试验一黄柏中小檗碱的提取分离和鉴别

天然药物化学实验讲义重庆医科大学药学院目录一、黄柏中生物碱的提取、分离和鉴别二、槐米中芦丁、槲皮素的提取、分离与鉴别三、穿心莲中穿心莲内酯的提取、分离与鉴别四、八角茴香挥发油的提取及鉴别五、大黄中蒽醌苷元的提取、分离与鉴别六、苦参生物碱的提取、分离与鉴别前言《天然药物化学实验》是一门实践性很强的课程，理论教学与实验教学是一个不可分割的完整体系。

通过实验课的学习使学生能印证并加深理解课堂讲授的理论知识，掌握由天然药物中提取、分离、精制有效成分，并对其进行鉴别的基本方法和技能，提高学生独立动手、观察分析、解决问题的能力，培养学生严谨的科学态度和良好的科研作风。

实验一黄柏中小檗碱的提取、分离和鉴别【实验目的】1.掌握从黄柏中提取小檗碱的原理和方法。

2.掌握小檗碱的理化性质和鉴别方法3.熟TLC的基本操作以及在中药有效成分提取分离中的应用。

【实验原理】1.小檗碱(berberine)，含量为1.4%-4%(川黄柏含量较高)性状：黄色结晶，有5.5个结晶水，mp145℃。

溶解性：能缓缓溶于冷水中（1:20），微溶于冷乙醇（1:100），易溶于热水和热乙醇，微溶或不溶于苯、氯仿和丙酮，硝酸盐极难溶于水，盐酸盐微溶于冷水（1:500）但较易溶于沸水，硫酸盐和枸橼酸盐在水中溶解度较大（1:30），盐酸小檗碱为黄色结晶，含2分子结晶水，220℃时分解并转变为棕红色小檗红碱，285℃时完全熔融。

2.小檗碱为季铵碱，其游离型在水中溶解度较大，其盐酸盐在水中溶解度较小。

利用小檗碱的溶解性及黄柏中含黏液质的特点，首先用石灰乳沉淀黏液质，用碱水提出小檗碱，再加盐酸使其转化为盐酸小檗碱沉淀析出。

【实验仪器与试剂】1.1000、500、100、10ml烧杯，10ml试管，试管架，托盘天平，量筒，三角漏斗，洗瓶，布氏漏斗，电炉，10×20cm薄层板，10×20cm薄层色谱缸，点样毛细管，紫外灯（仪），玻棒，牛骨匙，纱布，脱脂棉。

2.川黄柏粗粉，滤纸，pH试纸，生石灰，1%硫酸，浓硫酸，浓盐酸，浓硝酸，次氯酸钠，10%氢氧化钠，丙酮，乙醇，稀硫酸，锌粒，食盐，薄层用硅胶H，0.2%CMC-Na，展开剂：苯－乙酸乙酯－异丙醇－甲醇－水（6:3:1.5:1.5:0.3），甲醇，氨水，盐酸小檗碱对照品。

【实验步骤】1.提取称取黄柏粗粉200g，加入1%硫酸600mL，搅拌均匀，浸泡过夜，纱布过滤。

或称取黄柏粗粉200g，加入1%硫酸200mL，搅拌均匀，使湿润度合适，放置30min后，装入渗漉筒内，用1%硫酸浸泡过夜，渗漉，速度以5～6mL/min为宜。

收集渗漉液500～600mL 即可停止渗漉。

2.取上项提取液，加入石灰乳调pH11～12,静置沉淀，脱脂棉滤过，滤液用浓盐酸调pH2～3，再加入溶液量10%食盐，搅拌使溶解，溶液静置过夜，析晶，滤取结晶，得盐酸小檗碱粗品。

3.精制将盐酸小檗碱粗品放入25倍量沸水中，于水浴上加热使溶解，趁热滤过，滤液加浓HCI调pH2左右，静置过夜，滤取结晶，80℃以下干燥，得精制盐酸小檗碱。

4.盐酸小檗碱的鉴别（1）取盐酸小檗碱少许，加漂白粉（或次氯酸钠）少许，即显樱红色。

（2）取盐酸小檗碱少许，加稀硫酸2mL使溶解，加浓硝酸1～2滴，即显樱红色。

（3）取盐酸小檗碱约0.05g，溶于5mL热水中，加入10%NaOH溶液2mL，显橙色。

溶液放冷，加入丙酮约0.5mL，放置，有黄色丙酮小檗碱结晶析出。

（4）取盐酸小檗碱少许，加水2mL溶解后，加锌粉少许，再分数次加入浓硫酸数滴，振摇，每隔10min加一次，观察其黄色是否消退。

（5）薄层色谱鉴别吸附剂：硅胶H-CMC-Na板。

展开剂：苯－乙酸乙酯－异丙醇－甲醇－水（6:3:1.5:1.5:0.3），氨蒸气预平衡10min 后展开。

样品液：自制盐酸小檗碱甲醇液（每1mL含0.5mg）。

对照品液：盐酸小檗碱对照品甲醇液（每1mL含0.5mg）。

显色：置紫外灯（365nm）下检视，显黄色荧光斑点。

结果：记录样品斑点和对照品斑点的颜色和位置，计算Rf值。

【基本操作注意事项】1.实验原料尽可能选用小檗碱含量较高的川黄柏，或小檗碱含量较低的关黄柏，后者粘液质较多过滤麻烦。

2.加入氯化钠的目的是将小檗碱转化成盐酸小檗碱并利用其盐析作用，降低其在水中的溶解度。

其用量不宜过少，否则盐析效果不好，收率过低。

3.在精制盐酸小檗碱时，因为盐酸小檗碱几乎不溶于冷水，放冷易析出结晶，所以水浴加热溶解后，要趁热滤过，防止盐酸小檗碱在滤过时析出结晶，使滤过困难，产量降低。

【思考题】1.怎样从黄柏中提取分离盐酸小檗碱？原理是什么？为什么加石灰乳？2.通过从黄柏中提取盐酸小檗碱，试述药材粉碎度等对提取的影响。

3.用薄层色谱法检识盐酸小檗碱时，选用氧化铝或硅胶作吸附剂，二者有何区别？展开剂有何不同？实验二槐米中芦丁、槲皮素的提取、分离与鉴别【实验目的】1.掌握黄酮类化合物的提取原理和方法。

2.掌握黄酮类成分的主要理化性质及鉴别方法。

3.熟悉和了解采收与炮制对芦丁含量的影响。

【实验原理】1.槐花为豆科植物槐Sophora japonica L．的干燥花及花莆。

前者习称槐花Flos Sphorae；后者习称槐米Flos Sophorae Immaturus。

主产于河北、山东、河南、陕西、江苏、广东、广西、辽宁等地。

以河北、山东、河南产量大。

性能：苦，性微寒。

功效：凉血止血、清肝泻火。

应用：用于便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、衄血、肝热目赤、头痛眩晕等。

2.主要含有芦丁（芸香苷）、槲皮素，还含少量皂苷类及多糖、粘液质等。

近代研究表明槐米含芦丁可高达23.5%，槐花开放后降至13.0%。

芦丁可用于治疗毛细血管脆性引起的出血症，并用作高血压辅助治疗剂。

芦丁还可以作为制备槲皮素、羟乙基槲皮素、羟乙基芦丁、二乙胺基乙基芦丁等的原料。

3.芦丁为浅黄色粉末或极细微淡黄色针状结晶，含3分子结晶水（C27H30O16·3H2O），加热至185℃以上熔融并开始分解。

芦丁的溶解度，在冷水中1:10000，沸水中1:200，沸乙醇中1:60，沸甲醇中1:7，可溶于乙醇、吡啶、甲酰胺、甘油、丙酮、冰醋酸、乙酸乙酯中，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚。

芦丁分子中具有较多酚羟基，显弱酸性，易溶于碱液中，酸化后又可析出，因此可以用碱溶酸沉的方法提取芦丁。

【实验仪器与试剂】1.1000、500、100、10ml烧杯，10ml试管，试管架，托盘天平，量筒，三角漏斗，洗瓶，布氏漏斗，电炉，10×20cm薄层板，10×20cm薄层色谱缸，色谱专用滤纸，聚酰胺色谱膜，点样毛细管，紫外灯（仪），玻棒，牛骨匙，纱布，脱脂棉，显色剂喷瓶，小型空压机。

2.槐花米粗粉，滤纸，pH试纸，生石灰，硼砂，2%硫酸，浓硫酸，稀盐酸，浓盐酸，10%氢氧化钠，乙醇，10%α-萘酚乙醇溶液，镁粉，1%醋酸镁甲醇溶液，1%三氯化铝乙醇溶液，2%二氯氧锆甲醇溶液，2%枸橼酸甲醇溶液，Ba(OH)2，滑石粉，甲醇，氨水，芸香苷、槲皮素、葡萄糖、鼠李糖对照品，展开剂：正丁醇-乙酸-水（4:1:5）上层溶液（纸色谱），90%乙醇或乙醇-水（7:3）（聚酰胺色谱），显色：苯胺-邻苯二甲酸盐试剂。

【实验步骤】1.芸香苷的提取称取50g槐花米粗粉，于500mL烧杯中，加入0.4%硼砂沸水溶液300mL，在搅拌下小心加入石灰乳调至pH8～9，加热微沸30min，注意添加水，随时补充蒸发掉的水分保持原体积并维持pH8～9，趁热用脱脂棉过滤；药渣同样操作再提取一次，合并滤液，稍冷，用浓盐酸调至pH4～5，静置过夜使沉淀完全，抽滤，用蒸馏水洗3～4次，抽干置空气中自然干燥得淡黄色粗制芸香苷。

2.芸香苷的精制将芸香苷粗品置500mL烧杯中，加适量（约100mL）蒸馏水，再用石灰水调至pH8。

加热煮沸数分钟，使充分溶解。

趁热抽滤，滤液滴加3mol/LHCl调至pH7，放置18h以上，即析出沉淀。

减压过滤，用少量蒸馏水洗涤沉淀2～3次。

抽干，于70～80℃干燥1h，即得精制芦丁。

称重，计算产率。

3.芸香苷的水解取精制芦丁2g，研细，置于500mL圆底烧瓶中，加2%硫酸溶液150mL，于直火回流30min，放置至室温，析出黄色槲皮素结晶，抽滤，滤液保留作糖部分的鉴定。

沉淀水洗后再用95%乙醇重结晶一次，得黄色针状结晶，于70～80℃以下干燥，即得精制槲皮素。

4.检识（1）取芸香苷、槲皮素少许，分别用10mL乙醇溶解，制成试样溶液，照以下方法进行实验。

①Molish反应：取试样溶液各2mL，分置于两支试管中，加10%α-萘酚乙醇溶液1mL，振摇后倾斜试管45°，沿管壁滴加2mL浓硫酸，静置，观察两液面交界处颜色变化（棕色环）。

②盐酸-镁粉反应：取试样溶液各2mL，分别置于两支试管中，各加入镁粉少许，再加入浓盐酸数滴，观察并记录颜色变化。

③醋酸镁反应：取两张滤纸条，分别滴加试样溶液后，加1%醋酸镁甲醇溶液2滴，于紫外灯下观察荧光变化，并记录。

④三氯化铝反应：取两张滤纸条，分别滴加试样溶液后，加1%三氯化铝乙醇溶液2滴，于紫外灯下观察荧光变化，并记录。

⑤锆-枸橼酸反应：取试样溶液各2mL，分别置于两支试管中，各加2%二氯氧锆甲醇溶液3～4滴，观察颜色，然后加入2%枸橼酸甲醇溶液3～4滴，观察并记录颜色变化。

（2）糖的纸色谱鉴定取水解母液20mL，用Ba(OH)的细粉（约2.6g）中和至pH7，2沉淀（可用滑石粉助滤），滤液浓缩至约1mL，供纸色谱点样用。

滤去生成的BaSO4样品：水解浓缩液色谱滤纸：新华滤纸对照品：葡萄糖、鼠李糖水溶液展开剂：正丁醇-乙酸-水（4:1:5）上层溶液。

显色：苯胺-邻苯二甲酸盐试剂，喷后105℃烘10min，显棕红色斑点。

苯胺-邻苯二甲酸的配制：将1.66g苯二甲酸和0.93g的苯胺溶于100mL水饱和的正丁醇中。

（3）芦丁、槲皮素的纸色谱和聚酰胺薄层色谱鉴定样品：自制芦丁、槲皮素的乙醇液色谱材料：新华滤纸，聚酰胺薄膜对照品：芦丁、槲皮素的乙醇溶液展开剂：正丁醇-乙酸-水（4:1:5）上层溶液（纸色谱）。

90%乙醇或乙醇-水（7:3）（聚酰胺色谱）。

显色：①可见光下观察及紫外灯下观察。

②喷三氯化铝试剂后再观察。

【基本操作注意事项】1.加入石灰乳即可达到碱溶解提取芸香苷目的，又能使槐米中含存的大量粘液质生成钙盐沉淀除去，但应严格控制在pH8～9，不得超过10。

pH过高，在加热提取过程中可促使芸香苷水解破坏，造成产率明显下降。

酸沉时加浓硫酸调pH3～4，不宜过低，否则会使芸香苷生成盐溶于水，也会降低收率。

2.加入硼砂的目的是使其与芸香苷邻二酚羟基结合，这样既保护邻二酚羟基不被氧化破坏，亦保护邻二酚羟基不与钙离子络合，使芸香苷不受损失。