2013415疟原虫血片制作染色
疟原虫血片制作及染色
血膜染色 （二）染色的原理
染色化学反应反应的示意图：
疟原虫细胞浆的阴离子（COO—）＋ 美蓝阳离子—→呈蓝色
┏天青（染媒作用） 疟原虫核的阳离子（NH3+）＋┫
┗伊红阴离子
－→ 呈紫红色
血膜染色 （二）染色的原理
蛋白质本身是阴阳电荷是相等，带有两基性的。所 以其所带阴阳电荷的数量可受周围液体的酸碱度（ PH）而改变，在偏酸的溶液中阳离子增加，易于伊 红结合，着色偏红。在偏碱的溶液中阴离子增加， 易于美蓝结合，着色偏蓝。这就说明了为何配制染 液的酸碱度直接影响了血片染色的质量，偏酸着色 过红，偏碱着色过蓝。所以在染血片时稀释液要控 制在PH7.2，最为适宜，疟原虫的结构才能清晰可见 。
血膜制作（工具准备）
一次性采血针、75%酒精、棉棒（球）,载玻片， 推片，记号笔或铅笔。
血膜制作（取血操作）
取血方法 采血部位一般人为耳垂，指头， 通常在耳垂取血。先用75%酒精棉球消毒 取血部位（冬季用手捻动耳垂使其充血后 再行消毒），待酒精干后，用左手拇指和 食指紧捏耳垂上方，右手持消毒采血针（ 一人一针，避免血传疾病）迅速刺入耳垂 下端1~2毫米，不宜过深或过浅。然后用 右手中指轻轻向上挤压出血。
成批血片染色：将已固定薄血膜的血片插入染色缸， 倒入2%吉氏染液稀释液（2毫升原液加中性蒸馏水 98毫升稀释均匀即成），同时对厚薄血膜染色30分 钟，然后用清水注入染缸将染液通过溢出方式洗去， 再用清水浸洗1-2次，干净后将血片标本（血膜面朝 下）插于晾干板上，待干后镜检。
单张血片染色：薄血膜经固定干燥后，用中 性蒸馏水（或娃哈哈矿泉水）1ml，加吉氏 母液1~2滴，混合均匀后滴入血片标本上， 染色10~20分钟，然后用清水轻轻将片上的 染液冲洗干净，晾干镜检。
疟原虫血片制作及染色
血膜制作（取血时间）
取血时机 现症病人一般可随时取血，疟疾普 查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期 疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。
血膜制作（取血时间）
间日疟
前驱期相当于肝内期疟原虫发育，因原虫密度太低， 镜检多为阴性。
发冷（寒战）期相当于红内期成熟裂殖体涨破 红细 胞期，镜检多为裂殖体和环状体。
血膜制作（涂片操作）
厚血膜 用推片的一角，从取血部位刮取约4-
5微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与 平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转 ，转2~4圈，再回到圆心收起，涂成直径 0.8~1cm大小圆形厚血膜。水平放置，务必使 血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检 出率的要求。
血膜制作（涂片操作）
标本片
疟疾调查时，每张玻片
可涂制2~3人血膜。
发热病人血片
厚、薄血膜的位置
每张载玻片上可做1个薄血膜和1个厚血膜，如图
2.5cm
各种不同的疟疾血片涂制法：
标准血片
门诊发热病人血片 居民普查血片
血膜制作（涂片操作）
血膜编号 血膜制成后，立即用特种蜡笔或 水笔于玻片面上写上受检者的号码，以防 差错，待薄血膜干后再用铅笔于薄血膜中 写上血片种类的代号和受检者的个人编号， 依次顺序插入标本盒内。
将推玻片向1的方向稍抽回，当血液充满推 玻片适当宽度（约2cm）后，以一定均匀的 速度向2的方向滑动（约2.5cm）。
血涂片质量评价：Βιβλιοθήκη 血膜均匀、厚薄度合适、无空泡、无划痕 薄血膜头体尾位置和形状好、无停顿起伏、
两侧留出空间
注意：血滴大，速度快、角度大 血膜厚
血滴小，速度慢、角度小 血膜薄
薄血膜
取洁净的载玻片2张，1张以左手拇指，食指夹持 载玻片两端（手指切勿接触玻片表面），用另1张 边缘平滑（最好为磨口边缘）的载玻片做推片， 用推片一端边缘的中点从取血部分取约1微升的血 量（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载 玻片接触，并形成25~30度夹角，待血液向两侧 扩展约2cm长度时，均匀而迅速地轻轻向左推出 （约2.5cm长）。
疟疾血膜制作及染色技术
疟疾血膜制作及染色技术一、血片的制作1.材料准备载玻片：新玻片浸入有液态洗涤剂的清水中10-20分钟，干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净，晾干备用。
1. 2. 采血针：一次性 . 玻片盒：防止污染和昆虫吸食血膜 1. 4. 75%酒精棉球：采血前后消毒 . 记号笔：玻片上书写号码2.血片的制作（厚、薄血膜）用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂成薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂成圆盘状，称厚血膜。
最好一张玻片上同时制作厚、薄两种血膜。
薄血膜涂片薄血膜取洁净的载玻片1张，左手持载玻片平置,右手持推片，推片一端边缘的中点刮取血液~微升（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片中线接触，待血液向两侧扩展约2cm宽时，以25°～35°夹角均匀而迅速地向左推成舌状薄血膜（约长）。
厚度以薄血膜上的红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳。
厚血膜涂片用推片的一角刮取4~5微升血量（相当于火柴头大小），使血滴涂于载玻片的中央偏右处，由里向外一个方向旋转2圈，涂成直径~的圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求（厚度以1个油镜视野内可见5~10个白细胞为宜）。
血膜位置通常将厚、薄血膜涂在一张载玻片上。
方法是将载片分为6等分，第1、2格备贴标签及编用；厚血膜涂在第3格中央；薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部。
血片的制作编号血膜制成后，立即在玻片面上写上受检者的号码（姓名）、单位(地址)、制片日期、以防差错；待血膜干后依次按顺序插入标本盒内。
血膜制作注意事项1. 清洗玻片，且勿碰撞、磨损2. 刚涂制的血膜要平放在标本盒内3. 血膜应自然干燥，要充分干燥。
二、血片染色：（吉氏染液的染色方法）1. 血膜染色前的处理固定薄血膜血片干燥后，用吸有甲醇的吸管在薄血膜表面轻轻涂抹，自然干燥。
注意固定时甲醇不要接触厚血膜，否则会影响厚血膜的溶血。
溶解厚血膜血片干燥后，用滴管滴水于厚血膜上，待血膜呈灰白色时，将水倒去，晾干。
疟原虫血片制作及染色PPT课件
瑞氏染液的染色方法：
先用蜡笔在厚、薄血膜间划一界限，滴 几滴蒸馏水在厚血膜上溶血。溶血后倾去 水滴。在薄血膜上加瑞氏染液 6 ～ 7 滴，摇 动玻片均匀染色 30 秒。然后再加 10 ～ 12 滴 蒸馏水于薄血膜上，摇动玻片将染液与蒸 馏水混合均匀后，用吸管把染液引到厚血 膜上，使厚血膜再染色5分钟。用清水轻轻 冲去染液，晾干镜检。
血膜制作（取血时间）
恶性疟较理想的取血时间是在发作后至 20h内取血， 发作后2小时左右，此时环状体发育至最高峰，初发 患者退热后常查不到原虫。末梢血血检到恶性疟原虫 配子体，是在末梢血出现环状 体之后的7-10天。
血膜制作（工具准备）
一次性采血针、75%酒精、棉棒（球）,载玻片， 推片，记号笔或铅笔。
血膜制作（取血操作）
取血方法 采血部位一般人为耳垂，指头， 通常在耳垂取血。先用75%酒精棉球消毒 取血部位（冬季用手捻动耳垂使其充血后 再行消毒），待酒精干后，用左手拇指和 食指紧捏耳垂上方，右手持消毒采血针 （一人一针，避免血传疾病）迅速刺入耳 垂下端1~2毫米，不宜过深或过浅。然后 用右手中指轻轻向上挤压出血。
单张血片染色：薄血膜经固定干燥后，用中 性蒸馏水（或娃哈哈矿泉水）1ml，加吉氏 母液1~2滴，混合均匀后滴入血片标本上， 染色10~20分钟，然后用清水轻轻将片上的 染液冲洗干净，晾干镜检。
2、瑞式染液的配制：
将瑞氏染剂粉 1g 置于研钵内，加入15ml 甘油 充分研磨后，倒入有塞玻璃瓶中，再用 500ml 甲 醇洗出研钵中的甘油溶液，倒入瓶中，摇匀后， 置室温下，每天摇动5分钟，3天后即可使用。 此方法染色的时间短，但染色效果不如吉氏 染液效果稳定，又不能大量血片染色，常用于门 诊应急情况下血片染色。
偏酸
疟原虫血片制作
疟原虫血片的制作工需要材料1 .采血器材：75%酒精棉球、一次性采血针、玻片、推片、铅笔、干净的绸布或化纤布。
2 .染色材料：①姬氏原液②.蒸储水或纯净水：①稀释姬氏原液②染色时冲洗染液③固定剂：①用甲醇或无水乙醇（乙醇含量达99.9%）,固定薄血膜②用无水乙醇擦洗油镜头。
④脱油剂：无水乙醍或二甲苯：镜检后的血片脱镜油。
油镜头脱油可用无水乙醍：无水乙醇的7:3混合液擦拭。
⑤擦镜纸。
二、采血前准备：1.玻片准备⑴我们现在用的玻片都是除去油渍的脱脂玻片，使用前可用绸布擦去玻片上纤维和浮灰，即可使用。
⑵新的尚未脱油脂的玻片：用洗衣粉水洗净后，一一浸泡于95%的酒精中约一周时间，然后一一取由，用软而洁净并没有棉花纤维的细布擦干，擦亮，收藏好。
⑶已用过的旧玻片：先消毒后用洗涤剂清洗，去除污渍，再一一浸泡于95%的酒精中约一周时间，然后一一取由，用软而洁净并没有棉花纤维的细布擦干，擦亮，收藏好2.玻片编号：在玻片的磨砂端用铅笔进行编号。
玻片编号、检验报告单号和登记号应一致，并具有唯一性。
3.采血时间：⑴间日疟、三日疟原虫患者可在发作的任何时间进行采血，但由于患者刚发冷发热以后，大部分是在环状体期，故这一时期区别疟原虫种类是不容易的。
所以在发作后的6〜8小时内采血为最佳，这时环状体以滋养发育成晚期滋养体，较易识别。
⑵。
恶性疟原虫；从理论上讲，因为恶性疟原虫的裂体生殖是在内脏的毛细血管内进行的，所以在发作之前，患者的末梢血液中不易查到，但实际情况不尽如此，一般在受感染者的末梢血液中，随时能见到少量的恶性疟原虫的环状滋养体；虽然如此,较理想的采血时间，是在发作后的20小时左右，因为这个时候，环状体虽已发育至最高峰，但尚未回到内脏毛细血管中去进行裂体生殖。
环状体的数量和构造。
有助于疟原虫种类的鉴别，恶性疟原虫的配子体很容易识别，但在初发时，一般需要在发作7〜10日后才能在末梢血液在由现，应当注意。
4.采血的部位和方法；部位：以耳垂采血为主。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
伊红在水溶液内遇到美兰或天青，即可互相化合而产生沉 淀从而失去染色力，因此，吉氏染液的母液绝对不能进水。
6/21/2020
17
血片的染色
（二）吉氏染液母液配置方法
取吉氏粉0.5克置于研钵中，
加少量甘油充分研磨，再加再磨，
至25毫升加完为止，倒入60或 100毫升带有玻塞的有色玻瓶中。
材料：
在研钵中加少量甲醇，洗去甘油 1、吉氏粉0.5克
6/21/2020
12
制作血膜的注意事项
3. 血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火烤， 干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可 能24~48小时内固定染色；冬天也不能超过 72小时。放置时间越久，厚血膜越不易溶血， 染色效果也差。若不能及时染色，薄血膜宜先 用甲醇固定（1~3分钟）然后用过滤清水或自 来水对厚血膜溶血，晾干后包好置干燥器于冰 箱内保存，用时将干燥器置室温中1~2小时后 取出染色。
6/21/2020
26
影响染色效果的因素
（7）染色后不要直接将染液残渣倒掉，应 沿玻片或染色缸边缘加水使染液表面一层溢 出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污染 片血膜。
6/21/2020
27
配制pH6.6~7.4缓冲液两种贮备液用量表
溶液Ⅰ
溶液Ⅱ
pH
ml
磷酸氢二钠含
ml
磷酸二氢钾含
量(g)
量(g)
血膜干燥后，用甲醇或无水酒精固定薄血膜，用过滤 清水或自来水对厚血膜溶血，然后再进行染色。
成批血片染色：将已固定薄血膜的血片插入染 色缸，倒入2%吉氏染液稀释液（2毫升原液加中性 蒸馏水98毫升稀释均匀即成），同时对厚薄血膜染 色30分钟（如染液不合标准时，得酌情增减染色时 间），然后用清水轻轻将染液冲去，再用清水轻轻冲 洗一次，干净后将血片标本（血膜面朝下）插于晾干 板上，待干镜检。
6.6
54.7
0.52
148.8
1.35
6.8
68.4
0.65
126.8
1.15
7
89.5
0.85
99.2
0.9
7.1
96.8
0.92
88.2
0.8
7.2
105
1
77.2
0.7
7.4126.31Fra bibliotek255.1
0.5
注：用于薄血膜的染色和一般漂洗时，用蒸馏水稀释至1 000ml，用于厚血膜 及同一张玻片上厚血膜与薄血膜的染色时，用蒸馏水稀释至500ml。
2.0～2.5cm
舌状厚薄均匀， 无划痕
圆形稍不均不整齐 厚薄不匀影响着色
略多或略少 稍偏右或偏左 稍大或稍小
舌状稍不均
过多或过少 偏右或偏左过多 过多或过少 厚薄不匀呈波浪型，有划痕
血片染色质量 外观 厚血膜完整
厚血膜半脱落 厚血膜全脱落
涂片规则
6/21/2020
23
影响染色效果的因素
（4）染液的稀释浓度 染液的浓度高其着 色就快而深，从而疟原虫寄生红细胞的薛 氏点粗大显著，但颜色常偏碱；染液浓度 过低则染色时间久，颜色偏酸，薛氏点不 明显或消失。
6/21/2020
24
影响染色效果的因素
（5）染色时间 染色时间长染色效果好， 反之较差。室温高则着色快，染色时间可 略缩短，气温低可适当延长。因此染色时 间应根据染液的质量、新旧、稀释浓度和 气温而适当增减。
6/21/2020
19
血片的染色 （三）吉氏染液血片染色方法
单张血片染色：薄血膜经甲醇固定干燥后，用 2%吉氏染液稀释液1~2毫升，滴入血片标 本上染色30分钟左右，或用中性蒸馏水1~2 毫升，加吉氏母液1~2滴，混合均匀后滴入 血片标本上，染色20~30分钟，然后用清水 轻轻将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。
6/21/2020
11
制作血膜的注意事项
2. 刚涂制的血膜要平放在标本盒内或者 实验台面上。厚血膜未干前勿使标本片倾 斜，以免未干的血膜倾向一侧，造成血膜 厚薄不均，厚处不易溶血和着色而影响检 查结果；晾干血膜时应注意防尘、防止苍 蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜，干后应及时装 入标本盒内。新木制标本盒需敞开放置一 段时间，让木醇挥发后才能使用，以免厚 血膜血红蛋白被其固定，不能溶血或染色 效果不佳。
制作厚血膜
制作薄血膜
厚血膜血量及涂片法
厚血膜 用推片的一角，从取血部位刮取约4~5微升血 量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触， 再由里向外一个方向旋转，转2~4圈，涂成直径 0.8~1厘米大小圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易 于脱落，过薄达不到检出率的要求。
6/21/2020
7
薄血膜血量及涂片法
Whatman(沃特曼)903号；将滤纸切成 10*2cm大小的纸片，以口径为1.2cm的大孔 管，在滤纸上压出两个圆形印迹备用。
载玻片的清洗
载玻片 用以涂制血膜的载玻片，必须清洁无油迹。 有油迹的载玻片涂制的厚血膜容易脱落，薄血膜涂 不均匀。
新玻片处理 应浸于有液态洗涤剂清水中10~20分 钟，然后用干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净， 晾干后用干净柔软的棉巾擦亮备用。也可以95%的 乙醇浸泡5~10分钟，再用纱布擦干擦亮备用。
6/21/2020
25
影响染色效果的因素
（6）染色用水 染液的稀释用水和染色后冲洗用 水应选择Ph7.0~7.2清洁水，通常使用的新鲜 的蒸馏水或过滤的冷开水，以及自来水、井水、 河水、泉水和雨水等。如果偏酸或偏碱，可用缓 冲蒸馏水调整。染色后发现血膜颜色偏蓝（偏碱） 或偏红（偏酸）时，可用与之相反的酸、碱度水 冲洗血片予以纠正。
6/21/2020
8
涂制厚、薄血膜的位置
通常是将厚、薄血膜涂在一张载玻片上。方法 是将载玻片分为3等分（留出标签或磨砂面位 置后的3等分）。厚血膜涂在载玻片靠近标签 或磨砂面方向的右1/3中央处，圆形、厚薄均 匀 、 边 缘 整 齐 。 薄 血 膜 涂 在 载 玻 片 1/2 至 左 1/3的中部位置，舌状、厚薄均匀。
6/21/2020
13
血片的染色
（一）染液的种类及染色原理
染液种类：目前所用的血片染色液，虽然名称 很多，但都是从罗门诺夫斯基氏创造的染液 变化过来的。总的可分为水溶液和酒精溶液 两大类，前者包括罗氏、西氏（Simon)、 J.S.B氏染液等，后者包括利氏 (Leishman)、瑞氏和吉氏染液（被国家推 荐使用）等。这些染液中的主要染剂都包含 美兰、伊红和由美兰氧化所成的天青，所以 称为多色性染剂。
6/21/2020
20
影响染色效果的因素
血片染色好坏除了与玻片是否清洁，血片 制作质量好坏等有关外，还受到以下几个 因素的影响：
（1）染料溶剂的质量 染料、甲醇和甘油 如果不纯，常使配制的染液偏酸或偏碱而 影响染色效果。因此必须用分析纯的甲醇 和中性甘油，而且在配制时所用的器具必 须干净而无水份。
血片制作和染色质量标准
项目
检查 内容
好
质量标准
中
差
厚血 膜
血量 位置
直径
4～5цl 玻片右1/3 0.8～1.0cm
略多或略少 稍偏右
0.7～0.8 或1.0～ 1.2cm
过多或过少 偏右过多 <0.7或>1.2cm
血片 制作
薄血 膜
外观 血量 位置 直径
外观
圆形厚膜均匀， 边缘整齐 1～1.5цl 玻片1/2～1/3处
血片的染色 （一）染液的种类及染色原理
染色原理：伊红是酸性水溶性钠盐，美兰是碱性 水溶性盐酸盐，当它们各自溶化水中时，就离 解为带阳电和阴电的离子。伊红主要离解为酸 性的阳离子，在遇到碱性的蛋白质如血红蛋白、 嗜伊红白血球颗粒等即可结合成不易溶于水的 沉淀物染成红色。美兰主要离解为碱性的美兰 离子，美兰就与疟原虫、淋巴和大单核细胞的 胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等酸性蛋白质结合 染成兰色。
染液混入瓶内，至25毫升甲醇 洗净钵中甘油染液为止，塞紧瓶
2、甘油25毫升
塞，充分摇匀，置于55~60℃ 3、甲醇25毫升
水浴中或温箱内24小时或室温
内3~5天，多加摇动，即成原
液。吉氏染液是目前较优良的血
膜染剂，即使在炎热天气中，亦
可经久不变。
6/21/2020
18
血片的染色 （三）吉氏染液血片染色方法
6/21/2020
4
采血时间
取血时机 现症病人一般可随时取血，疟疾普 查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期 疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。
间日疟在寒热发作时，外周血液中主要可见环 状体期；发作后数小时，环状体发育到滋养体 期，疟色素形成，形态较易辩认，为诊断疟疾 的有利时机；36~48小时，可检出裂殖体； 发作一、二次后，配子体出现较多。
6/21/2020
9
血片编号
血膜制成后，立即将受检者的个人编 号写在玻片磨砂面上（血片的编号要 与血检登记本上编号一致）以防差错。
6/21/2020
10
制作血膜的注意事项
1. 玻片清洗时，避免玻片碰撞、 磨损。制作血膜的载玻片必须完 全清洁而毫无油渍或污垢。制片 时，手指只能持载片的边缘，不 能接触玻片表面，以免油污使薄 血膜产生空白区以及厚血膜脱落。 作为推片的玻片边缘一定要平滑， 才能使推出的血膜均匀一致。
疟原虫血片制作及染色技术
湖北省疾病预防控制中心
6/21/2020
1
血片制作所需设备
载玻片 具有磨砂面，且规格是玻片宽度乘长度在 25.2*75.2mm，厚度1mm~1.2mm为好。
推玻片 有专用的。但现在一般选择边缘光滑整齐的载玻 片替代推玻片。
采血针 使用一次性的采血针。 玻片盒 木制/塑料均可以。 75%酒精棉球 用于采血部位的消毒。 记号笔/B2铅笔 用于载玻片上编写号码。