荧光分析法
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荧光分析法
荧光分析法一、基本原理某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluorescence analysis）。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。
在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。
跃迁到较高能级的分子，很快（约10-8s）因碰撞而以热的形式损失部分能量，由所处的激发态能级下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。
由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。
荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。
物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。
如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（excitation spectrum）。
实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。
在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。
在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。
激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。
对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。
荧光物质的线性范围一般在0.00005-100微克/ml,当荧光物质溶液的吸光度小于或等于0.05时荧光强度和浓度才成线性关系。
荧光分析法ppt
当分子从激发态返回到基态时，会以释放光子的形式释放出多余的能 量，这种释放的光子就是荧光。
荧光分析法的化学基础
荧光物质的化学结构
荧光物质的化学结构决定了其荧光性质，如荧光量子产率、荧光 波长等。
荧光物质的激发态性质
荧光物质的激发态性质对其荧光性质也有重要影响，如激发态的 稳定性、激发态的能量转移等。
感谢您的观看
THANKS
详细描述
荧光分析法可用于检测生物样品中的肿瘤标志物、药物浓度、DNA等物质。通过荧光探针、荧光免疫 分析等方法，可实现对肿瘤标志物、药物浓度的快速检测，为肿瘤诊断、药物治疗监测等提供依据。 此外，荧光分析法还可用于DNA检测，为遗传病诊断、亲子鉴定等提供技术支持。
荧光分析法在食品安全中的应用
总结词
荧光分析法的缺点
易受干扰
荧光分析法可能会受到其他物质的干扰，影响检测结果的准确 性。
不稳定性
荧光物质的荧光光谱可能会随着环境条件的变化而发生变化， 导致分析结果不稳定。
成本高
荧光分析法所需的仪器设备相对昂贵，而且需要专业人员操作 和维护。
荧光分析法的改进与发展趋势
优化荧光探针
通过改进荧光探针的设计和合成方法，提高荧光分析法的灵敏度 和特异性。
02
荧光分析法的原理
荧光分析法的物理基础
01
分子能级
荧光分析法涉及分子的能级跃迁，即分子从基态跃迁到激发态，再从
激发态返回到基态的过程。
02 03
激发态与基态的能量差
荧光分析法利用了激发态与基态之间存在的能量差，当分子吸收特定 波长的光能后，会从基态跃迁到激发态，之后释放出特定波长的荧光 。
荧光的产生
荧光物质的基态性质
荧光物质的基态性质同样影响其荧光性质，如基态的稳定性、基 态与激发态之间的跃迁能量等。
荧光分析法的化学基础
荧光物质的化学结构
荧光物质的化学结构决定了其荧光性质，如荧光量子产率、荧光 波长等。
荧光物质的激发态性质
荧光物质的激发态性质对其荧光性质也有重要影响，如激发态的 稳定性、激发态的能量转移等。
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详细描述
荧光分析法可用于检测生物样品中的肿瘤标志物、药物浓度、DNA等物质。通过荧光探针、荧光免疫 分析等方法，可实现对肿瘤标志物、药物浓度的快速检测，为肿瘤诊断、药物治疗监测等提供依据。 此外，荧光分析法还可用于DNA检测，为遗传病诊断、亲子鉴定等提供技术支持。
荧光分析法在食品安全中的应用
总结词
荧光分析法的缺点
易受干扰
荧光分析法可能会受到其他物质的干扰，影响检测结果的准确 性。
不稳定性
荧光物质的荧光光谱可能会随着环境条件的变化而发生变化， 导致分析结果不稳定。
成本高
荧光分析法所需的仪器设备相对昂贵，而且需要专业人员操作 和维护。
荧光分析法的改进与发展趋势
优化荧光探针
通过改进荧光探针的设计和合成方法，提高荧光分析法的灵敏度 和特异性。
02
荧光分析法的原理
荧光分析法的物理基础
01
分子能级
荧光分析法涉及分子的能级跃迁，即分子从基态跃迁到激发态，再从
激发态返回到基态的过程。
02 03
激发态与基态的能量差
荧光分析法利用了激发态与基态之间存在的能量差，当分子吸收特定 波长的光能后，会从基态跃迁到激发态，之后释放出特定波长的荧光 。
荧光的产生
荧光物质的基态性质
荧光物质的基态性质同样影响其荧光性质，如基态的稳定性、基 态与激发态之间的跃迁能量等。
荧光分析法
关系：
E h
式中:
hc
p
h
h——普朗克常数，等于6.626×10-34 J· s; c——光速，等于2.998× 1010cm/s.
在光致激发和去激发光中，价电子可以处在不同的自选状态，
常用电子自旋状态的多重性来描述。 一个所有电子自旋都配对的分子的电子态称为单重态，用S表示， 基态为单重态的分子具有最低电子能，用S0 表示如果电子在跃 迁过程中改变了自旋方向，使分子具有两个自旋平行的电子， 这样的电子态称为三重态，用T表示
3.温度的影响
荧光强度对温度较敏感，因此荧光分析一定要严格控制温度。
温度升高，绝大多数荧光物质的荧光效率降低，荧光强度减低。 因为温度升高，激发态分子与溶剂分子的碰撞频率增大，增加 了外转移的非辐射过程，导致溶液荧光强度降低，因此，可通 过降低温度的方法提高荧光效率和荧光强度。
4.溶液pH的影响
荧光分析法可采用足够强的光源和高灵敏度的检测放大系统，从而 获得比可见光吸光度法高的多的灵敏度。
影响荧光强度的因素
1.溶剂的影响
而增强。
• 荧光峰的波长随溶剂的介电常数增大而增大，强度随极性的增大
• 2.溶液粘度的影响
• 荧光强度随着介质粘度的升高而增强，这是由于介质粘度增强，
减少了分子碰撞，从而减少了能量损失的结果
激发单色器 光源 样品池 垂直
指示器· 放大器 记录器
发 射 单 色 器 检测器
国产970CRT型荧光分光光度计
1.激发光源
荧光测量中所用的光源一般比紫外-可见分光光度计所使用的光
源发光强度大，激发光源通常采用发射强度高的汞弧灯、氢灯
或氙弧灯。氙弧灯产生强烈的连续辐射，其波长范围在
E h
式中:
hc
p
h
h——普朗克常数，等于6.626×10-34 J· s; c——光速，等于2.998× 1010cm/s.
在光致激发和去激发光中，价电子可以处在不同的自选状态，
常用电子自旋状态的多重性来描述。 一个所有电子自旋都配对的分子的电子态称为单重态，用S表示， 基态为单重态的分子具有最低电子能，用S0 表示如果电子在跃 迁过程中改变了自旋方向，使分子具有两个自旋平行的电子， 这样的电子态称为三重态，用T表示
3.温度的影响
荧光强度对温度较敏感，因此荧光分析一定要严格控制温度。
温度升高，绝大多数荧光物质的荧光效率降低，荧光强度减低。 因为温度升高，激发态分子与溶剂分子的碰撞频率增大，增加 了外转移的非辐射过程，导致溶液荧光强度降低，因此，可通 过降低温度的方法提高荧光效率和荧光强度。
4.溶液pH的影响
荧光分析法可采用足够强的光源和高灵敏度的检测放大系统，从而 获得比可见光吸光度法高的多的灵敏度。
影响荧光强度的因素
1.溶剂的影响
而增强。
• 荧光峰的波长随溶剂的介电常数增大而增大，强度随极性的增大
• 2.溶液粘度的影响
• 荧光强度随着介质粘度的升高而增强，这是由于介质粘度增强，
减少了分子碰撞，从而减少了能量损失的结果
激发单色器 光源 样品池 垂直
指示器· 放大器 记录器
发 射 单 色 器 检测器
国产970CRT型荧光分光光度计
1.激发光源
荧光测量中所用的光源一般比紫外-可见分光光度计所使用的光
源发光强度大，激发光源通常采用发射强度高的汞弧灯、氢灯
或氙弧灯。氙弧灯产生强烈的连续辐射，其波长范围在
第十一章 荧光分析方法
5
在某些情况下，电子在跃迁过程中还伴随着自 旋方向的改变，这时分子的两个电子的自旋方向 相同，自旋量子数都为1／2，总自旋量子数s等 于1，这时分子处于激发三重态(2s+1＝3)。 S0+hν→T1
6
激发单重态与激发三重态的区别：
激发单重态分子是抗磁性分子，激发三重 态分子是顺磁性分子；
激发单重态的平均寿命大约10-8s，激发三 重态的平均寿命大约10-4~1s； 电子由S0→S1，S2等的跃迁较容易，属于允 许跃迁。电子由S0→T1，T2等的跃迁较难发 生，属于禁阻跃迁。
23
（二）有机化合物分子结构与荧光的关系
能够发射荧光的物质同时具备两个条件：即有 强的紫外—可见吸收和一定的荧光效率。 1．长共扼结构 绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂 环、因为芳香环和杂环分子具有长共轭的π—π* 跃迁。π电子共轭程度越大，荧光强度(荧光效率) 越大，而荧光波长也长移。
24
31
5．散射光
当一束平行单色光照射在液体样
品上时，大部分光线透过溶液，小部分由于光
子与物质分子相碰撞，使光子的运功方向发生
改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。
光子和物质分子发生弹性碰撞时，发生能量
的交换，仅仅是光子运动方向发生改变，这种
散射光称为瑞利光。其波长与入射光波长相同。
32
光子和物质分子发生非弹性碰撞时．在光子 运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发 生能量的交换，光子把部分能量转移给物质分 子或从物质分子获得部分能量，而发射出比入 射光稍长或稍短的光，这种散射光称为拉曼光。 散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入 射光波长更长的拉曼光。
12
② 磷光(phosphorescence)发射：经过体系间跨越 的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动 能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活 一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出 光辐射，这种光辐射称为磷光。 T1→S0+hνp 磷光发射时间较长，约10-4-10s。 激发光停止后，磷光可持续一段时间。 电子由S0→T1为禁阻跃迁，需由S1经过体系间跨越 转化为T1。 同一分子的S1→S0 比T1→S0 的能级差大，磷光 的波长比荧光波长长
在某些情况下，电子在跃迁过程中还伴随着自 旋方向的改变，这时分子的两个电子的自旋方向 相同，自旋量子数都为1／2，总自旋量子数s等 于1，这时分子处于激发三重态(2s+1＝3)。 S0+hν→T1
6
激发单重态与激发三重态的区别：
激发单重态分子是抗磁性分子，激发三重 态分子是顺磁性分子；
激发单重态的平均寿命大约10-8s，激发三 重态的平均寿命大约10-4~1s； 电子由S0→S1，S2等的跃迁较容易，属于允 许跃迁。电子由S0→T1，T2等的跃迁较难发 生，属于禁阻跃迁。
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（二）有机化合物分子结构与荧光的关系
能够发射荧光的物质同时具备两个条件：即有 强的紫外—可见吸收和一定的荧光效率。 1．长共扼结构 绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂 环、因为芳香环和杂环分子具有长共轭的π—π* 跃迁。π电子共轭程度越大，荧光强度(荧光效率) 越大，而荧光波长也长移。
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31
5．散射光
当一束平行单色光照射在液体样
品上时，大部分光线透过溶液，小部分由于光
子与物质分子相碰撞，使光子的运功方向发生
改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。
光子和物质分子发生弹性碰撞时，发生能量
的交换，仅仅是光子运动方向发生改变，这种
散射光称为瑞利光。其波长与入射光波长相同。
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光子和物质分子发生非弹性碰撞时．在光子 运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发 生能量的交换，光子把部分能量转移给物质分 子或从物质分子获得部分能量，而发射出比入 射光稍长或稍短的光，这种散射光称为拉曼光。 散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入 射光波长更长的拉曼光。
12
② 磷光(phosphorescence)发射：经过体系间跨越 的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动 能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活 一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出 光辐射，这种光辐射称为磷光。 T1→S0+hνp 磷光发射时间较长，约10-4-10s。 激发光停止后，磷光可持续一段时间。 电子由S0→T1为禁阻跃迁，需由S1经过体系间跨越 转化为T1。 同一分子的S1→S0 比T1→S0 的能级差大，磷光 的波长比荧光波长长
《仪器分析》荧光分析法
500 nm
3.吸收光谱、激发光谱与荧光光为相似。
F
激发光谱
（2）镜像规则 通常荧光光谱与激发光谱（吸收光谱）大致 呈镜像对称。
4 3 2 1
S1
4 3 2 1
S0
（3）Stokes位移 Stokes位移是指激发光谱与荧光光谱之间 的波长差值。荧光的波长总是大于激发光的波长。
三、样品池
四、检测器
通常用石英杯，四面透光
光电倍增管
与激发光源垂直，为了消除激发光对荧光 测量的干扰
问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度 计有何异同点？
紫外-可见分光光度计:
光源 单色器 样品池 检测器 数据处理 仪器控制
荧光分光光度计:
光源 激发 单色器 样品池 荧光 单色器 检测器 数据处理 仪器控制
荧光法与UV-Vis法的比较： 相同点：
都需要吸收紫外 - 可见光，产生电子能级跃迁。
荧光法与UV-Vis法的比较：
不同点：
UV-Vis法测定的是物质溶液对紫外-可 见光的吸收程度 (A) 。
荧光法测定的是物质经紫外-可见光照 射后发射出的荧光强度(F)。
本章作业
P64 三计算题 1. P65 四简答题 3、4、
紫外-可见分光光度计 吸收池
荧光分光光度计 吸收池
It
It IF,p I0
I0
荧光光度计
第三节
定量分析方法
F= K c （εcL≤0.05 ） —— 定量分析的依据 方法：标准曲线法和标准对比法
1. 标准曲线法——最常用的定量分析方法
浓度 C1 C2 C3 C4 C5 Cx 荧光强度 F1 F2 F3 F4 F5 Fx
分析化学 第十一章 荧光分析法
h
29
㈡环境因素
荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的 影响。适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的 灵敏度和选择性。 ⑴溶剂效应 ①溶剂的极性：
溶剂的极性增大，π→π＊跃迁的能量减小，红 移。 ②溶剂的粘度
溶剂的粘度降低，分子间碰撞机会增加，无辐 射跃迁几率增加，荧光减弱。
h
30
⑵温度的影响
激发态分子与溶剂和其它溶质分子间的相 互作用及能量转换等过程称为外部能量转换。
外转换过程是荧光或磷光的竞争过程，因该
过程发光强度减弱或消失，该现象称为“猝灭” 或
“熄灭”。
h
10
⑸体系间跨越 系间跃迁是不同多重态之间的一种无辐射跃迁
该过程是激发态电子改变其自旋态，是分子的多 重性发生变化的结果。
当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的几 率增大。
的吸收(或激发)光谱的波长长。荧光发射这种波长 位移的现象称为Stokes位移。
原因：处于激发态的分子一方面由于振动弛豫 等损失了部分能量，另一方面溶剂分子的弛豫作用 使其能量进一步损失，因而产生了发射光谱波长的 位移。
Stokes位移表明在荧光激发和发射之间所产生 的能量损失。（见P220图11-3）
①对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言， 溶液的pH将对这类物质的荧光强度产生较大的 影响。 如：在pH7～12的溶液中，苯胺以分子形式存 在，产生蓝色荧光；
当pH＜3、 pH＞13时，苯胺以阳离子、 阴离子形式存在，均无荧光。 ②溶液的pH也影响金属配合物的荧光性质。
h
32
⑷荧光猝灭
荧光猝灭：荧光分子与溶剂或其它溶质分子之间相互 作用，使荧光强度减弱的作用。
F0/eF0eKf
则K= 1/τf，将其带入 Ft F0eKt
分析化学第11章--荧光分析法
第11章 荧光分析法
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： 基态分子 hv 激发单重态(s1*,s2*)
激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 磷光 系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁
a.振动驰豫(vibrational relexation):
处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。
2)电子能态的多重性：
M=2S+1
S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0
M=2S+1=1
对应基线单重态；
对于激发态
s1=1/2,s2=1/2,
S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2
NaO3S
N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠 f ＝0.03
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： 基态分子 hv 激发单重态(s1*,s2*)
激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 磷光 系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁
a.振动驰豫(vibrational relexation):
处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。
2)电子能态的多重性：
M=2S+1
S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0
M=2S+1=1
对应基线单重态；
对于激发态
s1=1/2,s2=1/2,
S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2
NaO3S
N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠 f ＝0.03
荧光分析法
四氯化碳的拉曼光与激发光波长相近，即与 荧光波长相差较大，对荧光检测干扰较小。
影响荧光强度的主要因素
是波长比入射光较 长的拉曼散射光。因为物质发射的荧光波长比 激发光（即入射光）波长长。
• 消除溶剂拉曼光干扰的方法： - 选择合适的溶剂
- 改变激发光波长，使拉曼光向短波方向移动 如硫酸奎宁的测定
1.荧光检测的基本原理
14
2.荧光的激发光谱和发射光谱
激发光谱（excitation spectrum)：固定测量波长， 将激发光的光源分光，测定不同波长的激发光照射 下所发射的荧光强度的变化，以IF —λ激发作图，便 可得到荧光物质的激发光谱。 发射光谱或荧光光谱（fluorescence spectrum)：固 定激发光波长和强度, 让物质发射的荧光通过单色 分光,以测定不同波长的荧光强度, 以IF—λ荧光作图 ，便可得到荧光物质的荧光光谱。
（四）、影响荧光强度的外部因素
温度
溶剂
酸度
01
02
03
荧光熄 灭剂
散射光
04
05
1. 温度的影响
• 随温度降低，荧光强度增加。如荧光素钠在 0℃以下，每降10℃荧光效率增加3％。-80 ℃ 时达到100％。
• 原因是温度升高，分子运动速度加快， 碰撞机率增加，使无辐射跃迁增加，因 而降低了荧光；
常见溶剂在不同激发光波长下的拉曼光波长
激发光 波长 248 水 271 溶剂拉曼光波长 乙醇 环己烷 267 四氯化碳 － 氯仿 －
267
313
365 405 436
350
416 469 511
344
405 459 500
344
408 458 499
荧光分析法
荧光分析法
荧光分析法是指利用某些物质被紫外光照射后处于激发态，激发态分子经历一个碰撞及发射的去激发过程所发生的能反映出该物质特性的荧光，可以进行定性或定量分析的方法。
由于有些物质本身不发射荧光（或荧光很弱），这就需要把不发射荧光的物质转化成能发射荧光的物质。
例如用某些试剂（如荧光染料），使其与不发射荧光的物质生成络合物，各种络合物能发射荧光，再进行测定。
因此荧光试剂的使用，对一些原来不发荧光的无机物质和有机物质进行荧光分析打开了大门，扩展了分析的范围。
第四章荧光分析法。
重态的最低振动能级。
内转换
振动弛豫
内转换
系间跨越
S2*
能
S1*
T2* T1*
量 吸 收
发 射
外转换
荧
发
射 振动弛豫 磷
光
光
S0 l 1
l 2 l 2
l3
（二）荧光的产生
5、外转换：激发分子与溶剂或其他溶质分子之间产生相互 作用而转移能量的非辐射跃迁。 外转换使荧光或磷光减弱或“淬灭”。 6、系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射 跃迁。
室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
三、荧光与分子结构的关系
（一）荧光效率 （二）荧光寿命 （三）分子结构与荧光的关系
电子激发态的多重态 M=2S+1
（二）荧光的产生
内转换
振动弛豫
内转换
系间跨越
S2*
S1*
T2*
能
T1*
量
发
发
吸
射
外转换
射
收
荧
磷 振动弛豫
光
光
S0 l 1
l 2 l 2
l3
（二）荧光的产生
处于激发态的分子是不稳定的，它可通过辐射跃迁和非辐射 跃迁的形式释放多余能量而返回基态。 辐射跃迁主要涉及荧光、延迟荧光、磷光发射。 无辐射跃迁指以热的形式释放多余的能量，包括振动弛豫、 内部能量转换、体系间跨越、外部能量转换。
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光
磷光 系间跨越 内转换 外转换 振动弛豫
（二）荧光的产生
1、荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态
（多为S1→S0跃迁），发射波长λ′2 的荧光。
第十四章荧光分析法
如果标准曲线通过零点，可用比例法进行 测定。配制一标准溶液，使其浓度在线性范 围内，测定荧光强度FS，然后在同样条件下 测定试样溶液的荧光强度FX。由标准溶液的 浓度CS和两种溶液的荧光强度比，求得试样 中荧光物质的浓度CX或含量。
3．解线性方程法
多组分混合物的荧光分析也可以象 吸收分光光度法一样利用荧光强度 的加和性质，采用解线性方程组的 方法、双波长及多波长等方法从混 合物中不经分离即可测得被测组分 的含量。
ln F0 t
Ft f
二、荧光强度与分子结构的关系
一个化合物能否产生荧光，荧光强度的大小， λex(max)和λem(max)的波长位置均与其分子 结构有关。下面简述影响分子荧光强弱的一 些结构规律。
(一) 跃迁类型 (二) 共轭效应
(三)刚性结构和共平面效应 (四) 取代基效应
三、影响荧光强度的外界因素
4．体系间跨越(intersystem crossing)
又称体系间交叉跃迁，指不同多线态间的无 辐射跃迁。如内转换一样，若两电子能态的 振动能级重迭，将会使这一跃迁几率增大。 图14-2中S→ T的跃迁即为体系间跨越。激发 单线态的最低振动能级同三线态的较高振动 能级重迭，因而发生电子自旋状态改变的体 系间跨越就有了较大的可能性。
分子所处的外界环境，如溶剂、温度、pH、 重原子、荧光熄灭剂等都会影响荧光效率， 甚至影响分子结构及立体构象，从而影响荧 光光谱和荧光强度。
(一) 溶剂的影响 (四) 氢键的影响 (二) 温度的影响 (五) 散射光的影响 (三) pH值的影响
(六)荧光熄灭剂(quenching medium) 的影响
1．直接荧光法 2．荧光衍生物法 3．化学引导荧光法 4．荧光熄灭法 5．胶束增敏荧光分析法
荧光分析法
e 2.3 ECl
2.3ECl (2.3ECl) 2 (2.3ECl) 3 1 1! 2! 3!
2.3ECl (2.3ECl) 2 (2.3ECl)3 F K I 0{1 [1 ]} 1! 2! 3! (2.3ECl) 2 (2.3ECl) 3 K I 0 [2.3ECl ] 2! 3!
影响荧光强度的主要因素
浓度：稀溶液，F∝c OH 酸度：
pH～1,有荧光
(εbc≤0.05)
O-
pH～13,无荧光
OH 无荧光
O有荧光
温度：t 低，φ增加。
溶剂：溶剂极性增大，荧光波长长移，荧光强度 增强。 温度：升高温度，增加非辐射跃迁的概率，荧光 效率降低。 表面活性剂：保护激发单重态的荧光物质，减少 非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。
荧光和磷光分析基本原理
1 荧光和磷光的产生
激发态分子返回基态的途径
振动弛豫(vibrational relexation) 内部能量转换(internal conversion)
荧光(fluorescence)发射
外部能量转换(external conversion)
体系间跨越(intersystem crossing)
吸收光谱、荧光光谱和磷光光谱
磷＞ 荧＞ 激
3 荧光效率
φ —荧光物质的荧光效率(量子产率)：
发射荧光的量子数 吸收激发光的量子数
荧光效率越高，辐射跃迁概率就越大，物质 发射的荧光也就越强。通常在0.1—1之间。
荧光效率(fluorescence efficiency) 荧光量子产率(fluorescence quantum yield)
2.3ECl (2.3ECl) 2 (2.3ECl) 3 1 1! 2! 3!
2.3ECl (2.3ECl) 2 (2.3ECl)3 F K I 0{1 [1 ]} 1! 2! 3! (2.3ECl) 2 (2.3ECl) 3 K I 0 [2.3ECl ] 2! 3!
影响荧光强度的主要因素
浓度：稀溶液，F∝c OH 酸度：
pH～1,有荧光
(εbc≤0.05)
O-
pH～13,无荧光
OH 无荧光
O有荧光
温度：t 低，φ增加。
溶剂：溶剂极性增大，荧光波长长移，荧光强度 增强。 温度：升高温度，增加非辐射跃迁的概率，荧光 效率降低。 表面活性剂：保护激发单重态的荧光物质，减少 非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。
荧光和磷光分析基本原理
1 荧光和磷光的产生
激发态分子返回基态的途径
振动弛豫(vibrational relexation) 内部能量转换(internal conversion)
荧光(fluorescence)发射
外部能量转换(external conversion)
体系间跨越(intersystem crossing)
吸收光谱、荧光光谱和磷光光谱
磷＞ 荧＞ 激
3 荧光效率
φ —荧光物质的荧光效率(量子产率)：
发射荧光的量子数 吸收激发光的量子数
荧光效率越高，辐射跃迁概率就越大，物质 发射的荧光也就越强。通常在0.1—1之间。
荧光效率(fluorescence efficiency) 荧光量子产率(fluorescence quantum yield)
荧光分析法
F
λem 单色器 λex 固定 λem
改变
检测器
2021/4/9
λ
21
荧光光谱具有以下特征： （1）荧光光谱的形状与激发波长无关
荧光发射通常发生于第一电子激发态的 最低振动能级，与激发至哪一个电子激发 态无关，所以荧光光谱的形态通常与激发 波长无关。
荧光光谱只有一个发射带
2021/4/9
22
（2）荧光光谱与激发光谱呈镜像关系
第二激发态
第一激发态
2021/4/9
电子能级
振动能级
9
特点：荧光的能量小于激发光能量。 荧光发射所需时间为10-9~10-7s。
2021/4/9
10
（4）外部能量的转移
激发态分子与溶剂分子及其它溶质分子之间 相互碰撞而失去能量，常以热能的形式放出。
常发生在第一激发单线态或第一激发三线态 的最低振动能级向基态转换的过程中
（6）磷光：经过体系间跨越的分子降至三线 态最低能级，跃迁至基态而发生的光。
电子能级
振动能级
2021/4/9
13
特点：（1）λ（磷光）>λ（荧光） （2）寿命10-4—10s （3）室温下溶液很少呈现磷光（需冷冻）
处于激发态的分子回基态的途径： ①发射荧光 ②发射磷光 ③内部能量转换 ④ 外部能量转换
外部能量转换可降低荧光强度，有时也称为 荧光猝灭或荧光熄灭。
2021/4/9
11
（5）体系间的跨越 激发态分子的电子发生自旋反转，其多重性发
生变化（激发单线态—激发三线态）
发生条件：物质中含有重原子如Br、I等
电子能级
振动能级
分子由激发单线态跨越到三线态后，荧光强度减弱
甚至熄灭。
荧光分析法
基态时分子中的电子对填充在能量最低的轨道，
且自旋相反，即总自旋量子数s为0
电子能级多重性：M＝2s+1 单重态S M＝1 自旋相反 三重态T M＝3 自旋相同
4
基态
被激发跃迁过程中：
通常电子不发生自旋方向的改变,电子对自旋相反， 电子发生自旋方向的改变,电子对自旋相同，总自旋
总自旋量子数s为0,处于激发单重态。
第十一章 荧光分析法
（Fluorescence）
1
分子发光（molecular luminescence）
某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后， 返回基态的过程中伴随发光的现象。
hγ
概述
M+ 能量 →M＊
M
2
分类
原子荧光 荧光 分子荧光 光致发光（PL） 紫外可见荧光 磷光 化学发光（CL） 红外荧光 X射线荧光 电致发光（EL） 生物发光（BL）
19
3）荧光光谱与激发光谱镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱
形状一样）成镜像对称关系
基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振 动能级分布类似；
20
镜像关系?
固定em=620nm 固定ex=290nm (MAX)
IF
4 3 2 1
4800 4400
1→ 4 1→ 3
S1
4000
44
4.胶束增敏荧光分析 当单体表面活性剂浓度增大到临界胶束浓度，
会缔合为球状胶束， 利用胶束溶液对荧光物质有
增溶、增敏和增稳的作用，对荧光物质进行保护
45
荧光分析法的应用 1.无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 2.生物与有机化合物的分析
第十二章荧光分析法(Fluorometry)
kF
+ kVR
+ kIC
kF + kISC
+ kEC
+ kP
❖ 凡使 kF 增加，使其它去活化常数降低的因素 均可增加荧光量子产率。
❖ kF通常由分子结构决定，而其它参数则由化学
环境和结构共同决定。
2020年7月11日星期六
16
※ 3、荧光产生的条件
❖ 产生并可观察到荧光的条件： 1）分子必须具有吸收一定频率紫外光的特定 结构； 2）物质吸收特征频率的辐射后，必须具有较 高的荧光效率
13
2020年7月11日星期六
14
二、荧光与分子结构的关系
1、荧光寿命：
❖ 去除激发光源后，分子荧光强度降低到最大荧光强度 的1/e所需的时间，用τf 表示。
❖ 根据指数衰减定律可求出荧光寿命：
Ft = F0e－Kt
若t = τ f ,则Ft = ( 1 / e )F0 ,K = 1 / τ f
2020年7月11日星期六
6
（3）外转换（External Conversion，EC）
❖ 受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换而使 荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭”或 “猝灭”。常发生在第一激发单重态或激发三重态的最 低振动能级向基态转换的过程中。
（4）系间跨跃（Intersystem Conversion，ISC）
基态：M=2S+1=1
激发态： S=0，M=2S+1=1 S=1，M=2S+1=3
S*1
T*1
2020年7月11日星期六
4
荧光和磷光产生示意图
2020年7月11日星期六
5
2. 去活化过程（Deactivation）
荧光分析法
荧光 分子光谱 发射光谱 10-8~10-10g/ml
高
可见紫外 分子光谱 吸收光谱 10-5~10-7g/ml
一般
返回
11.2 根本原理
11.2.1 分子荧光光谱的产生 11.2.2 激发光谱与发射光谱 11.2.3 分子构造与荧光的关系 11.2.4 影响荧光强度的外部因素
11.2.1 分子荧光光谱的产生
荧光强度F，以F-λex作图得荧光物质的激发光谱。 发射光谱：〔荧光光谱〕固定激发光波长λex，依次改变发射
波长λem，测荧光强度F，以F-λem作图得荧光光谱。
➢激发光谱与荧光光谱上的λmax是定性定量的根据
1. 荧光光谱的特点〔重点〕
〔1〕斯托克斯位移：荧光发射波长总是大于激发波长。 原因：无辐射跃迁能量损失，包括振动弛豫和内部能量转换
续前
〔3〕荧光光电计与荧光分光光度计的比较
激发光源 激发单色器 发射单色器
检测器
样品池
光电荧光计 荧光分光光度计
汞灯
氙灯
第一滤光片
光栅
第二滤光片
光栅
光电倍增管
石英、玻璃池（低荧光的玻璃）
返回
小结： 掌握
根本概念：荧光、振动弛豫、内部能量转换、 外部能量转换、体系间跨越及磷光；激发光谱 与荧光光谱
发射波长
激发波长
激发光谱(excitation spectrum)： F~ ex 荧光光谱(fluorescence spectrum)： F~ em
激发光〔谱二：〕〔与激吸发收光光谱谱类与似荧〕表光示光不谱同激发波长的辐射引起
物质发射某一波长荧光所得的光谱。 方法：固定发射光波长λem，依次改变激发波长λex，测
特点：发生在非常靠近的两个电子能级间，他们的振动能级有 重叠；时间约10-1～10-13秒。
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404nm
f
0.11
0.29
0.36
CH2OCOCH3
维生素A
lex＝327nm， lem＝510nm
刚性平面结构
可降低化学键的旋转，增加共 轭健的共平面性，使荧光效率增加。
取代基
第一类：增加分子的电子共轭程度，
使荧光效率提高，荧光波长增长。如
-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-CN。
影响荧光强度的外部因素
1.温度 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，
荧光效率降低。
2.溶剂 溶剂的极性、氢键、配位键的形成、粘度都将 使化合物的荧光发生变化。极性、粘度增强，荧光 波长长移，强度增加。
3.酸度
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格 控制。不同荧光物质有其最适宜的pH值范围。
影响荧光强度的外部因素 4.荧光熄灭剂：重金属离子、卤素离子、 氧分子、硝基化合物、重氮化合物、 羰基和羧基化合物。 5.散射光：注意溶剂的拉曼散射的影响。 瑞利光（Reyleigh scattering light) 拉曼光(Raman scattering light) 波长比入射光更长的拉曼光 ，对荧光测定的 干扰更大。
定量分析方法
比例法
Fs F0 Cs Fx F0 C x Cs Fx F0 Cx Fs F0
联立方程法
荧光计
滤光片荧光计 滤光片-单色器荧光计 荧光分光光度计
氙灯 高压汞灯 染料激光 器
荧光
光 源
第一单色器 或滤光片
激发
记录仪
光电 倍增管
样品池
第二单色器 或滤光片
检测器
荧光法应用
1.无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
电子能级的多重态
电子能级的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1) M=1，单重态，用S表示（single state） M＝3，三重态，用T表示（triplet state）
↓
能 量
↑ ↑
禁阻跃迁
↑↓
单重基态
↑
激发单重态
激发三重态
内转换 S2
振动弛豫
(10-12 s)
体系间跨越
荧光分析新技术
激光荧光分析 时间分辨荧光分析 同步荧光分析 胶束增敏荧光分析
第二类：减弱分子的电子共轭程度，使荧 光减弱甚至熄灭。如：-COOH、-NO2、
-C＝O、-X、-NO、-SH。 第三类： 对电子共轭作用较小，对荧光的 影响不明显。如：-R、-SO3H、-NH3+。
荧光试剂
能与弱荧光物质或无机离子反应生
成强荧光物质的试剂。可扩大荧光分析
法的应用范围。
荧光胺：测定脂肪伯胺和芳香伯胺。 邻苯二甲醛（OPA）：测定伯胺、α-氨基酸。 丹酰氯:测定含有伯、仲胺基及酚基的生物碱 测定无机离子的荧光试剂
荧光法应用
2. 有机化合物的荧光分析 荧光分析法主要应用于有机物、生化 物质、药物的测定（200多种），包括： 有机化合物如：多环胺类、萘酚类、吲哚类、多环 芳烃、氨基酸、蛋白质等。 药物如：吗啡、喹啉类、异喹啉类、麦角碱、麻黄 碱等。 维生素如：维生素A、B1、B2、B6、B12、E、C、 叶酸 等。 甾体、抗生素、酶、辅酶 等。
S1
能 量 吸 收 T1 发 射 荧 光
(10-8 s)
外转换
发 射 磷 光
(>10-3 s)
S0
l1
l2
l 2
l3
ห้องสมุดไป่ตู้
激发态→基态 的能量传递途径
传递途径
辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
磷光
体系间跨越 内转换 外转换 振动弛豫
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大。 荧光：10-7～10 -9 s, 第一激发单重态的最低振动能级→基态 磷光：10-4～10s， 第一激发三重态的最低振动能级→基态
浓度很低时，将括号项近似处理后：
F = 2.3 K’ I0 cl = Kc
注意：当cl >0.05时，F与C不成正比。
定量分析方法
校正曲线法 配制标准溶液系列，分别测定系列中各 溶液的荧光强度F，作校正曲线F-C图，根据 待测溶液的Fx值，在图中求出待测液的Cx。若 空白溶液的荧光强度不能校正到0，则须作 （F-F0）-C图。
2008年诺贝尔化学奖 －绿色荧光蛋白（GFP）
green fluorescence protein
科学家在线形虫体内植入绿色荧光蛋白质
GFP标记的微管
荧光与荧光分析法 （fluorescene and fluorometry) 荧光（fluorescene): 物质分子接受光子能量被激发后，从激 发态的最低能级返回基态时发射出的光。 荧光分析法（fluorometry)： 根据物质的荧光谱线位置及其强度进行 物质鉴定和含量测定的方法。选择性好，灵 敏度高，检测限达10-10g/ml,甚至10-12g/ml。
3.镜像关系
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱成镜像对称 关系。
n m 蒽的激发光谱（虚线）和荧光光谱（实线）
b2 b 1 b0
V=2 V=1 V=0
E2
E1
S1*
V=2 V=1 V=0
E2
E1 c0 c1 c2
S0
F
c0 b1 b0 c 1 b2 c2
解镜 释像 示关 意系
200
250
300
激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluorescence spectrum
1.荧光(磷光)的激发光谱： 固定测量波长 , 化合物发射的荧光 ( 磷光 ) 强度与照射光波长的关系曲线。 2.荧光(磷光)的发射光谱：固定激发光波长, 化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波 长关系曲线。
350
400
450
500 n
荧光的产生与分子结构的关系
分子产生荧光必须具备的条件
1. 具有强的可见紫外吸收(长共轭分子）
2. 具有一定的荧光效率（f）（刚性平面分子）
发射荧光的光子数 f 吸收激发光的光子数
长共轭结构
苯
萘
蒽
lex 205nm
lem 278nm
286nm
321nm
356nm
F
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200
260
320
380
440
500
560
620 nm
室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
GFP的激发光谱与荧光光谱
激发光谱与发射光谱的关系 1.Stokes位移 荧光发射波长大于激发波长的现象。
内转换和振动弛豫是主要原因。
2.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能 量,产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最 低振动能级再跃迁回到基态，产生一个发射带。
自学思考题
6.测定某物质荧光时可在环己烷或四氯化碳 溶剂中进行。在365nm的激发光下，环己 烷与四氯化碳的拉曼散射光的波长分别为408nm和 375nm，若从测定荧光准确度方面考虑，选哪个溶 剂较好？ 7. 荧光定量分析法的定量关系式是什么？有何条件？ 8.请设计两种方法测定Al3+的含量。（一种化学分 析法，一种仪器分析法） 9.查阅文献举出一个荧光探针的应用例子（做ppt）
a
b
a：硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光 b：0.1mol/L硫酸溶液在不同波长下的拉曼散射光
溶液的荧光测定
入射光 I0
透射光 I
荧光 F
定量依据
荧光强度 F正比于吸收的光强度Ia 和荧光量子效率 ：
F = K’Ia
由朗伯-比耳定律： Ia = I0(1-10-cl )
F = K’ I0(1-10-cl ) = K’ I0(1-e-2.3cl )
第十一章
荧光分析法 （fluorometry)
2016/2/3
自学思考题与课堂讨论题 1.分子处于受激态后，回到基态的过程 有哪些方式？分子荧光是如何发生的？ 2.试从能级跃迁类型、光谱类型、灵敏度等 方面比较可见紫外光谱与分子荧光光谱的 区别和联系。 3.荧光发射光谱有哪些特征？ 4.何谓荧光效率？哪些分子结构的物质有较 高的荧光效率？ 5.影响荧光强度的外部因素有哪些？
f
0.11
0.29
0.36
CH2OCOCH3
维生素A
lex＝327nm， lem＝510nm
刚性平面结构
可降低化学键的旋转，增加共 轭健的共平面性，使荧光效率增加。
取代基
第一类：增加分子的电子共轭程度，
使荧光效率提高，荧光波长增长。如
-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-CN。
影响荧光强度的外部因素
1.温度 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，
荧光效率降低。
2.溶剂 溶剂的极性、氢键、配位键的形成、粘度都将 使化合物的荧光发生变化。极性、粘度增强，荧光 波长长移，强度增加。
3.酸度
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格 控制。不同荧光物质有其最适宜的pH值范围。
影响荧光强度的外部因素 4.荧光熄灭剂：重金属离子、卤素离子、 氧分子、硝基化合物、重氮化合物、 羰基和羧基化合物。 5.散射光：注意溶剂的拉曼散射的影响。 瑞利光（Reyleigh scattering light) 拉曼光(Raman scattering light) 波长比入射光更长的拉曼光 ，对荧光测定的 干扰更大。
定量分析方法
比例法
Fs F0 Cs Fx F0 C x Cs Fx F0 Cx Fs F0
联立方程法
荧光计
滤光片荧光计 滤光片-单色器荧光计 荧光分光光度计
氙灯 高压汞灯 染料激光 器
荧光
光 源
第一单色器 或滤光片
激发
记录仪
光电 倍增管
样品池
第二单色器 或滤光片
检测器
荧光法应用
1.无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
电子能级的多重态
电子能级的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1) M=1，单重态，用S表示（single state） M＝3，三重态，用T表示（triplet state）
↓
能 量
↑ ↑
禁阻跃迁
↑↓
单重基态
↑
激发单重态
激发三重态
内转换 S2
振动弛豫
(10-12 s)
体系间跨越
荧光分析新技术
激光荧光分析 时间分辨荧光分析 同步荧光分析 胶束增敏荧光分析
第二类：减弱分子的电子共轭程度，使荧 光减弱甚至熄灭。如：-COOH、-NO2、
-C＝O、-X、-NO、-SH。 第三类： 对电子共轭作用较小，对荧光的 影响不明显。如：-R、-SO3H、-NH3+。
荧光试剂
能与弱荧光物质或无机离子反应生
成强荧光物质的试剂。可扩大荧光分析
法的应用范围。
荧光胺：测定脂肪伯胺和芳香伯胺。 邻苯二甲醛（OPA）：测定伯胺、α-氨基酸。 丹酰氯:测定含有伯、仲胺基及酚基的生物碱 测定无机离子的荧光试剂
荧光法应用
2. 有机化合物的荧光分析 荧光分析法主要应用于有机物、生化 物质、药物的测定（200多种），包括： 有机化合物如：多环胺类、萘酚类、吲哚类、多环 芳烃、氨基酸、蛋白质等。 药物如：吗啡、喹啉类、异喹啉类、麦角碱、麻黄 碱等。 维生素如：维生素A、B1、B2、B6、B12、E、C、 叶酸 等。 甾体、抗生素、酶、辅酶 等。
S1
能 量 吸 收 T1 发 射 荧 光
(10-8 s)
外转换
发 射 磷 光
(>10-3 s)
S0
l1
l2
l 2
l3
ห้องสมุดไป่ตู้
激发态→基态 的能量传递途径
传递途径
辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
磷光
体系间跨越 内转换 外转换 振动弛豫
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大。 荧光：10-7～10 -9 s, 第一激发单重态的最低振动能级→基态 磷光：10-4～10s， 第一激发三重态的最低振动能级→基态
浓度很低时，将括号项近似处理后：
F = 2.3 K’ I0 cl = Kc
注意：当cl >0.05时，F与C不成正比。
定量分析方法
校正曲线法 配制标准溶液系列，分别测定系列中各 溶液的荧光强度F，作校正曲线F-C图，根据 待测溶液的Fx值，在图中求出待测液的Cx。若 空白溶液的荧光强度不能校正到0，则须作 （F-F0）-C图。
2008年诺贝尔化学奖 －绿色荧光蛋白（GFP）
green fluorescence protein
科学家在线形虫体内植入绿色荧光蛋白质
GFP标记的微管
荧光与荧光分析法 （fluorescene and fluorometry) 荧光（fluorescene): 物质分子接受光子能量被激发后，从激 发态的最低能级返回基态时发射出的光。 荧光分析法（fluorometry)： 根据物质的荧光谱线位置及其强度进行 物质鉴定和含量测定的方法。选择性好，灵 敏度高，检测限达10-10g/ml,甚至10-12g/ml。
3.镜像关系
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱成镜像对称 关系。
n m 蒽的激发光谱（虚线）和荧光光谱（实线）
b2 b 1 b0
V=2 V=1 V=0
E2
E1
S1*
V=2 V=1 V=0
E2
E1 c0 c1 c2
S0
F
c0 b1 b0 c 1 b2 c2
解镜 释像 示关 意系
200
250
300
激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluorescence spectrum
1.荧光(磷光)的激发光谱： 固定测量波长 , 化合物发射的荧光 ( 磷光 ) 强度与照射光波长的关系曲线。 2.荧光(磷光)的发射光谱：固定激发光波长, 化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波 长关系曲线。
350
400
450
500 n
荧光的产生与分子结构的关系
分子产生荧光必须具备的条件
1. 具有强的可见紫外吸收(长共轭分子）
2. 具有一定的荧光效率（f）（刚性平面分子）
发射荧光的光子数 f 吸收激发光的光子数
长共轭结构
苯
萘
蒽
lex 205nm
lem 278nm
286nm
321nm
356nm
F
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200
260
320
380
440
500
560
620 nm
室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
GFP的激发光谱与荧光光谱
激发光谱与发射光谱的关系 1.Stokes位移 荧光发射波长大于激发波长的现象。
内转换和振动弛豫是主要原因。
2.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能 量,产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最 低振动能级再跃迁回到基态，产生一个发射带。
自学思考题
6.测定某物质荧光时可在环己烷或四氯化碳 溶剂中进行。在365nm的激发光下，环己 烷与四氯化碳的拉曼散射光的波长分别为408nm和 375nm，若从测定荧光准确度方面考虑，选哪个溶 剂较好？ 7. 荧光定量分析法的定量关系式是什么？有何条件？ 8.请设计两种方法测定Al3+的含量。（一种化学分 析法，一种仪器分析法） 9.查阅文献举出一个荧光探针的应用例子（做ppt）
a
b
a：硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光 b：0.1mol/L硫酸溶液在不同波长下的拉曼散射光
溶液的荧光测定
入射光 I0
透射光 I
荧光 F
定量依据
荧光强度 F正比于吸收的光强度Ia 和荧光量子效率 ：
F = K’Ia
由朗伯-比耳定律： Ia = I0(1-10-cl )
F = K’ I0(1-10-cl ) = K’ I0(1-e-2.3cl )
第十一章
荧光分析法 （fluorometry)
2016/2/3
自学思考题与课堂讨论题 1.分子处于受激态后，回到基态的过程 有哪些方式？分子荧光是如何发生的？ 2.试从能级跃迁类型、光谱类型、灵敏度等 方面比较可见紫外光谱与分子荧光光谱的 区别和联系。 3.荧光发射光谱有哪些特征？ 4.何谓荧光效率？哪些分子结构的物质有较 高的荧光效率？ 5.影响荧光强度的外部因素有哪些？