细胞培养技术在医药研究中的应用

细胞培养技术在医药研究中的应用

摘要：近年来，动物细胞培养技术在生物制药领域成为最受关注的热点之一，动物细胞培养技术广泛应用于动物细胞高密度培养，推动了现代生物医药

产业的发展。动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外模拟体内的: 生理环境 , 在无菌、适宜的培养条件下生长、繁殖的过程。利用人工培养的动物细胞可以进行科学研究和生物制药, 动物细胞的大规模的培养技术是生物制药中非

常重要的环节。在动物细胞培养过程中, 最重要的是使细胞的培养条件达到最

优化程度, 尽可能消除或减轻环境对细胞的影响, 因此动物细胞培养环境的控

制是细胞培养的关健技术。

关键词：动物细胞培养技术，生物制药，培养条件,人工培养。

自1885 年，Roux 从鸡胚中分离细胞首次建立体外细胞培养; Dulbecco于1943 年创建单层细胞培养已有半个多世纪。因其具有的培养简单、操作方便、消耗少、大量运用等优点，被广泛运用于生命科学的各个领域[1]。全球生物制药技术和市场的迅速发展为动物细胞培养基市场提供了快速成长的发展环境，

并使之保持强劲的发展势头。

1 细胞培养的环境及条件

1.1 无污染的环境

无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件[3]。

1.2 适宜的温度

维持培养细胞旺盛生长, 必须有恒定而适宜的温度。不同种类的细胞对培养温度要求也不同[3]。

1.3 气体环境和氢离子浓度

气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一, 所需气体主要有氧气和二氧化碳[3]。

1.4 适宜的p H 值

每种细胞都有其最适p H 值。p H 值随培养的细胞种类不同而不同, 大多数细胞的适宜pH 为7.2至7.4, 偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响[3]。

1.5 培养基

培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质, 而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境[3]。

1.6 细胞培养外部环境

细胞培养是一种无菌操作技术, 对实验室、常用设施及设备、培养器皿等都有严格的要求[3]。

2 细胞培养无菌操作基本技术无菌操作技术分为: 工作环境及表面、细胞培养所用器皿、培养液与培养细胞的处理。

2.1 工作环境的处理

使用层流超净工作台是最经济有效的手段[3]。

2.2 细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒

消毒方法分为物理灭菌法( 紫外线、湿热、干烤、过滤等), 化学灭菌法( 各种化学消毒剂) 和抗生素三类。[3]

细胞培养基的质量标准及产品质量控制参考国内外细胞培养基产品企业标

准的现状，着重考虑了生物制药用户对产品质量的要求以及《中华人民共和国

药典》的有关规定，清大天一制定了包括外观、溶解性、pH值、干燥失重、渗

透压、细菌内毒素、微生物限度、细胞生长试验共8 个项目的细胞培养基产品

的质量标准[5]。

1.1 外观

用肉眼观察产品的颜色、粉末细度的均匀程度[5]。

1.2 溶解性

通过对溶解于水后的细胞培养基的澄清度检查，判断细胞培养基的溶解性。要求取规定量供试品，加注射用水（水温20～30 ℃）至1 L，搅拌溶解，溶液

澄清[5]。

1.3 pH 值

要求取规定量供试品，用注射用水（水温20℃～30℃）溶解至1 L，加入规定量碳酸氢钠到上述溶液中，用与细胞培养基溶液pH 值相近的两种标准缓冲液校准pH 计后进行pH 值测定。规定每种细胞培养基产品的pH 值允许的偏差为

±0.3[5]。

1.4 干燥失重

细胞培养基具有吸湿性，在空气中放置水分会很快升高，干燥失重表示产

品中含湿量。控制细胞培养基中的水分可以防止微生物的繁殖，保持细胞培养

基的养分。规定了细胞培养基的干燥失重为5%[5]。

1.5 渗透压

细胞必须生活在等渗环境中，因此要控制培养基的渗透压范围。规定每种

细胞培养基产品渗透压值的允许偏差范围为±5%[5]。

1.6 细菌内毒素

细菌内毒素是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有生物活性的物质。

培养基细菌内毒素含量过高，对生物制品的质量有很大影响，而且会降低生物

制品的产率。因此清大天一根据《中华人民共和国药典》关于疫苗、基因工程

药品等注射用药须作细菌内毒素检查的规定，增加细菌内毒素检测作为细胞培

养基质量标准的项目之一。规定常规细胞培养基的细菌内毒素标准定为≤10

EU/ml（EU：细菌内毒素单位）[5]。

1.7 微生物限度

细胞培养基不是无菌产品，其中的微生物在一定条件下会吸收细胞培养基

中的营养物质滋生繁殖，导致细胞培养基变质失效。控制细胞培养基中的细菌

和霉菌，是延长细胞培养基有效期的方法之一。规定每克细胞培养基产品中细

菌数不得超过200 CFU（菌落形成单位），霉菌数不得超过50CFU。这个标准严

于《中华人民共和国药典》（2005 版）对口服给药制剂的微生物限度标准[5]。

1.8 细胞生长试验

目前国内尚无细胞培养和计数的法定方法，参考《体外培养的原理与技术》中关于细胞计数法的论述，规定细胞在37℃恒温条件下，在含体积分数为10%小牛血清的细胞培养液中生长48～72 h，细胞形态为成纤维样，贴壁生长，72 h

内细胞数量应由5×104 细胞/ml 达到1×105 细胞/ml，细胞生长48～72 h 后，更换不含小牛血清的细胞培养液，继续培养48 h，细胞形态为成纤维样，贴壁

生长，细胞计数应不小于1×105 细胞/ml[5]。

一·动物细胞的特点及生长特性动

物细胞虽可像微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器中进行大规

模培养，但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别：①动物细