实验四 血涂片的制备与染色

实验四血涂片的制备与染色

【目的】掌握血涂片的制备和染色方法（preparation and staining of thin blood films）。

【原理】将一小滴血液均匀涂在玻片上，呈单层紧密分布，制成薄血片。用含天青B和伊红的Romannowsky类染料进行染色。细胞中的碱性物质如RBC中的血红蛋白及嗜酸性粒细胞胞质中的嗜酸性颗粒等与酸性染料伊红结合染成红色；细胞中的酸性物质如淋巴细胞胞质及嗜碱性粒细胞质中的嗜碱性颗粒等与碱性染料亚甲蓝结合染成蓝色；中性粒细胞的中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染成淡紫红色。

【器材】

1．载玻片使用前，必须仔细清洗，并用乙醇或软布清洁。

2．推片选择边缘光滑的载玻片，在两角分别作斜线标记，然后用玻璃切割刀裁去两角，制成约15mm 宽度的推片。

3．吸耳球。

4．显微镜。

5．酒精灯或Bunsen灯。

6．采血针。

7．注射器和针头。

【试剂】

1．瑞氏（Wright）染液

（1）Ⅰ液：包含瑞氏染料1.0g、纯甲醇（AR级以上)600ml、甘油15ml。将全部染料放入清洁干燥的乳钵中，先加少量甲醇慢慢地研磨（至少30min），以使染料充分溶解，再加一些甲醇混匀，然后将溶解的部分倒入洁净的棕色瓶内，乳钵内剩余的未溶解的染料，再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止。再加15ml甘油密闭保存。

（2）Ⅱ液：磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8），包含磷酸二氢钾（KH2PO4）0.3g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）0.2g、蒸馏水加至1000ml。配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口贮存。如无缓冲液可用新鲜蒸馏水代替。

2．吉姆萨染液包含吉姆萨染料0.75g、甘油35ml、甲醇65ml。将吉姆萨染料、甘油和甲醇放入含玻璃珠的容器内，每天混匀3次，连续4天，最后过滤备用。

3．瑞-吉复合染液

（1）I液：包含瑞氏染料1g、吉姆萨染料0.3g、甲醇500ml、中性甘油10ml。将瑞氏染料和吉姆萨染料置洁净研钵中，加少量甲醇，研磨片刻，再吸出上液。如此连续几次，共用甲醇500ml。收集于棕色玻璃瓶中，每天早、晚各摇3min，共5d，以后存放1周即能使用。

（2）Ⅱ液：即磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8）。包含无水磷酸二氢钾6.64g、无水磷酸氢二钠2.56g，加少量蒸馏水溶解，用磷酸盐调整pH，加水至1000ml。

【标本】 EDTA抗凝静脉血或末梢血。

【操作】

1．采血

（1）静脉采血法：用EDTA·K2抗凝1～2h内的标本，使用玻棒、毛细管、注射针头等在距载玻片一端1cm处加1滴抗凝血，直径约4mm。

（2）皮肤采血法：选择第三、四手指，并先采红细胞、白细胞计数，再采血1滴置洁净玻片上用于血涂片制备。

2．制作涂片左手平执载玻片，或放在类似桌子等平坦地方，右手持推片从后方移动接近血滴，使血液沿推片边缘展开，将推片与载玻片呈30°～45°角，用均匀速度向前将血液推成厚薄适宜的血涂片（图1-12），血涂片应呈舌状，头、体、尾三部分，且清晰可见。所有血液必须在推片到达末端前用完。贫血病人推片速度要快。

图1-12 血涂片制备示意图

3．干燥涂片

（1）空气干燥：将推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。

（2）加热干燥：握住涂片，在距离酒精灯或Bunsen灯火焰上方50mm处晃动，但不能直接对着火焰。

4．标记涂片在载玻片的一端用记号笔编号，注明患者姓名或门诊/住院号。

5．染色

（1）瑞氏染色法：待血涂片干透后，用蜡笔在两端画线，以防染色时染液外溢。然后将玻片平置于染色架上，滴加染液（I液）3～5滴，使其迅速盖满血涂片，约0.5～1min后，滴加等量或稍多的缓冲液（Ⅱ液），轻轻摇动玻片或用吸球对准血涂片吹气，使染液充分混合。5～10min后用流水冲去染液，待干。

（2）吉姆萨染色法：将固定的血涂片置于被pH6.4～6.8磷酸盐缓冲液稀释10～20倍的吉姆萨染液中，浸染10～30min（标本较少可用滴染）。取出用流水冲洗，待干燥后显微镜检查。

（3）瑞一吉复合染色法：操作步骤同瑞氏染色法，只是染色时将瑞一吉复合染液Ⅰ液和Ⅱ液替代瑞氏染液的Ⅰ液和Ⅱ液。

6．观察结果将干燥后的血涂片置显微镜下观察。用低倍镜观察血涂片体、尾交界处的血细胞。在显微镜下，成熟红细胞染成粉红色；血小板染成紫色；中性粒细胞胞质染成粉红色，含紫红色颗粒；嗜酸性粒细胞含大的桔黄色颗粒；嗜碱性粒细胞胞质含有大量深紫蓝色颗粒；单核细胞胞质染成灰蓝色；淋巴细胞胞质染成淡蓝色。

【注意事项】

1．瑞氏染液新鲜配制的染液偏碱，染色效果较差，经在室温下贮存一定时间，美蓝逐渐转变为天青B后方可使用，这一过程称染料成熟。放置时间愈久，天青B愈多，染色效果愈好，但必须盖严瓶口，以免甲醇挥发或氧化成甲酸。甲醇必须用AR（无丙酮）。染液中也可加中性甘油3ml，防止甲醇挥发，使细胞染色较清晰。

2．采血

（1）不能采集以下部位的血液：①示指或拇指血液。②感染部位血液，如甲沟炎。③耳垂部位血液，含单核细胞太多。

（2）不能使用肝素抗凝标本。

（3）玻片必须清洁、干燥、无尘。①新玻片：应在清洁液中浸泡过夜，然后用水冲洗，最后用蒸馏水冲洗。②已用过的玻片：应在60℃清洁液中加热20min，然后用水冲洗，最后用蒸馏水冲洗。③边缘破碎、表面有划痕的玻片不能再用。

（4）使用玻片时，只能手持玻片边缘，切勿触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。

3．制作涂片许多因素可影响血涂片的厚度，针对不同患者应有的放矢，对血细胞比容高、血粘度高的患者应采用小血滴、小角度、慢推；而贫血患者则应采用大血滴、大角度、快推。涂片质量不佳及可能原因见表1-1，图1-13。

表1-1 涂片质量不佳及可能原因

涂片质量不佳可能原因