2酶学基础

几个溶菌酶的一级结构
几个溶菌酶的三级结构
Human
Chicken
Phage
全酶和酶的活性中心
在酶分子上，不是全部氨基酸， 而只是少数氨基酸残基与酶的 活性有直接关系的。这些相关 的氨基酸，一般较集中在酶分 子的一个特定区域，这个区域 即 为 酶 的 活 性 中 心 （ Active center）。 例如，溶菌酶作用的底物，是 细菌细胞壁多糖，但酶分子与 其接触的部位，只有10个左右 的氨基酸残基。就体积而言， 活性中心仅占酶分子的1－2％。 活性中心面积也不到酶分子的 5％。
酶的空间结构研究方法
（1）X－射线衍射法 （2）核磁共振法
（3）电镜三维重构
（4）蛋白质的结构预测
首个获得三维结构的酶溶菌酶 1966, David Chilton Phillips
X－射线衍射法和核磁共振法
一级结构决定蛋白质的空间结构
实验证据：在8mol/L尿素存在 下，用巯基乙醇处理天然RNase, 其二硫键全部断裂，肽链松散， 活性全部丧失，但当用透析法 除去尿素、巯基乙醇后，RNase 活力全部恢复，而且复原后产 物其理化性质与天然RNase完全 相同；然而在随机情况下，8个 HS—形成4个—S—S时，应有 105种不同方式，但在复原过程 中，RNase肽链却只选择了其中 一种方式（即与天然构象完全 相同），这说明RNase的一级结 构决定了其特定的天然构象。
活性中心的氨基酸残基（或基团）
活性中心的氨基酸残基，在结构上都具有一些特殊的侧链基 团。如Cys的-SH基、Ser的-OH基、His的咪唑基等。 作为结构残基，如两个疏基之间形成-S-S-键，用以维持酶分 子特定构象。 亲核催化：如3-磷酸甘油醛脱氢酶活性中心的-SH对底物的 醛基进行的亲核攻击作用。 结合底物：疏基酶与底物结合有两种方式，较普遍的方式是 酶的-SH与金属离子相联，再通过金属离子与底物结合，如细 胞色素氧化酶通过Cu2+ 作用，亮氨酸氨肽酶通过Mn2+ 作用。 另一种方式是形成共价中间复合物，即以硫脂键形成酰化酶。 结 合 辅 基 ； 细 胞 色 素 c 中 ， 血 红 素 与 酶 蛋 白 中 Cys14 、 Cys12的-SH形成硫醚键而结合。
半胱氨酸蛋白酶
活性位点包括1个半胱氨 酸残基（Cys25）和 1个组氨酸残基（His159）
木瓜蛋白酶 Papain
天冬氨酸蛋白酶
活性位点包括两个天冬氨酸残 基（ASP32和ASP215）
胃蛋白酶 （pepsin）
金属蛋白酶
活性位点包括1个锌离子作 为路易斯酸起作用，1个谷 氨酸残基（Glu270）作为 碱起作用。
催化基团和结合基团并不是各自独立的，而是相互联系的整 体。催化效率的高低很大程度上取决于底物结合的位置是否 合适，只有结合基团正确地结合底物。提供催化基团发挥作 用的最优构象，才能有效发挥催化作用。也就是说，构成底 物结合位点的氨基酸残基的空间构象，必须既适合于结合底 物，也适合催化底物的反应。 除了活性中心的催化基团和结合基团之外，一些结构基团对 维持酶分子的完整和特定的构象起重要作用，也是酶的必需 基团。
酶活性部位的研究方法
1.化学修饰法 2.动力学分析法 3. X-射线晶体衍射法 4.定点突变
化学修饰法
非特异性共价修饰 1.某些酶活性中心含有的活性基团在活 性中心以外不存在或很少，这时可选择某些非特异性试剂 进行修饰。如木瓜蛋白酶有7个半胱氨酸残基，其中6个形 成三对-S-S-键，另一个游离的-SH存在于活性部位，因此 可采用巯基试剂如碘乙酸与之反应，使酶失活。 2. 若某一基团在活性部位存在时表现的活性比在其他部位 时高，可采用此修饰方法。如胰凝乳蛋白酶，共有28个丝 氨酸残基，但若用适量的二异丙基氟磷酸（DIFP）进行修 饰时，只有Ser195被修饰，而其他丝氨酸则无反应。
差示标记
在底物或抑制剂存在下进行化学修饰时，由于它们保护着 蛋白质的活性部位基团，使这些基团不能与试剂作用。然 后将过量的底物或抑制剂除去，所得到的部分修饰的蛋白 质再与含同位素标记的同样试剂作用，结果只有原来被底 物或抑制剂保护的基团是带放射性同位素标记的。用这一 方法可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。
X-射线晶体衍射法
X-射线晶体衍射法可以对酶的结构提供丰富且细致的信息， 一般可以通过： （1）低温条件下酶和底物复合物 （2）双底物反应只加一种底物或只加辅助因子 （3）酶和底物类似物或抑制剂的复合物 获得酶复合物结构，从而能了解活性部位的氨基酸残基的相 对位置与实际状态。
丝氨酸蛋白酶
胰凝乳蛋白酶 (chymotrypsin)
酶的活性部位模型假说
锁钥模型假说
锁钥模型假说提出了结合部 位概念。结合部位与底物 之间存在互补的特点，就 像锁和钥匙的关系，因而 造成酶催化反应的很强的 专一性。结合部位是酶的 活性中心的组成部分。
活性中心包括催化基团（部位）和底物结合 基团（部位） 。
酶的催化基团
酶 氨基酸 残基数 催化基团及其鉴定方法 His12（碘乙酸） His119（碘乙酸） Glu35（X－射线衍射） Asp52（X－射线衍射）
凝乳蛋白酶
牛胰核糖 核酸酶
124
溶菌酶 129 （鸡卵清）
核糖核酸酶
牛凝乳蛋 白酶A
牛胰蛋白 酶 羧肽酶
O CH2 CH C CHCl NH SO2 N O H2 C CH2 CH C CH2 N N H2 C
+
HN
E
NH SO2
E
CH3 CH3
T P CK
具有不同反应基团的亲和标记试剂
具有不同反应基团的亲和标记试剂
动力学分析法
酶蛋白是含有许多解离基团的两性电解质，pH 改变必然影响到解离基团的解离状态，处于活 性中心基团的解离状态的改变必然影响到酶的 活性。因此，通过研究酶活性与pH关系，可以 推测到与催化直接相关的某些基团的pK值，进 而推测这些基团的作用。
245 238 307
His57（L－苯甲磺酰苯丙氨酰氯 甲酮）Ser195（二异丙基氟磷酸）
His46（L－苯甲磺酰赖氨酰氯甲 酮）Ser193（二异丙基氟磷酸） Glu270（X－射线衍射） Tyr248（X－射线衍射）
溶菌酶
酶的底物结合基团
底物结合基团是指酶活性中 心直接与其底物结合的残基基 团，大多是非极性基团。底物 结合基团的存在是酶分子正确 识别专一性底物的基础，因为 只有与酶活性中心结构（包括 大小、形状、电荷等）相适应 的底物才能与酶结合。底物结 合基团可能不只一个，如羧肽 酶A在催化多肽C－端肽链水 解时，酶活性中心中的 Tyr248 、 Arg145 、 Glu270 及 Zn2+等基团能识别底物并与之 结合
活性中心的特点
1. 活性部位只占酶分子中很小的部分 2. 活性部位为三维实体。活性部位氨基 酸残基在一级结构上可能相距甚远， 甚至不在一条肽链上，但在空间结构 上相互靠近。因此空间结构破坏酶即 失活。活性中心以外部分可为酶活性 中心提供三维结构。 3. 酶与底物的结构互补是指在酶和底物 结合过程中，相互构象发生一定变化 后才互补。 4. 活性中心位于酶分子表面的一个裂缝 内。裂缝中为一个疏水微环境，也含 有某些极性氨基酸残基有利于催化， 底物在此裂缝内有效浓度很高。 5. 酶与底物结合形成ES复合物主要靠次 级键：氢键、盐键、范德华力和疏水 相互作用。 6. 酶活性部位具有柔性和可运动性。
F. Sanger Insulin 胰岛素 (A21, B30 chains)
1958
二硝基氟苯（DNFB）法
R O2N F NO2 DNFB H
+ + H2N
ห้องสมุดไป่ตู้
O O2N HN NO2 DNP衍生物 O OH + 氨基酸
R
O
CH C
CH C
N-端氨基酸 R HN NO2 DNP-氨基酸
H2O
O2N
CH C
1970年，Edelman为了描述免疫球蛋白(IgG)分子 的构象，提出了结构域的概念。 结构域: 较大蛋白的三级结构往往由几个相对独 立的三维实体构成，这些三维实体称为结构域。
酶的一级结构
构成酶蛋白的20种基本氨基酸的种类、数目和排列顺序， 是酶蛋白的一级结构。组成酶蛋白的氨基酸的数目和种类 与其催化的反应性质及酶的来源有关。例如，猪胃蛋白酶， 在酸性很强的胃液中起催化作用，其分子中酸性氨基酸的 数目远大于碱性氨基酸（43：4），这是与其催化的环境 相适应的。 来源不同的功能相似的酶，氨基酸组成相近。但并不相同。 存在生物种间的差异，甚至存在个体、器官、组织间的差 异。例如，植物溶菌酶与动物溶菌酶相比，其分子中脯氨 酸、酪氨酸和苯丙氨酸含量非常高。狒狒乳汁溶菌酶与人 溶菌酶的一级结构之间，有几个氨基酸残基不同，狒狒溶 菌酶含精氨酸少，且不含蛋氨酸。
活性中心的氨基酸残基（或基团）
7种氨基酸残基出现在活性中心的频率最高，它们是Ser、His、 Cys、Tyr、Asp、Glu和Lys，其次是Arg、Asn、Gln。这些残 基一般是带有极性侧链基团。
酶 a-胰凝乳蛋白酶 胰蛋白酶 组织蛋白酶B 反丁烯二酸酶 乳酸脱氢酶 葡糖－6－磷酸脱氢酶 L－苹果酸脱氢酶 鸡卵清溶菌酶 核糖核酸酶 活性中心的氨基酸残基 Ser195、His57、Ile16、Asp194、 Asp102 Ser183、His46、Asp90 Cys29、His197 Met、His Asp30、Asp53、Lys58、Tyr85、 Arg101、Glu140、Arg171、His195、 Lys250 Lys、His、Tyr（2个） Tyr（至少1个） Asp101、Trp62、Glu35、Asp52 His12、His119、Lys41、Asp121
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