薄层鉴别(8.3)

点样量不同对分离的影响
4µl
6µl
8µl
0.1µl
0.2µl 0.3µl
1µl
• （三）.展开 • 1、展开容器 双槽展开缸，展开时须能密闭。 • 2、饱和 可在展开缸中加入适量的展开剂，密 闭，一般保持15~30分钟。溶剂蒸气预平衡后， 应迅速放入载有供试品的薄层板，立即密闭， 展开。必要时可在展开缸的壁上贴一用展开剂 润湿的滤纸条。 • 3、展开 将点好样品的薄层板放入展开缸的展 开剂中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜， 当溶剂前沿达到规定的展距，取出薄层板，晾 干，待检测。
五、薄层色谱耐用性实验 1、三种不同厂家生产的薄层板的影响 2、温度和湿度的影响 （1）常温、常湿条件下进行试验 （2）低温条件下进行试验 （3）高湿条件下进行试验
• 温度对层析行为的最明显的影响是分离 度和Rf值。经常遇到的一种情况是同样 的试验需要在夏天做，又须在冬天做， 或者在南方和北方的试验室重复试验， 这就遇到温度不同造成的影响，而使结 果不易重现。最基本的要求是在薄层色 谱记录中同时记录试验时的温度和相对 湿度。
可以依次用不同 极性的溶剂，如 石油醚→乙醚→ 三氯甲烷→乙酸 乙酯→正丁醇进 行提取，对供试 品进行分离、纯 化。
常用的吸Fra Baidu bibliotek剂有 大孔树脂、氧化 铝、硅胶、聚酰 胺等，根据供试 品的特点选择不 同的吸附剂。
对含有挥发 性成分的供 试品，可采 用华法。
对成分复杂的供试品，有时可同时采用2～3种净化方法对 供试品进行处理。
• （二）点样 • 薄层点样分为手工点样和点样器自动点 样。手工点样简单、快捷，但展开效果 与实验者的熟练程度有较大的关系；自 动点样斑点均匀、大小一致、展开后效 果较好，但仪器价格昂贵。
• • • •
手动点样工具 （1）注射器 （2）毛细管 （3）点样笔
• 一般为圆点状或窄细的条带状，点样基 线距底边10~15mm，直径一般不大于3 mm，条带状宽度一般为5~10mm。 • 点样量一般应控制在6ul以下，否则样品 斑点扩散，影响分离；样品量较低时， 点样量可最大增加至20ul。 • 当使用高沸点溶剂如正丁醇时，点样后 应将溶剂充分晾干，必要时可用电吹风 吹干。
五、处方中药材所含成分检索 与提取方案设计 1、试验方法应首选《中国药典》的方法； 其次应参考文献资料，确定预试方案；如 没有文献报道．应查询组方药材所含化学 成分，根据其特点，决定提取步骤。 2、应同时采用对照品和对照药材为对照 物。 3、选用对照药材是经济与合理的选择。 4、应结合提取工艺制定相应的提取方法。
六、实例-2白带丸
• 白芍—芍药苷 • 黄柏—盐酸小檗碱
六、实例-2白带丸
（2）取本品5g，研细，加乙醇10ml,冷 浸1 小时，时时振摇，滤过，滤液浓缩 至干，残渣加乙醇0.5ml 使溶解，作为 供试品溶液。另取芍药苷对照品-----
六、实例-2白带丸
（3）取本品粉末2g，研细，加甲醇5ml, 超声处理10分钟，滤过，滤液加甲醇至 5ml，作为供试品溶液。另取黄柏对照药 材0.1g，同法制成对照药材溶液。再取 盐酸小檗碱对照品-------
盐酸小檗碱 氨蒸气饱和
• （四）.显色与检视 • 1、显色装置 喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或 专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀 细雾状喷出，浸渍显色可用专用玻璃器械或用 适宜的展开缸代用。 • 2、常用显色剂 5%三氯化铝乙醇、10％硫酸 乙醇、5％三氯化铁乙醇、10％磷钼酸乙醇、 稀碘化铋钾试液，蒸气熏蒸等。 • 3、检视装置 为装有可见光、254nm及 365nm紫外光光源及相应的滤光片的暗箱。
六、实例-1艾附暖宫丸
• 白芍—芍药苷 • 黄芪—黄芪甲苷
•
（4）取本品9g，剪碎，加水5ml浸润，加 水饱和的正丁醇30ml，摇匀，超声处理 10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇 2ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药 苷对照品-------
六、实例-1艾附暖宫丸
（5）取本品9g，剪碎，加水5ml浸润， 加水饱和的正丁醇30ml，摇匀，超声处 理10分钟，滤过，滤液用氨试液洗 涤2 次，每次30ml，弃去氨液，正丁醇液蒸 干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品 溶液。另取黄芪甲苷对照品------
• （一）薄层板 • 1、市售薄层板 • 市售薄层板分普通薄层板和高效薄层板。临用 前一般应在110℃活化30分钟。聚酰胺薄膜不 需活化。铝基薄层板可根据需要剪裁，但须注 意剪裁后的薄层板底边的硅胶层不得有破损。 • 优点－使用方便；分离效果较好。 • 缺点－价格较贵；不同厂家生产的薄层板，对 某些成分有选择性。
三、 常用的供试品净化方法
我们常常希望样品中的成分尽可能 多的被提取出来，所以最常用的试剂是 甲醇或乙醇，导致被测成分和许多其他 “杂质”成分均被提取出来，因此供试 品的净化就更为必要。
净化方法
单一溶剂 提取法 不同极性 的溶剂分 步提取法 柱色 谱法 升华法
酸性、碱性有机 溶剂提取。如利 用生物碱类成分 在碱性条件呈游 离状态，用三氯 甲烷或乙醚将其 有选择的提取出 来而舍弃其他成 分，使供试品溶 液净化。
薄
层
色
谱
天津市药品检验所 周军
广泛适用性 • 薄层色谱最常用的是以硅胶板为基础固 定相的正相色谱，最适合中等极性成分 的展开； • 有多种组合的有机溶剂展开系统可供选 择；������ • 甲苯系统；氯仿系统、己烷系统、乙酸 乙酯类系统、正丁醇系统等。������ • 酸性、碱性、中性。������ • 高极性、中等极性、低极性
• （三）.含量测定 • 一般采用薄层色谱扫描仪，测定供试品 中相应成分的含量。 • 扫描方法可采用单波长扫描或双波长扫 描。薄层色谱扫描用于含量测定时，通 常采用线性回归二点法计算。供试品溶 液和对照品溶液应交叉点于同一薄层板 上，供试品点样不得少于2个，对照品每 一浓度不得少于2个。
• • • • • •
不同厂家生产的薄层板分离效果不同 青岛板 烟台板
• 2、自制薄层板 • 一般将1份固定相和3份水（或加有黏合剂的酸、 碱、盐水溶液）在研钵中按同一方向研磨混合， 去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板涂 布，取下涂好薄层的玻板，室温下晾干后，在 105～110℃烘箱中加热活化1～2小时，取出， 保存于干燥器中备用。 • 优点－价格便宜，使用方便，展开速度快，使 用于一般薄层鉴别试验。 • 缺点－因硅胶粒度较粗，分离效果不如预制板； 手工点样时，尤其点样量教大时，会损坏点样 部位的薄层表面；使用羧甲基纤维素钠为黏合 剂，当以硫酸乙醇为显色剂，加热时间稍长， 薄层板会变黑，无法检视。
六、实例-3青果丸
• 绿原酸 • 芍药苷 • 黄芩苷
六、实例-3青果丸
（2）取本品水蜜丸60丸，研碎；或取 大蜜丸1丸,煎碎。加甲醇40ml，超声处 理40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水 20ml使溶解，通过D<[101]>型大孔吸附 树脂柱（内径2cm,柱长15cm），用水 50ml洗脱，弃去水洗液，再用20％乙醇 50ml、40％乙醇40ml依次洗脱，分别收 集洗脱液，将20％乙醇洗脱液蒸干，残 渣加甲醇1ml 使溶解，作为供试品溶液。 另取绿原酸对照品-------
第二节中药薄层色谱鉴别中供试品溶液 制备的注意事项及方法
• 在检验中药真伪方面通常采用的检测手 段有形态鉴别、理化鉴别和光谱色谱分 析等。而薄层色谱由于其独具的长处而 被广泛应用于中药分析。
《中国药典》2005年版一部中的鉴 别方法主要为薄层鉴别，其中：
1个薄层鉴别----110个品种 2个薄层鉴别----182个品种 3个薄层鉴别----134个品种 4个薄层鉴别----49个品种
• （二）容量因子（k′） • 容量因子（k′）是衡量薄层板对待测组分 的保留能力的重要参数。k′大时，表示组 分被固定相保留的程度大，在薄层上移 动慢，反之则移动快。 • 1 • R= ————— • 1+ k′ • R的含义：1.溶质在流动相中的出现的几 率。2.组分分子在薄层板上的速度。
• （三）理论塔板数（N） • 理论塔板数（N）是反映组分在流动相和固定 相中动力学特性的技术参数，是代表分离效能 的指标。 • D 2 • N = 16〔————〕 • W • D为原点到组分斑点中心的距离（cm），W为 组分斑点宽度（cm）。在斑点移动距离相等的 情况下，斑点越集中，即W 宽度越小，理论塔 板数就越大 。
• 第一节 薄层色谱基础知识
薄层鉴别的特点： （1） 操作方法简便、快速。 （2）在采用随行对照品及对照药材的 情况下，结果容易判定。
一、薄层色谱的分类 （一）根据薄层色谱所用的吸附剂性质和 分离样品的机理分类 • 1.吸附薄层色谱 • 2.分配薄层色谱 • 3.离子交换薄层色谱 • 4.排阻薄层色谱
（四）分离度（R） • 分离度（R）是两个相邻斑点的分离程度， 以两个斑点中心距离之差与其平均斑点 宽度之比。 • R=2（d2-d1）/(W1+W2) • D为两个斑点中心间的距离，W为斑点宽 度。
三、 常规薄层色谱法 • （一） 薄层板 • （二） 点样 • （三） 展开 • （四） 显色与检视
应用领域
• • • • • 药品生产、检验 临床医学 环境监测 食品生产、检测 化学、化工
薄层色谱联用技术
• • • • 薄层色谱-质谱联用 薄层色谱-核磁共振联用 薄层色谱-红外联用 薄层色谱-液相、气相色谱联用
课程内容
• 薄层色谱基础知识 • 中药薄层色谱鉴别中供试品溶液制备的 注意事项及方法
• 同一薄层板在日光及紫外光灯下提供的信息 不同 • UV365nm 日光
• • • •
四. 薄层色谱在药物分析中的应用 （一）.鉴别 （二）.限度检查 （三）.含量测定
• （一）.鉴别 • 取适宜浓度的对照溶液与供试品溶液， 在同一薄层板上点样、展开与检视，供 试品溶液所显主斑点的颜色（或荧光） 和位置应与对照溶液的斑点一致。
（二）根据固定相分类 • 依据固定相的不同，可以分为常规薄 层色谱色谱法、高效薄层色谱色谱法 和反相键合相薄层色谱法。
• 二.薄层色谱的技术参数 • （一）比移值 • 比移值（Rf）系指溶质移动距离与流动 相移动距离的比值。 • • 从基线至展开斑点中心的距离 • Rf= —————————————— • 从基线至展开剂前沿的距离
5个薄层鉴别----7个品种
6个薄层鉴别----5个品种
一、 影响薄层色谱展开效果的主要因素
供试品溶液制备 点样 薄层板 展开剂 温度 湿度 显色
二、 对供试品溶液制备进行分析和讨论
由于中药成分的复杂，未知成分多， 供试品溶液中含有的物质较多，其中有被 测定成分，同时也有其他“杂质”成分， 因此常常由于相互干扰或背景污染而难以 得到满意的分离效果，有时甚至难以辨认， 对复方制剂尤其如此。所以为了充分发挥 薄层色谱技术在中药分析方面的优势，提 高色谱的分离度和重现性，供试品溶液的 制备（净化），是一个非常重要甚至是关 键的步骤。
四、复杂成分供试品净化的注意事项
1. 采用没有毒性或毒性较小的试剂作为提取溶剂 和展开剂，减少对试验人员和环境的污染。 2. 专属、科学、经济的原则。 3. 利用各种被测成分的理化性质不同，采用不同 的提取方法。 4. 对多个中药材逐一进行薄层鉴别时，某个薄层 的供试品溶液中除含有被测定成分，同时也有 大量其他“杂质”成分。但这些“杂质”成分 常常同时又是其他薄层中的被测定成分。 5. 制定质量标准时应对列为薄层鉴别目标的各味 药材进行整体分析，根据各个药材中的特征性 成分的理化性质、含量高低，决定提取的方法、 步骤。
丹参化学成分
成分检索与方案设计
方案设计
试验预试
按组方所含药 材成分，查询 文献或根据经 验，拟定初试 方法。
按实验设计方案进行试验，观察、记 录，并初步判定薄层鉴别方法的可行 性。在复方制剂研究预试验中，在同 一种展开系统中应将对照品、对照药 材都点在同一块薄层板上。观察试验 结果，为进一步试验提供更多的薄层 色谱信息。
• （二）.限度检查 • 1、采用定量配制的对照品或稀释对照品进行 对照。 • 供试品溶液色谱中待检查的斑点应与相应的对 照品溶液或 系列对照品溶液的相应斑点比较， 颜色（或荧光）不得更深。 • 2、检测灵敏度 • 用于限量检查时，采用供试品溶液和对照品溶 液与稀释若干倍的对照品溶液在规定的色谱条 件下，于同一薄层板上点样、展开、检视，后 者应显清晰的斑点。