化学发光显色
保存方法：根据试剂性质选择合适的保存方式和条件如冷藏、冷冻等
试剂有效期：注意试剂的有效期及时更换过期试剂
试剂污染：避免试剂受到污染影响实验结果
试Hale Waihona Puke 安全：注意试剂的安全性避免接触皮肤和眼睛必要时佩戴防护设备
试剂废弃：合理处理废弃试剂保护环境
样本选择：选择合适的样本类型和浓度
样本处理：对样本进行适当的处理如稀释、沉淀等
实验结束后应立即清理实验台面避免污染环境
实验废弃物应分类收集并按照相关规定进行处理
实验过程中产生的有害气体、液体等应进行有效处理避免对环境和人体造成危害
实验结束后应关闭电源、水源等确保实验室安全
实验安全：确保实验环境和设备的安全
实验记录：如实记录实验过程和数据确保可追溯性
实验伦理：尊重生命保护实验对象
Western Blot 结果条带全面分析
Western Blot 结果条带全面分析Q1. 啥也没有[原因]：比较多，如果单纯一张没有任何显色的X光片，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。
[解决办法]：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。
[经验]：上面的图片展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。
如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，ECL发光液失效。
另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。
Q2. 高背景[原因]：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够[解决办法]：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。
[经验]：高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景（比较连续的）。
其实只要我们注意操作规范，不偷工减料就很容易避免，洗膜按照规定来5min*5次或者10min*3次，不要改成5min*3次，或者10min*2次。
Q3. 非特异性条带[原因]：一抗非特异性与蛋白结合[解决办法]：更换一抗[经验]：此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断那一条是目的条带。
如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。
当然这种情况下有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。
Q4. 条带中出现边缘规则的白圈[原因]：电转中膜和胶之间存在气泡。
[解决办法]：转膜前去掉膜和胶之间的气泡[经验]：我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不能太多也不能太少，最好的高度是与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，把电泳胶用清水清洗下，将电泳胶平铺到滤纸上，仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡，可以左右前后观察，不同方向观察之后确认无气泡，然后再往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧中间，使膜成U型，然后将U型的底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。
10分钟Get！大牛教你用imageJ对Westernblot条带进行灰度分析！
10分钟Get！大牛教你用imageJ对Westernblot条带进行
灰度分析！
科研人员做的western blot实验一般需要对其结果扫描后进行灰度分析，一般使用的软件为Image 。
采用Image J 软件对蛋白质印迹实验结果（Western Blot）进行灰度半定量分析，是分子生物学实验中比较常用的方法，可实现对WB实验结果进行准确、简单和快速的分析。
ImageJ分析Westernblot条带图
Step 1:打开Image J, 导入图片→Image→Type→8 bit
Step 2:选择工具框中第一个矩形框选项，选中所有的条带
Step 3:点击Analyze→Gels→Plot Lanes
Step 4:选用工具框中的直线工具，将开口波峰封闭
Step 5:选用工具框中的魔棒工具，点击相应的波峰，相应area值
ImageJ分析Westernblot条带图
Step 1:打开Image J, 导入图片。
Image→Type→8 bit
Step 2:扣除背景P→rocess→Subtract Background→选择50 pixels和Lightbackground
Step 3:设定参数→Analyze→Set Measures→按照下图勾选参数
Step 4:设定参数→Analyze→Set scale→unit of length选项改为pixels
Step 5:图像分割→Edit→Invert→选用椭圆或自定义工具选中条带
Step 6:Analyze→Measure→得到 IntDen值Step 7:重复Step5、6，得到所有条带的IntDen值
以上实用干货来源于课程
30分钟精通Image J图片处理。
western blot条带分析
近几天回答了蛋白版几个有关压片和显影的帖子，发现在这一块还没有比较系统的论述。
特贡献了western显影常见问题及解决方案，是我的经验总结，以供大家参考。
其中绝大部分问题是我所遇到过的，其他个别我没遇到过的是参照pierce公司的说明书。
限于字数，语言比较简洁，如对其中内容有疑问或建议可跟帖。
Western荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—显影和定影效率这一系统。
我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光则压10~30s，看不到则同时压两张，10~30min洗一张，如果无则再补一张,1h后洗。
再无，则压过夜。
共3张片，根据每次结果调整。
其中两张片子的压法如下描述: 先剪一张比膜长2~3厘米的片子（以供贴胶带），然后剪2片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。
这样就固定了第一张胶片，就不会因为放、取第二张胶片而使第一张移动了。
然后放第二张胶片，与第一张片子贴在一起就行，注意片子要干燥，压片前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。
取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一张错开了，不要用手抠，否则下面一张也移动了。
在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带，否则在胶带的地方会影响显影。
荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减，所以下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。
现象-- - - - - - - - - - - - - - - - - - --原因- - - - - - - - - - - - - - - - --- -- -- --- -- ---解决反影(白色条带,黑色背景) ---- -- -1 HRP过高(背景较高) - - - - - - - - ---- - - - 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1显影后膜上条带处变为黄色---- - -2 HRP过高(敏感性太高)- - - - - - - - - ---- -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2信号弱或无---- - - - - - - - - - ---- 3 HRP过高引起底物迅速耗竭- - - - - -- - - -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3--- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --4 抗体-抗原系统敏感性过低- --- - - - - - - 提高抗体浓度/蛋白上样量*注4- - - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --5 转膜不充分/过转- -- -- - - -- - - - - ---- -优化转膜条件*注5-- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - - -6 HRP或底物活性降低---- - - -- - - -- - ----测试活性或选用敏感底物*注6高背景---- - - - - - - - - - - - - - - -7 HRP过高(背景较高) - -- - - - - - - - - - -- 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7---- - - - - - - - - - - - - - --- - - ----8 封闭时间不足- - - - - - - - - - - -- - - - -- 延长封闭时间4度过夜最好*注8--- - - - - - - - - - - - - - --- - -- -- -9 抗体与封闭液有交叉----- - - - - - - - - - -更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9--- - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -10 TBST洗脱不足- - - - - - - ---- - --- - - -增加洗脱时间、次数、用量*注10---- - - - - - - - - - - - - - -- - -- - --11 暴光时间过长- - - - - ---- - - ------ -- --降低暴光时间*注11 - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----12 抗原-抗体浓度过高- - - - - - -- --- - - - 降低抗体浓度或蛋白上样量*注12条带内无显影的白点----------------13 转膜不良（如有气泡在胶-膜之间) -- -- 精细操作*注13 --- - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----14 膜平衡不均/油脂污染- - - - - - - - - - - 按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注14---- - - - - - - - - - -- ------------ -- 15 膜与X光片间有气泡- -- - - - - - - - - - --显影前去除气泡*注15非特异性条带- - - - - --------- -- - -16 抗体交叉反应- - - - - - - - - - - -- -- - --至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注16- - - - - - - - - - - - - - - --- ---- - - -17 SDS非特异性结合蛋白条带- - --- - ---使用无SDS转膜液*注17散在小圆斑- - - - - -- - -- -- - - ---18 封闭液有杂质颗粒- -- - --------- ------- 静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层*注18*注1 其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带.形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。
western-blot条带分析及解决方法模板
*注1 其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带.形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。
这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。
如果没有背景则就是原因3的现象。
在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。
如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。
也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。
还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。
其分析和解决同上。
*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。
如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。
如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。
但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。
但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。
原因1和3若如是则解决也是一样的。
*注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。
Western Blot(个人版)分析
Western Blot 实验方法一蛋白提取1、切取组织，置于已经用记号笔标记好的EP管底，称重（mg）插入冰盒中，注意不同样品间所用剪刀、刀片、镊子等要擦拭干净。
2、配置裂解液：980ulRiPA+10ul10%PMSF+10ul混匀机混匀。
3、每EP管中加裂解液(10ul/1mg)，超声（time --pulse--AMPL- -start--O）5s停5s循环1min ,振幅25%（AMPL参数）,再裂解30min 。
4、于40C冷冻离心机中预冷15min，1200r/min.将裂解后的组织液离心15min，取上清即为所提蛋白，至于一个试管内，用酶标仪测浓度，再高温变性，再上样，多余的试剂置-80℃保存。
5、用玻璃小烧杯配制定量用的试剂：（2mlH2O+500ul考马斯亮蓝）+36ulH2O+4ul 样品，另加一个标准品BSA(10ul/ml)对照组，一个空白对照组。
6、(4倍)上样缓冲液稀释成（1倍），即:30ul上清液+10ul(4倍)上样缓冲液（红色的，购买的），震荡混合+离心，高温振荡机中变性，950C，5min，注意使离心液全部流于底部，准备跑电泳。
7、测595nm吸光度，打开盖预热30min，每次都将空白校正0，读取标准品对照组，样品组的吸光度，尽快。
比色皿水洗+酒精洗。
8、建Excel：（一）Cx=Ax/A标。
C标（C标=10ug/ml ,由30ul稀释至40ul, A标已经知道的）（二）一般上样量为：30ug, 故: 30ug上样量/(0.75Cx)=V上样（ml）由（一）（二），得：V上样=A标/Ax .4二配胶1、提前配板：洗板，吹干，对齐，夹紧（向下压），配分离胶（两块板10ml），灌胶，压水，观察是否漏液，出现分界面，配浓缩胶（两块板4ml），若温度太低不易凝，可将分离胶中10%APS,TEMED同时加倍促凝.将配胶用烧杯洗净干燥，配胶：10％分离胶5％浓缩胶10ml(两快板) 15ml(三快板) 4ml (l两块板) 6ml(三块板) H2O 4.0ml 5.9ml 2.7ml 4.1 ml 30％丙稀酰胺 3.3ml 5ml 670ul 1.0Tris-HCL 2.5ml（1.5M，Ph8.8）3.8ml 0.50ml（1.0M，Ph6.8）0.75ml 10％SDS 100μl 150ul 40μl60ul10％APS（聚合剂，现配，灌胶前加入）100μl 150ul 40μl60ul TEMED（加速剂，灌胶前加入）4μl 6ul 4μl6ul2、根据板子数计算所需胶的体积数，根据比例配制胶液，为铺胶平整下层胶铺好后立即UP水封，待胶干后倒去上层UP水并用滤纸吸干，按比例配制浓缩胶（积压胶），最后上梳子（注意孔数、厚度与玻璃板搭配）；补液。
如何用Imagelab分析WesternBlot条带
如何用Imagelab分析WesternBlot条带豆子老师完全放开了，今天写的帖子是手把手系列的，她十分适合做教导主任。
技能需要一个个掌握，等到大部分技能都写完，我们会尝试如何把生信和实验结合起来，从无到有，提出科研假说，设计课题，完成课题，发表文章，申请基金，拿到基金探索新的课题，形成科研的闭环。
这周我们来探讨一下Image lab，Image lab也很好用，但是操作比image J操作复杂一些，更致命的一点就是Image lab只能识别自己曝光的图，也就是scn格式的图，tif格式并不能识别，而我们Western的曝光仪器并不是，所以我用的相对比较少，只是以前觉得所有的软件都是有用的，看见别人用，都觉得好就都下载了下来。
所以这次的图也是别人赞助的，感谢YY的友情赞助。
方法一：1.首先打开你要分析的数据，一般是scn这个格式才能打开，也就是说用这个软件曝光的才能用这个软件来统计。
这个是从别人那里拷来的图，非常感谢支持YY的支持。
2.选择左侧的体积工具，选择矩形3.用鼠标圈中你分析的条带U14.然后复制这个矩形，粘贴八个，我这里就粘贴5个了，只是举个例子，操作都是一样的5.分别圈住所有的条带6.然后点一下分析表，就出现了下面的表格。
7.然后选择表格上面最右侧的按钮，导成Excel文件8.一般背景深的话，选调整体积徒手圈也可以，但是手太抖，我每次都画不好。
这样可以知道大概的趋势。
也可以选择哪一个泳道的条带为1，双击该矩形，会出现“体积类型”、“数量”、“参考体积”等选项，打勾“参考体积”，确定。
9.然后点击“分析表”，各种定量结果会显示出来。
同样选择从左数第四个按钮“将分析表导出至文件”，选择相对定量。
方法二：1.首先打开Image lab，打开一张Image lab电泳图片。
点击泳道和条带，找到泳道下手动功能，输入泳道号，我们一共有8个条带，输入82.在“所有泳道”功能下面可以选择调整泳道框的大小。
Western条带质谱
百泰派克生物科技
Western条带质谱
蛋白印迹（Western blot）是根据抗原和抗体特异性结合的特点，来检测复杂样本中蛋白是否表达以及表达的相对丰度的一种技术手段。
Western blot只能用于粗略分析基因表达蛋白是否表达以及蛋白的相对表达含量，通常需要与质谱技术联合使用，来实现对样本中表达蛋白的准确定性分析和定量分析。
质谱技术可一次性分析样本中的多种蛋白，通过对Western blot分析得到的蛋白条带进行质谱技术检测，可明确样本中表达蛋白的种类、相对丰度及其差异蛋白。
此外，Western blot还可用于验证样本中相互作用蛋白，验证得到的互作蛋白联合质谱技术检测，不仅能够验证已知蛋白的相互作用，还可以对与目标蛋白发生相互作用的未知蛋白进行鉴定。
百泰派克生物科技提供蛋白质免疫印迹和电转移分析服务，蛋白质免疫印迹法通过高选择性和高敏感的抗体-抗原相互作用，可用于从复杂蛋白质混合物中检测特定的目标蛋白质，所得数据可用于对目标蛋白质进行定性和半定量分析。
您只需告知我们您的实验目的并寄出样品，我们将负责项目后续所有事宜，包括蛋白提取、分离、免疫印迹、质谱分析、质谱原始数据分析和生物信息学分析等。
Image J和Graphpad如何对Western Blot条带灰度分析
Image J和Graphpad如何对Western Blot条带灰度分析WB是研究蛋白表达的一个经典方法。
对于一些时间点或者是不同组织蛋白表达量的分析就涉及到量的变化。
一些凝胶成像软件带有此分析工具，比如Quantity One，Bandscan，Gel-Pro Analyzer等成像系统专用软件。
除了这些软件，还有一个比较简单的综合性质图像处理软件Image J可以很方便的进行灰度分析。
而且Image J是开源性质的免费软件，可以在其官网直接下载使用。
对Western Blot条带进行数值化有两种方法——灰度分析和光密度分析。
灰度是计算机图像分析仪根据图像颜色深浅分为256个级别。
灰度值越小物体颜色越深。
光密度是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度IO与该光线通过溶液或物质后的透射光强度Ib比值的对数OD=log（IO/Ib）；图像分析中，入射光和透射光强度分别被切片上最亮区域的平均灰度值和待测目标平均灰度值取代，则图像分析系统的光密度值=log（切片标本最亮区域的平均灰度值（g0）/待测目标的平均灰度值（g））。
光密度值越大，物体颜色越深，阳性物质相对含量越大。
对于灰度值来说，切片标本制作时染色时间长短，以及测量时显微镜照明光源电压的大小对其影响很大。
而光密度是一个比值。
是通过计算一张切片标本最亮区域的平均灰度值与该切片标本中待测目标的平均灰度值的比值，再根据数学公式计算而来的，所以受切片标本染色时间长短及照明光源电压关系很小。
然而有研究实践显示，灰度值与光密度值二者之间存在着线性关系，都可以用来进行WB定量分析。
同样，Image J软件进行WB条带定量分析时也存在两种方法，此处只列举一种方法，具体步骤如下。
1、下载安装，并打开Image J软件。
2、导入WB条带图片。
File→Open→弹出对话框→选择文件夹→找到WB条带。
3、把图片转化成灰度图片：Image→Type→8-bit。
这时WB图片将会随之改变。
western-blot条带分析及解决方法
持续发光一段时间使胶片感光为黑色。
这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。
如果没有背景则就是原因3的现象。
在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。
如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。
也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。
还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。
其分析和解决同上。
*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。
如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。
如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。
但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。
但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。
原因1和3若如是则解决也是一样的。
*注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。
主要出现在HRP极高的情况下，来不及压片就已耗竭底物，往往伴有原因2的现象。
ai处理wb蛋白条带
ai处理wb蛋白条带
处理WB（Western Blot）蛋白条带是生物学研究中常见的实验
步骤之一，用于检测特定蛋白在样本中的存在以及其相对丰度。
在
处理WB蛋白条带时，需要注意以下几个方面：
1. 样本制备，样本制备是WB实验的第一步，包括细胞裂解和
蛋白提取。
合适的细胞裂解缓冲液和蛋白抽提方法对于蛋白质的完
整性和纯度至关重要。
2. SDS-PAGE电泳，样本蛋白质经过SDS-PAGE凝胶电泳分离，
根据分子量大小在凝胶上形成条带。
电泳条件的选择和凝胶浓度的
确定会影响蛋白条带的清晰度和分离效果。
3. 转膜，电泳后，蛋白需要转移到膜上进行进一步的免疫印迹
分析。
选择合适的转膜条件和膜材料对于蛋白的转移效率至关重要。
4. 免疫印迹，膜上的蛋白与特异性抗体结合，形成特定的条带。
免疫印迹条件的优化和抗体的选择会直接影响到条带的清晰度和信
号强度。
5. 图像获取和分析，使用化学发光或荧光成像系统获取蛋白条带的图像，然后进行定量分析。
确保图像清晰度和曝光时间的合适性，以及使用合适的分析软件进行数据处理和结果解读。
除了以上步骤外，还需要注意实验中的质量控制和重复实验的可靠性。
综合考虑实验条件、试剂选择、操作技巧和数据分析，可以得到准确可靠的蛋白条带结果。
希望以上信息能够帮助你更全面地了解处理WB蛋白条带的过程。
western blot条带分析
近几天回答了蛋白版几个有关压片和显影的帖子，发现在这一块还没有比较系统的论述。
特贡献了western显影常见问题及解决方案，是我的经验总结，以供大家参考。
其中绝大部分问题是我所遇到过的，其他个别我没遇到过的是参照pierce公司的说明书。
限于字数，语言比较简洁，如对其中内容有疑问或建议可跟帖。
Western荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—显影和定影效率这一系统。
我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光则压10~30s，看不到则同时压两张，10~30min洗一张，如果无则再补一张,1h后洗。
再无，则压过夜。
共3张片，根据每次结果调整。
其中两张片子的压法如下描述: 先剪一张比膜长2~3厘米的片子（以供贴胶带），然后剪2片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。
这样就固定了第一张胶片，就不会因为放、取第二张胶片而使第一张移动了。
然后放第二张胶片，与第一张片子贴在一起就行，注意片子要干燥，压片前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。
取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一张错开了，不要用手抠，否则下面一张也移动了。
在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带，否则在胶带的地方会影响显影。
荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减，所以下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。
现象-- - - - - - - - - - - - - - - - - - --原因 - - - - - - - - - - - - - - - - --- -- -- --- -- ---解决反影(白色条带,黑色背景) ---- -- -1 HRP过高(背景较高) - - - - - - - - ---- - - - 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1显影后膜上条带处变为黄色---- - -2 HRP过高(敏感性太高)- - - - - - - - - ---- -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2信号弱或无---- - - - - - - - - - ---- 3 HRP过高引起底物迅速耗竭- - - - - -- - - -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3--- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --4 抗体-抗原系统敏感性过低- --- - - - - - - 提高抗体浓度/蛋白上样量*注4- - - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --5 转膜不充分/过转- -- -- - - -- - - - - ---- -优化转膜条件*注5-- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - - -6 HRP或底物活性降低---- - - -- - - -- - ----测试活性或选用敏感底物 *注6高背景---- - - - - - - - - - - - - - - -7 HRP过高(背景较高) - -- - - - - - - - - - -- 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7---- - - - - - - - - - - - - - --- - - ----8 封闭时间不足- - - - - - - - - - - -- - - - -- 延长封闭时间4度过夜最好*注8--- - - - - - - - - - - - - - --- - -- -- -9 抗体与封闭液有交叉----- - - - - - - - - - -更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9--- - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -10 TBST洗脱不足 - - - - - - - ---- - --- - - -增加洗脱时间、次数、用量*注10---- - - - - - - - - - - - - - -- - -- - --11 暴光时间过长 - - - - - ---- - - ------ -- --降低暴光时间*注11- - - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----12 抗原-抗体浓度过高 - - - - - - -- --- - - - 降低抗体浓度或蛋白上样量*注12条带内无显影的白点----------------13 转膜不良（如有气泡在胶-膜之间) -- -- 精细操作*注13--- - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----14 膜平衡不均/油脂污染- - - - - - - - - - - 按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注14---- - - - - - - - - - -- ------------ -- 15 膜与X光片间有气泡- -- - - - - - - - - - --显影前去除气泡*注15非特异性条带- - - - - --------- -- - -16 抗体交叉反应- - - - - - - - - - - -- -- - --至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注16- - - - - - - - - - - - - - - --- ---- - - -17 SDS非特异性结合蛋白条带 - - ---- ---使用无SDS转膜液*注17散在小圆斑 - - - - - -- - -- -- - - ---18 封闭液有杂质颗粒- -- - --------- ------- 静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层*注18*注1 其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带.形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。
Western blot详解及问题分析
Western Blot
不连续电泳：
作用
浓缩胶 分离胶 使蛋白样品浓缩 使蛋白样品分离
缓冲液PH
pH6.8TrisCl pH8.8TrisCl
凝胶浓度
低，2-5% 高，根据蛋 白大小
电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。
Western Blot
灌制分离胶
隔绝空气
ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%
蛋白质-SDS胶束的特点：
（1）具有相同的形状，形状 像一个长椭圆棒
（2）平均1g 蛋白质结合
1.4g SDS （3）短轴对不同的蛋白质亚 基-SDS胶束基本上是相同的 （4）长轴的长度则与亚基分
子量的大小成正比
Western Blot
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
不连续的电泳缓冲体系。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电 荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。
Western Blot
灌制积层胶
插入梳子
Western Blot
Staking gel
Separating gel
Western Blot
转膜
要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固 相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法： 毛细管印迹法和电泳印迹法。 常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者 的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和 施加电场的机械装置不同。
蛋白质浓度测定的各种方法汇总：
/thread-23639-1-1.html
Western Blot
蛋白样品的变性
2×SDS-PAGE上样缓冲液：
1M Tris-HCl(pH6.8) 1M DTT SDS 甘油 溴酚蓝 总体积 10 ml 20 ml 4g 20 ml 0.2 g 100ml
western-blot条带分析及解决方法
持续发光一段时间使胶片感光为黑色。
这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。
如果没有背景则就是原因3的现象。
在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。
如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。
也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。
还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。
其分析和解决同上。
*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。
如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。
如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。
但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。
但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。
原因1和3若如是则解决也是一样的。
*注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。
主要出现在HRP极高的情况下，来不及压片就已耗竭底物，往往伴有原因2的现象。
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近几天回答了蛋白版几个有关压片和显影的帖子，发现在这一块还没有比较系统的论述。
特贡献了western显影常见问题及解决方案，是我的经验总结，以供大家参考。
其中绝大部分问题是我所遇到过的，其他个别我没遇到过的是参照pierce公司的说明书。
限于字数，语言比较简洁，如对其中内容有疑问或建议可跟帖。
Western荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—显影和定影效率这一系统。
我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光则压10~30s，看不到则同时压两张，10~30min洗一张，如果无则再补一张,1h后洗。
再无，则压过夜。
共3张片，根据每次结果调整。
其中两张片子的压法如下描述: 先剪一张比膜长2~3厘米的片子（以供贴胶带），然后剪2片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。
这样就固定了第一张胶片，就不会因为放、取第二张胶片而使第一张移动了。
然后放第二张胶片，与第一张片子贴在一起就行，注意片子要干燥，压片前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。
取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一张错开了，不要用手抠，否则下面一张也移动了。
在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带，否则在胶带的地方会影响显影。
荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减，所以下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。
现象-- - - - - - - - - - - - - - - - - - --原因- - - - - - - - - - - - - - - - --- -- -- --- -- ---解决反影(白色条带,黑色背景) ---- -- -1 HRP过高(背景较高) - - - - - - - - ---- - - - 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1显影后膜上条带处变为黄色---- - -2 HRP过高(敏感性太高)- - - - - - - - - ---- -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2信号弱或无---- - - - - - - - - - ---- 3 HRP过高引起底物迅速耗竭- - - - - -- - - -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3--- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --4 抗体-抗原系统敏感性过低- --- - - - - - - 提高抗体浓度/蛋白上样量*注4- - - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --5 转膜不充分/过转- -- -- - - -- - - - - ---- -优化转膜条件*注5-- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - - -6 HRP或底物活性降低---- - - -- - - -- - ----测试活性或选用敏感底物*注6高背景---- - - - - - - - - - - - - - - -7 HRP过高(背景较高) - -- - - - - - - - - - -- 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7---- - - - - - - - - - - - - - --- - - ----8 封闭时间不足- - - - - - - - - - - -- - - - -- 延长封闭时间4度过夜最好*注8--- - - - - - - - - - - - - - --- - -- -- -9 抗体与封闭液有交叉----- - - - - - - - - - -更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9--- - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -10 TBST洗脱不足- - - - - - - ---- - --- - - -增加洗脱时间、次数、用量*注10---- - - - - - - - - - - - - - -- - -- - --11 暴光时间过长- - - - - ---- - - ------ -- --降低暴光时间*注11 - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----12 抗原-抗体浓度过高- - - - - - -- --- - - - 降低抗体浓度或蛋白上样量*注12条带内无显影的白点----------------13 转膜不良（如有气泡在胶-膜之间) -- -- 精细操作*注13 --- - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----14 膜平衡不均/油脂污染- - - - - - - - - - - 按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注14---- - - - - - - - - - -- ------------ -- 15 膜与X光片间有气泡- -- - - - - - - - - - --显影前去除气泡*注15非特异性条带- - - - - --------- -- - -16 抗体交叉反应- - - - - - - - - - - -- -- - --至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注16- - - - - - - - - - - - - - - --- ---- - - -17 SDS非特异性结合蛋白条带- - --- - ---使用无SDS转膜液*注17散在小圆斑- - - - - -- - -- -- - - ---18 封闭液有杂质颗粒- -- - --------- ------- 静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层*注18*注1 其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带.形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。
这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。
如果没有背景则就是原因3的现象。
在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。
如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。
也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。
还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。
其分析和解决同上。
*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。
如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。
如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。
但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。
但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。
原因1和3若如是则解决也是一样的。
*注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。
主要出现在HRP极高的情况下，来不及压片就已耗竭底物，往往伴有原因2的现象。
可通过加入底物后迅速进入暗室观察荧光确定，也可以根据原因2的现象确定，以区分于原因4、5、6。
除非动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。
也可以过一段时间待HRP稍减后TBST简单洗膜重新加底物压片。
这种情况下一/二抗稀释可高达10倍而依然荧光明显。
*注4 提高抗体上样量以及下述的使用敏感底物/延长压片时间比较简单,在此不赘述，只提醒一下随抗体浓度增高背景和非特异性可能会增加。
关于上样量的极限在此发表我的看法：对于裂解的混合蛋白以上样孔底面积(平方毫米)乘30ug作为极限上样量，而落实到每一个具体条带（同一分子量的所有蛋白或仅做单一蛋白电泳），则以0.3ug/平方毫米底面积作为极限上样量。
(见《抗体技术实验指南》的免疫印迹一章)，超过此量可能会导致条带变形。
条带信号弱可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。
但实际上样量的极限并不以我说的极限上样量为准，因为这个极限上样量是确保所有分子量的条带都跑的很漂亮的极限,而上样超量的表现是随量的加大变形的条带由低分子量逐渐往高分子量延伸。
所以western极限上样量的真正操作标准是以目的条带不变形作为极限。
比如对于150kd，完全可以超出我所说的极限上样量的2倍而不变形（此时中低分子量条带早已融合或挤为棒槌形了）*注5 对于非小分子量尤其是大分子量（>100kd）蛋白而言，一般不会出现过转情况，转膜不充分是主要原因，增加转膜力度无非是加大电压/电流，延长时间。
但对于小分子蛋白（<30kd就要注意了，<15kd尤其要当心）很可能出现过转，丽春红染膜或观察marker有没有穿膜可以确认，没有丽春红也可以考染转膜后的胶，如果是一片空白，则要小心了，可适当降低转膜力度。
对于低分子量一般转膜液不要加SDS以防过转，《抗体技术实验指南》提供的针对中低分子量的湿转缓与高分子量的相比也是不含SDS的。
*注6 测试HRP或底物活性：于暗室EP管加底物A、B液各500ul，加入1ul HRP偶联二抗，若底物立即发出蓝光并于随后数分钟内消失说明HRP和底物尚好。
此外试剂公司还开发一些超级底物，其敏感度可达到pg级，但价格昂贵，对某些表达较低的蛋白效果会好些，而且也超级省抗体（其推荐抗体稀释比高达1:10,000以上）。
我用的是敏感度为ng级的底物，大部分western都还可以，pg级的还放在手里，没舍得用。
*注7 高背景原因是因为HRP偶联二抗结合到膜上，其原因包过直接结合、通过膜上蛋白间接结合、通过一抗（主要指多抗中的杂抗体）间接结合、通过封闭物（与封闭物交叉反应）间接结合、洗脱不彻底等原因造成的。
在稀释抗体降低背景的同时也会降低对目的蛋白的结合效率，意即以牺牲信号强度为代价。
不过在此提出另外一种和稀释抗体恰相反的做法——提高抗体浓度。