单克隆抗体的制备技术和纯化及鉴定
相思子毒素单克隆抗体的制备纯化及鉴定
相思子毒素单克隆抗体的制备纯化及鉴定张立营;赵怀龙;马凤龙;傅兴伦;孙英姿;高波【摘要】目的制备相思子毒素单克隆抗体并鉴定其特性.方法以甲醛处理的相思子毒素毒蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠;取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA法筛选、融合细胞有限稀释法克隆、克隆化杂交瘤细胞株的亚类鉴定等方法筛选出单克隆抗体杂交瘤细胞株,用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行单抗的纯化,并对单克隆抗体的特异性进行鉴定.结果获得了4株可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞2D3、4E6、1C8和1E5,诱生的腹水效价分别为1∶1×107、1∶1×106、1∶1×105、1∶1×106,亚类鉴定表明2D3为IgG1,其余3株均为IgG2b;特异性鉴定显示它们与多种毒素均无交叉反应,经过亲和层析,获得了纯化的单抗.结论获得了特异性的相思子毒素单克隆抗体,为建立相思子毒索的检测及纯化方法奠定了基础,其中4E6的效价最高,可作为检测相思子毒素的核心试剂.【期刊名称】《实用医药杂志》【年(卷),期】2010(027)009【总页数】3页(P828-829,832)【关键词】相思子毒素;单克隆抗体;制备【作者】张立营;赵怀龙;马凤龙;傅兴伦;孙英姿;高波【作者单位】266071,山东青岛,济南军区青岛第二疗养院检验科;250014,山东济南,济南军区联勤部疾病预防控制中心;250014,山东济南,济南军区联勤部疾病预防控制中心;250014,山东济南,济南军区联勤部疾病预防控制中心;266071,山东青岛,济南军区青岛第二疗养院检验科;266071,山东青岛,济南军区青岛第二疗养院检验科【正文语种】中文【中图分类】R392.11相思子毒素是从豆科藤本植物相思子（Abrus precatorius）的种子中提取的一种剧毒性高分子蛋白毒素，其含量约占种子2.8%～3.0%。
单克隆抗体制备
单克隆抗体制备1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。
3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。
每次免疫使用50-100µg免疫原。
4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/8的免疫原。
接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。
5. 第0星期预采血完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。
第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第3星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第4星期溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第5星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第X星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。
用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。
ELI SA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。
7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。
用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。
8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。
亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。
因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理一、引言单克隆抗体（Monoclonal Antibody，mAb）是由单一B细胞克隆产生的抗体，具有高度特异性和亲和力。
其制备方法主要有杂交瘤技术、酶联免疫吸附试验法（ELISA）、荧光激发技术等。
其中，杂交瘤技术是制备单克隆抗体最重要的方法之一。
二、杂交瘤技术基本原理1. B细胞与肿瘤细胞的融合杂交瘤技术的基本原理是将体内产生的特异性抗体B细胞与无限增殖能力的肿瘤细胞进行融合，形成可分泌大量同种特异性抗体的杂交瘤细胞。
在此过程中，B细胞提供了高度特异性的抗体基因组，而肿瘤细胞提供了无限增殖能力。
2. 杂交瘤细胞筛选和分离将获得的杂交瘤细胞进行筛选和分离，以获取单一同种特异性抗体产生的杂交瘤细胞株。
这里需要注意的是，筛选和分离的条件需要严格控制，以确保所得到的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力。
3. 单克隆抗体的大规模制备通过对单克隆抗体杂交瘤细胞株进行培养和扩增，可以大规模制备单克隆抗体。
此过程中需要注意对培养条件、生长因子、营养物质等进行优化，以提高单克隆抗体的产量和质量。
三、杂交瘤技术的优点1. 高度特异性和亲和力通过杂交瘤技术制备的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，可以用于检测、诊断、治疗等领域。
2. 无限复制能力杂交瘤细胞具有无限复制能力，可以大规模制备同种特异性抗体。
3. 可重复性好由于单一B细胞产生的同种特异性抗体都是完全相同的，因此通过杂交瘤技术制备出来的单克隆抗体具有良好的可重复性。
四、杂交瘤技术存在的问题及解决方法1. 杂交瘤细胞的稳定性杂交瘤细胞的稳定性对于单克隆抗体的制备至关重要。
为了提高杂交瘤细胞的稳定性，可以采用多种方法，如对培养条件进行优化、添加生长因子等。
2. 克隆选择在杂交瘤技术中，克隆选择是一个非常重要的环节。
为了确保所得到的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，需要对杂交瘤细胞进行筛选和分离。
这里需要注意的是，筛选和分离的条件需要严格控制。
单克隆抗体
单克隆抗体生物技术制药之单克隆抗体【摘要】杂交瘤技术使鼠源单克隆抗体被广泛用于人类疾病的诊断和研究，建立了治疗性抗体的第一个里程碑。
随着生物学技术的发展和抗体基因结构的阐明，应用ＤＮＡ重组技术和抗体库技术对鼠单抗进行人源化改造，先后出现了嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体，它们从不同角度克服了鼠单抗临床应用的不足，使抗体制备技术进入了一个全新的时代。
【关键词】单克隆抗体、分类、制备、纯化、应用【前言】1975年Koehler和Milstein创立了体外杂交瘤技术(Koehler等,1975)，得到了鼠源性单克隆抗体，开始了多克隆抗体走向单克隆抗体的新时代。
与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有无可比拟的优越性，它具有特异性高、效价高、纯度高、理化性状均一、重复性强、成本低并可大量生产等优点。
鼠源性单抗应用于人类有较强的免疫原性，但主要缺陷是诱发人抗鼠抗体（human anti－mouse antibody，HAMA）反应，其次是鼠单抗不能有效地激活人体的生物效应功能，因此限制了其临床应用(Dhar等，2004)。
减少或避免HAMA反应并提高疗效的主要途径是鼠源性单抗人源化，随着对各类抗体结构和氨基酸序列及其变异的种属和功能之间关系的深入了解，而能够利用抗体工程技术对抗体结构进行改造。
抗体的应用经历了非人源抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体，最终到制备全人源单抗的转基因小鼠和噬菌体展示文库等不同的阶段。
1、单克隆抗体定义抗体主要是由B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。
动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。
当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞，被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。
如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂制增殖而形成细胞群，即单克隆。
生物制药技术中的抗体工程技术介绍
生物制药技术中的抗体工程技术介绍抗体工程技术在生物制药领域扮演了重要的角色，它通过改造和利用抗体的特性，为治疗疾病提供了新的途径。
在本文中，我将介绍抗体工程技术在生物制药技术中的应用和相关的进展。
抗体是由机体的免疫系统产生的一类蛋白质，可以识别和结合特定的抗原。
因其高度特异性和亲和性，抗体成为治疗疾病的理想候选药物。
然而，天然抗体存在一些局限性，比如生产成本高、不稳定性和免疫原性等。
为了克服这些问题，科学家们开发了抗体工程技术，通过改造抗体的结构和功能，提高治疗效果和降低副作用。
一种常见的抗体工程技术是单克隆抗体制备技术。
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的抗体，对特定抗原具有高度特异性。
传统的获取单克隆抗体的方法是从小鼠等动物的脾脏或骨髓中提取B细胞，再经过杂交瘤技术获得。
然而，这种方法存在一定的局限性，比如生产周期长、免疫原性问题等。
近年来，通过重组DNA技术，科学家们可以制备人源化的单克隆抗体，从而避免了相关问题，并提高了制备效率。
另一种抗体工程技术是通过改造抗体的结构来增强其稳定性和活性。
例如，人工合成的Fc区域可以提高抗体的半衰期和结合能力，从而增强了其治疗效果。
此外，通过改变抗体分子的结构，可以实现对抗体的亲和性、特异性和生物活性进行精确调控，进一步提高其治疗效果和选择性。
抗体工程技术还可以用于制备具有特定功能的抗体。
例如，单克隆抗体可以通过融合其他功能蛋白或药物分子，产生具有双重或多重功能的抗体。
这种方法被广泛应用于抗肿瘤药物的研发，通过将细胞毒性物质连接到抗体分子上，实现对肿瘤细胞的靶向杀伤。
此外，抗体工程技术在免疫诊断和分子影像等领域也发挥着重要作用。
通过使用与特定抗原结合的抗体或改造的抗体，在体外或体内实现对疾病标记物的检测和定量。
同时，可以通过标记放射性同位素或荧光物质等标记物，将抗体用于其它生物学研究和医学应用。
需要注意的是，抗体工程技术的应用仍然面临一些挑战和限制。
首先，抗体的规模化生产和纯化仍然是一个技术难题，造成了制备成本高昂。
H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体的制备及鉴定
（Ａ 、 Ｅ Ｖ）马传 染性 贫血病毒 （ Ｉｖ）马 日本 脑 炎病毒 （Ｅ 发 生交叉反应 。研 究为 建立单克 隆抗 体介 导的检 测 ＥＡ 、 Ｊ Ｖ）
马流 感病毒抗 原和抗 体的血清 学方法 以及 为 实现 马流 感标 准化诊 断奠定基础 。 关键 词 ： Ｎ８亚型 马流 感病 毒 ； Ｈ３ 单克 隆抗 体 ； 血凝 素 ； 特性 鉴 定
［３ 方法 建立 间接 Ｅ ＩＡ， 酶 标 板 上 进 行 方 阵滴 上 。用含 １ｇ Ｌ牛血清 白蛋 白的 Ｐ Ｓ在 ４℃条 件下 １］ ＬＳ 在 ／ Ｂ
定 ， 定检 测抗原 全病 毒 的最佳 包 被浓 度 及 阳性 、 确 阴
性对 照血 清 的最 佳稀 释浓 度 。 １ ２ ２ ３ 血 凝 抑制 试 验 检测 方 法 的 建立 小 鼠血 ．． ． 清前 处理 方法 ： Ｐ Ｓ将 血 清做 １： 用 Ｂ ５倍 稀 释 ， 入 加
中 图 分 类 号 ：８ ２ ６ ２ ￥ ５ ． ５ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：ｏ ７５ ３ （Ｏ １Ｏ —０ １Ｏ ｌ ０—Ｏ ８ ２ ｌ ）６０Ｏ 一４
马 流行 性 感 冒 （ ｑ ｉｅｉｆ ｅ ｚ ， Ｉ 是 由正 黏 Ｅ ｕｎ ｌ ｎａ Ｅ ） ｎｕ
病毒 快 速简 便 的检测 方法 奠定 基础 。
病毒 科 流感 病 毒 属 马 Ａ 型 流 感 病 毒 （ ｑ ｉｅｉｆ — １ 材 料 与 方 法 Ｅ ｕｎ ｎｌ ｕ ｅ ｚ ｉ ｓ Ｅ Ｖ） ｎ ａｖｒ ， Ｉ 引起 马属 动 物 的一种 急性 暴 发 性 流 １ １ 材 料 ｕ ． 行 的传 染 病 ， 马 属 动物 中极 易 传 播 ［ 。世 界 动物 在 １ ］ 卫生 组 织 （ Ｅ） 其 列 为 法 定 报 告 动 物 疫 病 ［ ， ＯＩ 将 ２ 我 ］ 国将 其 列 为三类 动 物疫 病 。 Ｈ３ Ｎ８亚 型 马 流感 病 毒 于 １６ ９ ３年 在美 国迈 阿密 马群 中首次 分 离 到［ ， ３ 此后 ］ 在 多个 国家暴发 和流 行 。２ ０ ０ ７年 ， 大 利 亚 、 澳 日本 、 马 流感 病 毒 Ａ／ ｑ ｉｅＪｌ ／ ／ ９ ９ Ｈ３ ） Ｅ ｕｎ ／ｉｎ １ １ ８ （ Ｎ８ 为 ｉ １８ ９ ９年吉 林 分离株 ， 马流感 病毒 Ａ／ ｑ ｉｅＢ ｉｎ ／ Ｅ ｕｎ ／ ｅ ｉｇ ｊ １ １ ７ （ Ｎ７ 由吉 林 出入 境 检 验 检 疫局 技 术 中心 ／ ９ ４ Ｈ７ ） 生物 室保 存 ， 动 脉 炎 病 毒 （ ＡＶ） 马传 染 性 贫 血 马 Ｅ 、
单克隆抗体的制备及应用
单克隆抗体的制备及应用单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。
单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。
是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。
1 单克隆抗体的优点与局限性：1.1 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久〞地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。
(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。
(3)由于可能得到“无限量〞的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。
(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。
总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、本钱低和可大量生产等。
1.2 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。
由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反响，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。
(2)单克隆抗体的反响强度不如多克隆抗体。
(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。
2 单克隆抗体的制备：单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。
这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。
单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。
单克隆抗体制备的基本原理与过程？有什么意义？
单克隆抗体制备的基本原理与过程？有什么意义？哈哈~我们刚考到这题原理：B淋巴细胞在抗原的刺激下,能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力.B细胞的这种能力和量是有限的,不可能持续分化增殖下去,因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的.将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞,再进一步克隆化,这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力,又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力,将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体.这种技术即称为单克隆抗体技术.1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c 小鼠.免疫的方法取决于所用抗原的性质.免疫方法同一般血清的制备,也可采用脾内直接免疫法.2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前,骨髓瘤细胞应经过含8-AG 的培养基筛选,防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）.骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养,融合前24h换液一次,使骨髓瘤细胞处于对数生长期.3）细胞融合的关键:1技术上的误差常常导致融合的失败.例如,供者淋巴细胞没有查到免疫应答.这必然要失败的.2融合试验最大的失败原因是污染,融合成功的关键是提供一个干净的环境,以及适宜的无菌操作技术.4）阳性克隆的筛选应尽早进行.通常在融合后10天作第一次检测,过早容易出现假阳性.检测方法应灵敏、准确、而且简便快速.具体应用的方法应根据抗原的性质,以及所需单克隆抗体的功能进行选择.常用的方法有 RIA法、 ELISA法和免疫荧光法等.其中ELISA法最简便,RIA法最准确.阳性克隆的筛选应进行多次,均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增.5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体.克隆化应尽早进行并反复筛选.这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的,有丢失染色体的倾向.反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株.克隆化的方法很多,而最常用的是有限稀释法.（1）显微操作法：在显微镜下取单细胞,然后进行单细胞培养.这种方法操作复杂,效率低,故不常用.（2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后,按每孔1个细胞接种在培养皿中,细胞增值后成为单克隆细胞系.第一次克隆化时加一定量的饲养细胞.由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化,所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成.应该注意的是,每次克隆化过程中所有有意义的细胞都应冷冻保存,以便重复检查,避免丢失有意义的细胞.（3）软琼脂法：将杂交瘤细胞稀释到一定密度,然后与琼脂混悬.在琼脂中的细胞不能自由移动,彼此互不相混,从而达到单细胞培养的目的.但此法不如有限稀释法好.（4）荧光激光细胞分类法：用抗原包被的荧光乳胶微球标记杂交瘤细胞,然后根据抗原与杂交瘤细胞结合的特异性选出细胞,并进行单细胞培养.6）细胞的冻存与复苏7）大规模单克隆抗体的制备选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备,因为融合细胞随培养时间延长,发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加.抗体制备有两种方法.一是增量培养法,即将杂交瘤细胞在体外培养,在培养液中分离单克隆抗体.该法需用特殊的仪器设备,一般应用无血清培养基,以利于单克隆抗体的浓缩和纯化.最普遍采用的是小鼠腹腔接种法.选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠,先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射,一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去.通常在接种一周后即有明显的腹水产生,每只小鼠可收集5～10ml的腹水,有时甚至超过40ml.该法制备的腹水抗体含量高,每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平.此外,腹水中的杂蛋白也较少,便于抗体的纯化.意义：用于以下各种生命科学实验并具有医用价值（1）沉淀反应：Precipitation reaction（2）凝集实验：haemaglutination（3）放射免疫学方法检测免疫复合物（4）流式细胞仪：用于细胞的分型和细胞分离. （5）ELISA 等免疫学检测（6）BIAcore biosensor:检测Ab-Ag或与蛋白的亲和力 .(7) 免疫印记（western blotting)（8）免疫沉淀：（9）亲和层析：分离蛋白质（10）磁珠分离细胞（11）临床疾病的诊断和治疗；。
单抗制备的详细步骤
单克隆抗体研制最详细步骤单克隆抗体的研制一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。
常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。
一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。
即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。
因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。
由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。
因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。
随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。
1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。
这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。
通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。
与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。
单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。
Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。
二、杂交瘤技术（一）杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。
抗cd19单克隆抗体及其制备方法与应用
抗CD19单克隆抗体及其制备方法与应用1. 抗CD19单克隆抗体概述在免疫疗法领域，抗CD19单克隆抗体被广泛应用于治疗B细胞相关的疾病，尤其是B细胞恶性肿瘤和自身免疫疾病。
CD19是B细胞表面的一种标志性蛋白，它在B细胞的发育、激活和功能中扮演重要角色。
抗CD19单克隆抗体可以选择性地杀伤CD19阳性的B细胞，而对其他细胞几乎没有影响，从而成为治疗B细胞相关疾病的有效手段。
2. 抗CD19单克隆抗体的制备方法抗CD19单克隆抗体的制备主要通过以下步骤实现：1.免疫原：首先需要获得CD19的免疫原，常见的方法包括从CD19表达的细胞中提取膜蛋白或人工合成片段。
2.免疫动物：将免疫原注射到小鼠或大鼠等实验动物体内，触发其免疫系统产生抗CD19抗体。
3.融合细胞：从免疫动物中获取B细胞，并将其与瘤细胞或其它细胞融合，形成杂交瘤细胞，这些细胞能够不断产生具有特异性的抗CD19抗体。
4.提取与纯化：从培养基中提取并纯化目标抗体，经过一系列的纯化步骤，最终得到高纯度的抗CD19单克隆抗体。
3. 抗CD19单克隆抗体的临床应用抗CD19单克隆抗体作为治疗B细胞相关疾病的新战略，已在临床上取得了显著的成果。
以CAR-T细胞疗法为代表的治疗手段，就是通过将患者自身的T细胞进行基因改造，使其表达抗CD19单克隆抗体，从而实现对恶性B细胞的杀伤。
在自身免疫疾病的治疗中，抗CD19单克隆抗体也展现出了良好的疗效。
通过选择性地清除异常活化的B细胞，可以有效地控制自身免疫疾病的发作和进展。
4. 个人观点和理解抗CD19单克隆抗体作为一种新型的免疫治疗药物，不仅在临床上展现出了显著的疗效，而且为免疫疗法领域带来了新的活力和希望。
在未来，随着对其作用机制和临床应用的进一步深入研究，相信抗CD19单克隆抗体会在更多疾病的治疗中发挥重要作用，并为患者带来更好的治疗效果。
结语通过对抗CD19单克隆抗体的概述、制备方法和临床应用的全面探讨，我们对其在治疗B细胞相关疾病中的重要作用有了更深入的理解。
单克隆抗体制备实验过程
单克隆抗体制备实验过程一、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。
一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。
抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
说明：FCA，弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody，北京康碧泉公司研制的佐剂。
上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。
PS：1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。
2、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。
3、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B细胞数量会下降到未冲击前的水平。
二、细胞融合（Cell fusion）【材料和试剂】（1）骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。
（2）免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，•分离血清冻存备用。
拉颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中3～5min。
无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3～5个小块，然后用注射器内芯研磨。
将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml，1000r/min 离心5min，弃上清，再以同法洗涤离心一次。
然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5～2×108个脾细胞。
（3）饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。
用酒精棉球擦拭腹膜消毒。
用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。
犬瘟热病毒单克隆抗体的制备及鉴定
犬 瘟 热 病 毒 单 克 隆 抗 体 的 制 备 及 鉴 定
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张 涛 杨 玉姣 刘 玉 秀 阮 洋 靳 晓 霞 夏 成 柱 。 ， ， ， ， ，
（ ． 林 大 学 畜 牧 兽 医学 院 ， 林 长 春 ｌ ０ ６ ； ． 放军 军 事 兽 医 研 究 所 ， 林 长 春 １ ０ ６ ； １吉 吉 ３０ ２ ２解 吉 ３ ０ ２ ３ 吉 林 省 人兽 共 患 病 预 防与 控 制 重 点 实 验 室 ， 林 长 春 １ ０ ６ ） ． 吉 ３ ０ ２
ｌ 材 料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
一
吸道 、 化道 、 经系 统 、 肤 损 伤［ 。 因此 ， 备单 消 神 皮 ５ ］ 制
克 隆抗 体可 以为 犬瘟 热的诊 断 和治 疗 提供 良好 的基
础。
８ ℃保 存 备 用 ＿ 。 Ｏ ６ ｊ
１ ２ ２ 动 物 免 疫 免 疫 ６ 周 龄 ～ ８周 龄 的 雌 性 ．．
摘 要 ： 纯化 的 犬瘟 热病 毒 （ ＤＶ） 别 与 弗氏 完全 佐 剂 （ Ｆ 和 弗 氏不 完 全佐 剂 （Ｆ 乳 化 制备 的 将 Ｃ 分 Ｃ Ａ） Ｉ Ａ）
常用的单克隆抗体检测方法
常用的单克隆抗体检测方法通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，在杂交瘤制备完成后，需要对抗体进展一个检测，本文介绍了几种常用的抗体检测的方法〔1〕免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反响的特异性和酶对底物显色反响的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。
由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。
①器材和试剂a、包被缓冲液：碳酸盐缓冲液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml 混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6。
Tris-HCl缓冲液〔PH8.0，0.02mol/L〕：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸馏水至1000ml。
b、洗涤缓冲液〔PH7.2的PBS〕：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸馏水至1000ml。
c、稀释液和封闭液：牛血清白蛋白〔BSA〕0.1g，加洗涤液至100ml；或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。
d、酶反响终止液〔2mol/LH2SO4〕：取蒸馏水178.3ml，滴加浓硫酸〔98%〕21.7ml。
e、底物缓冲液〔PH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液〕：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L柠檬酸24.3ml，再加50ml蒸馏水。
柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。
f、底物使用液：OPD底物使用液〔测490nm的OD值〕：OPD 5mg，底物缓冲液10ml，3% H2O2 0.15ml。
TMBS或TMB底物使用液〔测450nm的OD值〕：TMBS或TMB〔1mg/ml〕1.0ml，底物缓冲液10ml，1% H2O2 25ul。
ABTS底物使用液〔测410nm的OD值〕：ABTS 0.5mg，底物缓冲液1ml，3% H2O2 2ul。
人源化单克隆抗体的制备方法
人源化单克隆抗体的制备方法人源化单克隆抗体的制备方法1. 引言人源化单克隆抗体作为一种重要的生物药物，在医学诊断和治疗上发挥着重要的作用。
它们能够通过特异性结合目标物质，如病毒、癌细胞等，以识别、中和或破坏它们，具有广泛的应用前景。
人源化单克隆抗体通过将小鼠源的初始抗体进行改造和人源化，弥补了小鼠抗体在人体内产生反应的缺陷，进而提高了其临床应用的安全性和有效性。
2. 人源化单克隆抗体的制备方法2.1 选择目标抗原在制备人源化单克隆抗体之前，首先需要明确目标抗原。
这是指研究人员要制备对特定疾病或病原体具有高度特异性的抗体。
目标抗原的选择对于后续的实验设计和结果分析至关重要。
2.2 制备小鼠源的初始抗体为了制备人源化单克隆抗体，通常需要使用小鼠或其他动物作为初步制备抗体的源头。
研究人员通过免疫注射小鼠来激发其免疫系统产生特定抗原的抗体。
之后，从小鼠体内提取抗体进行初步鉴定和筛选。
2.3 克隆筛选通过克隆和筛选的过程，选择那些对目标抗原具有高度特异性的抗体克隆。
这一步骤的目的是从小鼠源的初始抗体中挑选出性能最佳的抗体克隆，为后续的人源化操作打下基础。
2.4 人源化改造人源化改造是将小鼠源的初始抗体转化为具有人源特性的抗体。
在这一步骤中，研究人员会通过基因工程技术将小鼠源抗体的大部分小鼠特异性区域替换为人源的同源区域，以减少人体对外源蛋白的免疫反应。
这可以通过重组DNA技术，将人源抗体的DNA序列嵌入到小鼠源抗体的DNA序列中，使其具有人源性。
2.5 生产和纯化经过人源化改造的抗体需要进行大规模的生产和纯化。
这通常通过基因工程的方法，在合适的细胞系中表达和生产抗体。
随后，使用各种纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等，将抗体从混合物中纯化出来，以获得高纯度的人源化单克隆抗体。
3. 个人观点和理解人源化单克隆抗体的制备方法是一项复杂的过程，其中涉及到多个关键步骤和技术。
通过人源化改造，可以将小鼠源的初始抗体转化为具有人源特性的抗体，从而提高其在人体内的安全性和有效性。
人源化单克隆抗体技术路线
人源化单克隆抗体技术路线
人源化单克隆抗体技术是一种用于制备治疗性抗体的方法，其基本技术路线如下：
1. 抗原选择：选择目标抗原，即希望产生抗体针对的特定蛋白质或分子。
2. 免疫动物：给动物（通常是小鼠）注射目标抗原，以诱导免疫反应。
3. 杂交瘤技术：从免疫动物的脾脏中分离出 B 淋巴细胞，并与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
4. 抗体筛选：对杂交瘤细胞进行筛选，以找到能够产生针对目标抗原的特异性抗体的细胞株。
5. 抗体人源化：通过基因工程技术，将鼠源抗体的互补决定区（CDR）移植到人源抗体的框架区，从而构建出人源化抗体。
6. 表达和纯化：将人源化抗体基因导入适当的表达系统（如哺乳动物细胞、酵母或细菌）中进行表达，并通过纯化步骤获得高纯度的人源化单克隆抗体。
7. 功能和质量评估：对人源化单克隆抗体进行生物学活性、亲和力、特异性等方面的评估，以及进行质量控制和安全性测试。
8. 临床试验和批准：经过临床前研究后，将人源化单克隆抗体进行临床试验，以评估其安全性和有效性。
如果试验结果良好，该抗体可能获得监管机构的批准，用于临床治疗。
人源化单克隆抗体技术的发展使得治疗性抗体能够更好地应用于人类疾病的治疗，减少了免疫原性反应的风险，并提高了抗体的治疗效果。
这一技术在肿瘤治疗、自身免疫疾病治疗等领域具有重要的应用价值。
结核分枝杆菌分泌蛋白MPB64小鼠单克隆抗体制备、纯化及鉴定
结核分枝杆菌分泌蛋白MPB64小鼠单克隆抗体制备、纯化及鉴定马荣;陈振;黑龙;赵志军;徐广贤;戈朝晖【摘要】目的应用细胞融合技术制备和鉴定抗MPB64单克隆抗体.方法采用重组目的蛋白pET32a-MPB64(680bp)为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞融合.间接ELISA法筛选分泌抗体的杂交瘤细胞,采用有限稀释方法对所有筛选确认的阳性细胞株进行亚克隆,杂交瘤细胞诱导小鼠产生腹水,再用蛋白G亲和层析法纯化抗体,通过间接ELISA、Western Blot鉴定该单克隆抗体.结果通过杂交瘤技术获得10株可稳定分泌抗MPB64单克隆抗体的细胞株.以命名的“1A3”单抗细胞株进行腹水制备,经鉴定腹水效价＞1∶720000,经纯化抗体效价约为1∶720000,抗体浓度2.15mg·mL-1.结论成功制备和获得了抗MPB64单克隆抗体的细胞株,为MPB64单克隆抗体制备和鉴定奠定了基础.【期刊名称】《宁夏医科大学学报》【年(卷),期】2015(037)009【总页数】4页(P1013-1016)【关键词】结核分枝杆菌;MPB64;单克隆抗体;杂交瘤技术【作者】马荣;陈振;黑龙;赵志军;徐广贤;戈朝晖【作者单位】宁夏医科大学总医院骨科,银川750004;宁夏医科大学总医院骨科,银川750004;宁夏医科大学总医院骨科,银川750004;宁夏医科大学总医院检验科,银川750004;宁夏医科大学检验学院,银川750004;宁夏医科大学总医院骨科,银川750004【正文语种】中文【中图分类】R378.91+1E-mail:**************MPB64蛋白是结核杆菌合成的一种分泌性抗原，其相对分子量为24kDa，是结核分枝杆菌复合群的一种标志蛋白。
我们前期研究中成功构建的MPB64 基因核苷酸序列测序结果与标准菌株H37RV 核苷酸(GenBank: AY208674．1)序列同源性为98.36%[1]。
【原创】单克隆抗体研制最详细步骤!!!
【原创】单克隆抗体研制最详细步骤5、杂交瘤细胞的冻存与复苏（1）杂交瘤细胞的冻存在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故，如停电、污染、培养箱的温度或CO2控制器失灵等给正在建立中的杂交瘤带来灾难，通常尽可能早地冻存一部分细胞作为种子，以免遭到不测。
在杂交瘤细胞建立以后，更需要冻存一大批，以备今后随时取用。
细胞冻存的原理是细胞在加血清和二甲基亚砜的培养基中以一定的缓慢速度下降温度（0℃——-20℃，每分钟下降1℃；-20℃——-40℃每分钟下降2℃），可在-196℃液氮或液氮蒸气中长期保存。
下面介绍我们实验室的细胞冻存方法，经几年来对多种细胞的使用，细胞复苏存活率均在80%以上。
A、材料：a. 带盖吸管筒一只（铝质或洋铁皮制），内壁（包括筒底和盖）衬1-2层石棉纸或石棉布。
b. 含10-20%血清、5-10% DMSO的HT培养基，冰浴降温至0℃左右（用作冻存液）。
c. 灭菌安瓶或带盖小瓶。
d. -70℃冰箱。
e. 液氮及液氮罐。
f. 处于对数生长中期、健康而活力好的杂交瘤细胞。
B、方法：a. 将杂交瘤细胞（或其他细胞）离心，重新悬浮于预冷的冻存液中，浓度为106-107左右/ml，分装安瓶，每瓶1ml，置冰浴上；安瓶上标明细胞名称、冻存日期、批号等。
b. 安瓶封口后仍置冰浴上。
c. 将安瓶放入一带收口绳的小布袋内，布袋上标明冻存号、细胞名称等，立即将布袋放入吸管筒内，置-70℃冰箱。
d. 2-4小时后或过夜后从-70℃冰箱取出吸管筒，将盛有细胞的布袋移入液氮罐；在布袋的线绳上作好标记或代码；最后在液氮冻存簿上作详细记录。
e. 液氮罐应定期补充液氮（最好是专人管理）；补充液氮及存取细胞时应带保护眼镜和手套，以免因液氮冻伤等。
（2）杂交瘤细胞的复苏杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存，若无意外情况时，可保存数年至数十年。
简述单克隆抗体技术的基本原理
简述单克隆抗体技术的基本原理单克隆抗体技术是生物技术领域的一项重要技术，在医药研发、诊断和治疗等方面都有着广泛的应用和前景。
单克隆抗体技术的基本原理是通过选择一种特定的免疫细胞，获取它产生的特异性抗体并使其进行不限制性复制，最终获得具有高度特异性和稳定性的单克隆抗体。
下面将详细介绍单克隆抗体技术的基本原理，包括鼠源性、嵌合型和人源性单克隆抗体技术，以及单克隆抗体生产的流程和应用。
一、鼠源性单克隆抗体鼠源性单克隆抗体是最早使用的单克隆抗体，其制备原理是将鼠类动物免疫一种抗原，收集其脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞，然后将杂交瘤细胞单克隆化，即从杂交瘤中分离出单个克隆细胞并培养扩大。
鼠源性单克隆抗体的优点是制备简单、产量高，但由于小鼠免疫系统与人类的巨大差异，鼠源性抗体往往容易引起免疫原性反应，从而限制了其在临床应用中的使用。
二、嵌合型单克隆抗体为了克服鼠源性单克隆抗体的局限性，研究人员提出了嵌合型单克隆抗体技术。
嵌合型单克隆抗体是由人源性的Fc区和鼠源性的可变区域组成，它可以确保高度特异性和稳定性的又可以降低免疫原性反应。
嵌合型单克隆抗体的制备方法是将人源性的IgG1的Fc片段与包含鼠源性单克隆抗体的可变区域进行基因重组，最终获得嵌合型单克隆抗体。
嵌合型单克隆抗体优点是高度特异性和稳定性、免疫原性反应小。
嵌合型单克隆抗体的制备过程较为复杂，且其效价可能比鼠源性单克隆抗体略低。
随着生物技术的不断发展，研究人员逐渐开始研制具有人源性的单克隆抗体，其能够更加充分地体现在人体内生物学免疫动态，从而降低了潜在的体内免疫原性反应。
人源性单克隆抗体制备方法有两种，一种是在小鼠背景中将人源性单克隆抗体进行筛选和生产，另一种是通过人免疫系统获得人源性单克隆抗体。
人免疫系统产生抗体的原理与小鼠类似，但需要额外进行一系列的筛选和优化步骤，以保证细胞系的干净和稳定性。
由于人源性单克隆抗体与人体内的免疫系统具有良好的兼容性和相似性，因此在临床应用中具有极高的价值。
单克隆抗体的制备过程
单克隆抗体的制备过程包括鉴定抗原、免疫动物、制备抗体、纯化抗体和评价抗体等步骤。
鉴定抗原：鉴定抗原是单克隆抗体的制备过程中的第一步，需要确定免疫动物对抗原的反
应性。
免疫动物：免疫动物是单克隆抗体的制备过程中的第二步，需要选择具有良好免疫反应的
动物。
制备抗体：制备抗体是单克隆抗体的制备过程中的第三步，需要将抗原注射到免疫动物体内，以诱导动物产生抗体。
纯化抗体：纯化抗体是单克隆抗体的制备过程中的第四步，需要对制备的抗体进行纯化，
以得到高纯度的抗体。
评价抗体：评价抗体是单克隆抗体的制备过程中的第五步，需要对纯化的抗体进行评价，
以确定其性能。
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单克隆抗体的制备技术和纯化及鉴定一、实验目的：单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。
了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。
二、实验原理：骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。
将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。
经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA 的合成过程而死亡。
只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。
三、试剂与器材：细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。
四、操作方法：1、抗原制备；一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。
A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为～，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。
一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原～，３～４天后，杀死小鼠取脾做融合用。
B. 颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。
例如用羊红血球免疫小白鼠，以１％浓度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。
有人认为最后一次免疫剂量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。
2、免疫动物；目前应用最广的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠为好。
就品系而言以Balb/ c小白鼠应用最广，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来。
Balb/c系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以8~12周龄为宜。
大白鼠也可，能产生较多量的单克隆抗体。
现在已经在小鼠杂交瘤的基础上，发展了小鼠－大鼠，小鼠－人以及人－人杂交瘤技术。
免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之一。
正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生×107~×107种不同的抗体。
因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。
所以为了提高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。
B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响。
有人认为处在转化时期的B淋巴细胞可能更易于融合，而免疫以后7~8天，虽然是抗体产生的高峰时期，但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。
故一般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。
3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；脾细胞制备(1) 免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠，拉颈或用CO2处死小白鼠。
(2) 将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。
(3) 把脾放入5ml含有％FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。
(4) 用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。
(5) 直立小试管3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。
(6) 以％FCS—1640充满离心管，并以400g离心7min～10min（与此同时应开始制备骨髓细胞）。
(7) 把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。
(8) 重复⑹、⑺步骤。
(9) 计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。
骨髓瘤细胞制备骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。
选择骨髓瘤细胞的条件：①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；②骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml；④生长速度快，繁殖时间短。
目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（简称SP2）；③P2—X？—Ag8·6·5·3（简称653）；④FO以653最为常用，它是由矿物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma，MOPC）并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。
骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，试验时复苏、增殖、传代即可。
由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶处理。
为了防止出现返祖现象，在融合前，可将培养基内加入15μg/ml 8－氮鸟嘌呤。
取约1×107～6×107对数生长期（即培养15h～20h）的骨髓瘤细胞，在室温离心（400g）10min，沉淀以％FCS—1640液再悬浮并计数。
饲养细胞在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feeder cell）。
在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。
许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。
应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。
腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。
也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。
（1）拉颈处死小鼠。
（2）70％酒精浸泡消毒10min。
（3）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。
（4）用注射器将4ml ％蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。
（5）1 000r／min离心10min。
（6）取上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。
台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含40万个活细胞。
（7）以1ml吸管将细胞种入微量培养皿，每孔，含2万个细胞，放入CO2培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。
如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。
4、细胞融合；小鼠骨髓瘤可以在体外培养液中生存并大量繁殖。
经过用某种抗原免疫的小鼠及淋巴细胞能分泌某种抗体，但小鼠的B淋巴细胞在一般培养某中不易存活。
如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌霜种抗体的B淋巴细胞在融合因子（聚乙二醇，P EG）作用下产生融合，则融合的细胞既具有肿瘤细胞易分裂增殖的特性，又具有B淋巴细胞分泌特异性抗体的能力，在HAT选择培养基中可以选择得到杂交细胞。
这种融合的被称为淋巴细胞杂交瘤的细胞可以在体外培养液中大量繁殖生长，从培养液上清中可以收集到大量某B淋巴细胞产物——单克隆抗体。
（1）、取末次免疫后的第3天小鼠脾细胞悬液，将108小鼠脾细胞与1-5×107SO2/O小鼠骨髓瘤细胞混合于50毫升刻度离心管中，经1000转/分离心7分钟；（2）、弃上清液，尽可能除得干净，用手指轻叩离心管底部，使沉淀混匀如糊状，离心管置37℃水中进行水浴（一小烧杯中），准备融合；3）、将37℃水浴中保温的50%毫升（实际应用毫升）用滴管缓慢滴入离心管中，在60秒钟内滴完，在37℃水浴中边滴边摇边离心管，使细胞保存在混匀状态；4）、加完PEG后，将细胞悬液放在37℃水浴中静置90秒钟，立即在2—4分钟内加入15毫升无血清的RPMI-1640培养基（37℃），开始要一滴一滴地加，由于稀释使PEG停止作用。
注意尽可能不搅动细胞；5）、再经100转/分离心10分钟。
弃去上清液，加25毫升HAT培养液，轻轻混匀，将混悬液分装已有巨噬细胞的两个24孔培养板中，每孔毫升；6）、将培养板放在水蒸汽饱和CO2孵箱中，37℃孵育。
CO2含量为5%；7）、每2—3天换一次HAT培养液，连续2周观察杂交瘤细胞是否出现。
2周后使用HT培养基。
5、杂交瘤细胞的选择培养；6、杂交瘤细胞的筛选；7、杂交瘤细胞的克隆化；8、单克隆抗体的检定；9、分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；10、单克隆抗体的大量制备。
五、关键步骤与注意事项：1、整个制备过程需严格无菌2、细胞传代培养时注意适时更换培养液杂交瘤细胞的大量繁殖克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。
不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。
而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。
杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。
如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。
产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100~1 000倍。
利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。
1．材料（1）经高压灭菌的降植烷。
（2）Balb/c鼠：5~8周龄。
（3）杂交瘤细胞：取对数生长期的细胞。
（4）RPMI—1640培养液（5）新生牛血清2．操作方法(1) 于小鼠腹腔注射降植烷，注射后１～９周内种植细胞。
(2) 收取对数生长期的杂交瘤细胞，用５％FCS—1640液洗涤一次，1 000r /min离心10min。
(3) 取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用５％FCS—1640液配成×107细胞/ml的悬液。
(4) 给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射1ml（含×107个细胞/ml）。
(5) 接种后10天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔1~3天取1次，可取10次。
血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。
单克隆抗体的提纯1．材料(1) 20mMol/L ~—HCl缓冲液20 mMol/L NaCl(2) 20mMol/L ~—HCl缓冲液40mMol/L NaCl(3) 20mMol/L ~—HCl缓冲液80 mMol/L NaCl(4) 20mMol/L ~—HCl缓冲液(5) 饱和硫酸铵液(6) DEAE—纤维素柱2．操作方法（1）小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后，于×105转离心30min，去沉淀。