01【课堂笔记】《蛋白质与酶工程》-酶的分离与纯化02部分
蛋白质和酶的分离与纯化
蛋白质和酶的分离纯化及鉴定蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。
从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。
要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。
蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。
要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。
目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。
一、质分离纯化的一般原则1. 原料的选择原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。
蛋白分布：体液、组织、细胞定位2. 破碎方法：(1) 机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。
如：捣碎法、研磨、匀桨法(2) 物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。
如：反复冻融、渗透压、超声破碎(3) 化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法.如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween）(4) 酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法4. 先粗后细，分级分离粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。
如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。
精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。
5. 避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等）二、常用的蛋白质的分离纯化技术可以根据各种蛋白质的结构、理化性质不同设计分离方法。
（一）根据蛋白质的溶解度不同进行分离1. 蛋白质盐析蛋白质属于生物大分子之一，分子量从1万至100万之巨，其分子的直径可达1-100nm，为胶粒范围之内。
蛋白质的表面电荷和水化膜是其主要的稳定性因素。
蛋白质与酶的分离与纯化
蛋白质与酶的分离与纯化摘要本文主要介绍蛋白质与酶的分离与纯化方法，包括一些常用的技术和步骤。
首先介绍蛋白质和酶的定义和特性，然后探讨蛋白质与酶分离和纯化的重要性。
接着分析了三种常用的分离与纯化方法，包括盐析、层析和电泳。
最后总结了每种方法的特点和适用范围，并对未来的研究方向进行了展望。
1. 引言蛋白质和酶是生物体内最重要的分子之一，参与了生命体的许多重要生物学过程。
为了研究和了解蛋白质和酶的功能和结构，分离和纯化方法至关重要。
2. 蛋白质与酶的定义和特性蛋白质是由氨基酸残基组成的大分子化合物，具有多种功能，如催化反应、传递信号和提供结构支持等。
酶是一类特殊的蛋白质，能够催化生物体内的化学反应。
3. 蛋白质与酶分离和纯化的重要性蛋白质与酶的分离和纯化是研究其功能、结构和性质的基础。
只有纯化后的蛋白质和酶才能够进行进一步的研究和分析。
4. 盐析方法盐析是利用蛋白质和酶与盐的相互作用进行分离的方法。
通过控制溶液中的盐浓度，可以使蛋白质和酶从溶液中沉淀出来。
5. 层析方法层析是利用分离剂在固定的层析材料上进行分离的方法。
根据蛋白质和酶的性质和大小，可以选择不同类型的层析材料进行分离。
6. 电泳方法电泳是利用蛋白质和酶在电场中的迁移率差异进行分离的方法。
根据蛋白质和酶的电荷、大小和形状等特性，可以选择不同类型的电泳方法进行分离与纯化。
7. 方法比较与应用盐析、层析和电泳方法各有其优势和适用范围。
根据具体的实验目的和条件，可以选择合适的方法进行蛋白质与酶的分离与纯化。
8. 未来展望随着科学技术的不断发展，蛋白质与酶的分离与纯化方法也在不断改进和创新。
未来的研究方向包括开发更高效、更精确的方法和技术，以及应用新的纯化剂和材料等。
结论蛋白质与酶的分离与纯化是研究其结构和功能的基础，对于深入理解生物体内重要的生物学过程具有重要意义。
盐析、层析和电泳等方法可以有效地分离和纯化蛋白质与酶，并根据实验的需要选择合适的方法。
蛋白质与酶工程知识点(完)---仅供参考
1、易错PCR:通过调整反应条件来使PCR扩增过程中复制错配率增加，在目的基因中随机引入突变，继而获得蛋白质分子的随机突变体* 提高镁离子浓度或加入锰离子* 降低体系中一种的dNTP浓度（至少5-10%）* 运用低保真度DNA聚合酶* 增加DNA聚合酶的浓度属于无性进化：单一基因内进行遗传突变，费力、耗时，多用于小片段（800bp以下）2、酶的概念：酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物（substrate）具有高效催化作用的生大分子，包括蛋白质和核酸3、辅酶 :与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去(NAD+)。
辅基 :与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去(FAD、FMN)酶的活性中心：或称活性部位，指必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。
4、抗体酶或催化抗体：是具有催化功能的抗体。
本质：免疫球蛋白，即具有催化作用的免疫球蛋白5、酶促反应特点：①酶促反应具有极高的效率②酶促反应具有高度的特异性：绝对特异性、相对特异性、立体结构特异性③酶促反应的可调节性：对酶量的调节，对酶活性的调节6、诱导契合假说：酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。
这一过程称为酶-底物结合的诱导契合假说。
7、底物浓度对反应速度的影响：①当底物浓度较低时：反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。
②随着底物浓度的增加：反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。
③当底物浓度高达一定程度：反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应8、Km与Vmax的意义9、不可逆性抑制作用：抑制剂通常以共价键与酶活性中心或活性中心以外的必需基团相结合，使酶失活。
可逆性抑制作用：抑制剂通常以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。
类型：竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制。
三种抑制剂的特点10、酶的调节：酶活性的调节（快速调节）①酶原与酶原的激活②变构（別构）酶③酶的共价修饰调节酶含量的调节（缓慢调节）①酶蛋白合成的诱导和阻遏②酶降解的调控11、酶原激活的意义避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。
2019-2020学年生物技术专业《蛋白质与酶工程》第1章 绪论
高级结构的物理测定
（X射线衍射、核磁共振、冷冻电子显微学）
3.蛋白质结构和功能的设计和预测
预测方法：比较建模法、折叠识别法、二级 结构预测法、从头预测法等
4.通过基因重组改造或创造蛋白质
从预期的蛋白质功能出发→推测应有的氨基 酸序列→找到相对应的RNA序列→找到相对应的 DNA序列，进行基因工程学研究与改进。
紫膜
每个细菌视紫红质分子由248个氨基酸残基组成， 其分子量为26KD。每个细菌视紫红质结合一个生色 团视黄醛，位于216位的赖氨酸上，处于靠近肽链 C 端细胞膜内侧。
这种晶格结构排列在生物膜中很独特，增加了 膜结构的稳定性，也有利于进行结构分析，使其成为 目前生物膜结构研究中最为清楚的膜蛋白之一。
（2）DNA改组技术
是体外同源重组的一种再组装PCR技术。是将 一群密切相关的序列通过酶随机切成许多片段，通 过自身引导PCR，将改组的模板，多次筛选直到获得性状较为 满意的突变体。
（3）体外定向进化技术
又称分子进化，是在实验室模拟自然进化机 制，通过易错PCR等方法，对编码酶的基因进行随 机诱变，再通过高通量筛选或选择方法定向选择出 性能更加优良的酶或创造出自然界所没有的且就有 优良性质的酶。
应用前景：纳米生物材料、生物芯片、光信息存储等。
第二节 蛋白质与酶工程的 研究内容
一、蛋白质工程的研究内容 1. 蛋白质的分离纯化研究 2. 蛋白质改性研究 3. 蛋白质多肽应用研究 4. 蛋白质固定化研究（固定化酶、生物传感器、组织工程） 5. 蛋白质结构分析、功能设计和预测 6. 蛋白质的光电化学研究
血红蛋白-亚基第6位与HbA的区别
一、 蛋白质工程的内涵 1.蛋白质的分离纯化技术 2.蛋白质结构和功能的分析 3.蛋白质结构和功能的设计和预测 4.通过基因重组改造或创造蛋白质 5.蛋白质分子识别 6.蛋白质光电特性利用工程
酶工程课件笔记整理
抗生素）
菌种纯化：平板划线法，稀释法
产酶性能测定：包括初筛和复筛，初筛是从已分离出来的菌
种中挑出包含目的酶的菌株，复筛是在初筛的基础上筛选产
酶量高、性能更符合要求的菌株。初筛要求检出方法快速、
简便；复筛则要求测定方法相对地精确。
酶活检测定义:是对酶功能的检测.
酶活检测是探测酶催化反应的化学机理,并使其可视化.如光信 号,底物颜色变化,或者是生物选择. 所得即所筛! 笔记：一微生物菌种的分离：1含菌样品的收集 2富集培养 3菌种纯化 二 微生物菌种的筛选：1.初筛 2.复筛 酶工程的四个目标：认识酶，改造酶，创造酶， 二、发酵工艺条件及控制 • 1.酶的发酵生产要求 • ①性能优良菌种（产率，稳定性，发酵周期，营养要求，副产 物，安全性） • ②满足菌种生长需求(菌体是物质基础）； • ③满足菌种产酶需求（不同条件：温度pH等）。 • 2．酶发酵生产的工艺流程 • 保藏菌种（方法）菌种活化（复壮）菌种扩大培养发酵分离纯化 酶 发酵过程中培养基pH的变化由菌种的特性、培养基组分、发酵条件等 决定，引起pH变化的主要原因：微生物对培养基营养成份的利用和代 谢产物的积累。
适用性
吸附法 物理吸 附法 容易 弱
易流失 可能 低 不变
小
广泛
包埋法
离子键 格子型（凝
法
胶型）可能 小 不
小
高
不可能 低 小分子 （不）
大
广泛 小分子底物
共价结 微胶囊型 合
交联法
较难
难
强
强
强
强
高
低
不 低 小分子 （不）
不 高
可变
大
较大
小分子底 物
较广
中等 不 中等 可变
02【课堂笔记】《蛋白质与酶工程》-酶的分离与纯化02部分-蛋白质的结构解析与序列测定01部分
第一章酶的分离提取与纯化1.1离心分离和层析分离1.1.1酶的提取方法离心是利用离心机旋转所产生的的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异，进行分离浓缩和提纯生物样品的一种方法。
离心分离时，要根据待分离物质以及杂志的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。
1.1.1.1离心机的种类与用途常速离心机，高速离心机，超速离心机1)常速离心机：转速<8000r/min用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣及粗结晶等较大颗粒2)高速离心机：转速：1~2.5*104r/min用途：分离各种沉淀物、细胞碎片及较大的细胞器3)超速离心机：转速：2.5~12*104r/min用途：用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒的分离纯化1.1.1.2离心方法差速离心，密度梯度离心，等密度梯度离心1)差速离心：原理：是采用不同的离心速度和离心时间，是沉降速度不同的颗粒分不分离的方法。
用途：分离沉降系数相差较大的蛋白质分子2)密度梯度离心原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
常用介质：蔗糖、甘油3)等密度梯度离心：原理：当待分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，不同浮力密度的颗粒在离心力作用下一直移动到与各自浮力密度相等的位置，形成区带。
介质：铯盐1.1.1.3层析分离技术又称色谱技术，是一种物理的分离方法。
利用混合物中的各组分的物理化学性质（分子的大小和形状，分子极性，吸附力，分子亲和力）的不同，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（固定相），另一个相则流过固定相（流动相）并使各组分以不同速度一定，从而达到分离根据分离原理分类吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等1)吸附层析原理：是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合物中各组分分离的方法。
2)分配层析原理：在一个有两相同时存在的溶剂系统中，根据不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。
蛋白质与酶工程 酶的提取分离和纯化
(1)离心 (2)透析 (3)凝胶过滤 (4)超过滤 2、基于电荷 (1) 离子交换色谱 (2) 电泳 (3) 等电聚焦
3、基于溶解度 改变pH、离子强度、介电常数等实现的
沉淀分离： (1) 盐析法 (2) 复合沉淀法 (3) 有机溶剂沉淀法 (4) 等电点沉淀法 (5) 选择性变性沉淀法
环、脂肪酸氧化、脂肪酸合成酶以及蛋白质合成、DNA聚 合酶、RNA聚合酶等
④高尔基体：多糖、核蛋白粘液生成酶 ⑤溶酶体：各种水解酶等 ⑥叶绿体：参与光合作用形成ATP、NADPH有关的酶
类、与暗反应有关的酶系
线粒体主要酶的分布（约有120种酶）
部
位
酶的名称
单胺氧化酶、犬尿氨酸羟化酶、NADH-细胞色素C还原酶、
1-2 提取纯化之目的 1)酶催化功能的应用 2)酶学研究
酶的结构、功能、催化机制、催化动力学 酶的生物合成及其调控规律等
1-3 纯化的必要性 1)生物细胞中同时存在多种多样的酶 2)多酶可能作用于同一个底物 3)酶在生物细胞中的分布并不是均一的
二、酶的提取（extraction)
2-1 了解所分离酶在细胞中的分布 1、细胞外酶：由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用
蛋白质与酶工程 酶的提取分离和
纯化
酶的提取、分离和纯化
一、概述 二、酶的提取 三、酶的分离纯化 四、酶的结晶 五、浓缩与干燥 六、酶纯化步骤的设计及评价
一、概述
1-1 酶提取与分离纯化的定义 将酶从细胞或其酶的技术 过程
*酶的纯化程度根据需要而定 *纯化方法多种多样，为获得较好的效 果往往是2种或2种以上联合应用
外
膜 脂类代谢有关的酶（酰基辅酶A合成酶、脂肪酸激酶等）
特征酶：单胺氧化酶
06 第四章 酶的分离纯化2思维导图
结晶
盐析结晶 有机溶剂结晶 透析平衡结晶 等电结晶
浓缩与干燥
真空干燥 冷冻干燥 喷雾干燥 气流干燥 吸附干燥
利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子亲和力不同而使组分分离 阳离子交换剂、阴离子交换剂、不同离子对离子交换剂的亲和力 操作过程：预处理、装柱、上柱、洗脱收集、再生 使用多孔凝胶，利用流动相中所含各种组分相对分子质量不同而使各组分分离 葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 操作过程：装柱、上样、洗脱、再生 利用生物分子与配基之间所具有的可逆的亲和力，使生物分子分离纯化 将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析特性结合在一起，实现组分分离
酶按照电荷性质不同各自向着与其等电点相等的pH处移动聚焦，从而彼此分离
等电聚焦电泳
分辨率高，区带越来越窄，样品可加在任意部位，可分离低浓度样品，可准确测定等电 点
电泳过程要求无盐溶液，在等电点时溶解度低或可能变性的组分不适用
萃取分离
有机溶剂萃取 双水相萃取
超临界萃取
反胶束萃取
利用待分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术 超临界流体密度接近液体、黏度接近气体，适于作为萃取溶剂 等温变压流程、等压变温流程、等温等压与膜分离
非膜过滤
粗滤 微滤
膜过滤
加压膜分离
电场膜分离 透析
微滤 超滤 反渗透
层析分离
吸附层析 分配层析 离子交换层析
凝胶层析 亲和层析 聚焦层析
利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离 溶剂洗脱法、置换洗脱法、前缘洗脱法 吸附剂与洗脱剂的选择 利用各组分在两相中的分配系数不同而使各组分分离 纸层析、薄层层析
电泳分离
凝胶孔径、凝胶强度、聚合时间
常规PAGE、浓度梯度PAGE、SDS-PAGE
酶工程 第四章酶的分离纯化 第二节酶的提取
第二节 酶的提取
3.提取液的体积 提取液的用量增加，可提高提取率。但是过量的提取 液，使酶浓度降低，对进一步的分离纯化不利。故提取液 的用量一般为含酶原料体积的3～5倍。可一次提取，也可 分几次提取，若辅以缓侵搅拌，则可提高提取率。 4.添加保护剂 在酶提取过程中，为了提高酶的稳定性，防止酶变性 失活，可以加入适量的酶作用底物，或其辅酶，或加入某 些抗氧化剂等保护剂。
第二节 酶的提取
4.有机溶剂提取 有些与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基团较多 的酶，不溶或难溶于水、稀酸、稀碱和稀盐溶液中，需用 有机溶剂提取。常用的有机溶剂是与水能够混溶的乙醇、 丙酮、丁醇等。其中丁醇对脂蛋白的解离能力较强，提取 效果较好，已成功地用于琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、 胆碱酯酶等的提取。
第二节 酶的提取
一、酶提取的主要方法
根据酶提取时所采用的溶剂或溶液的不 同，酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸 溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。
第二节 酶的提取
1.盐溶液提取
大多数酶溶于水，而且在一定浓度的盐存在条件下， 酶的溶解度增加，这称之为盐溶现象，然而盐浓度不能太 高，否则溶解度反而降低，出现盐析现象。所以一般采用 稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度一般控制在0.02～ 0.5mol/L的范围内。例如，用固体发酵生产的麸曲中的 α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15mo1/L的氯 化钠溶液或0.02～0.05mol/L的磷酸缓冲液提取；酵母醇 脱氢酶用0.5～0.6mol／L的磷酸氢二钠溶液提取；6-磷酸 葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L的碳酸钠提取；枯草杆菌碱性磷 酸酶用0.1mol/L的氯化镁提取等。有少数酶，如霉菌产生 的脂肪酶，用清水提取比盐溶液提取的效果较好。
《酶工程》课件-酶的提取与分离纯化
01
02
03
04
低温保存
将酶保存在低温条件下，如冰 箱或冰柜中，以降低酶的活性
损失。
添加稳定剂
在酶溶液中添加稳定剂，如糖 、甘油等，以增加酶的稳定性
。
真空干燥
将酶进行真空干燥处理，制成 干粉或结晶，以便长期保存。
调节pH值
通过调节酶溶液的pH值，可 以稳定酶的构象，降低酶的失
活速率。
实验操作中的安全防护措施
速率，从而计算酶活性。
荧光法
利用荧光物质作为底物，经酶 催化后产生荧光，通过测量荧 光强度变化来检测酶活性。
化学发光法
利用化学发光物质作为底物， 经酶催化后产生发光，通过测 量发光强度变化来检测酶活性 。
放射性同位素标记法
利用放射性同位素标记的底物 ，经酶催化后测量放射性强度
变化来检测酶活性。
酶的保存方法
回收率评估
计算分离纯化过程中酶的回收率，评估实验效率 和经济性。
活性评估
通过测定酶的活性，比较分离纯化前后的变化， 评估分离纯化的效果。
稳定性评估
比较分离纯化前后的酶在不同条件下的稳定性， 评估分离纯化的效果。
03
酶的活性检测与保存
酶活性检测的方法
比色法
通过酶催化特定底物反应产生 有色产物，通过比色测定反应
确保实验操作场所的清 洁和卫生，避免污染。
在操作过程中要轻柔， 避免剧烈搅拌或晃动， 以免酶失活。
注意控制实验温度和 pH值等参数，确保酶 的稳定性和活性。
在分离纯化过程中，要 密切关注实验进程，及 时处理通过电泳、质谱等技术手段检测酶的纯度，确保 达到实验要求。
佩戴防护眼镜和实验服
在进行实验操作时，务必佩戴防护眼 镜和实验服，以防止试剂溅出伤人和 避免污染衣物。
《食品生物技术》课程笔记
《食品生物技术》课程笔记第一章：绪论一、食品生物技术的基本概念1. 定义：食品生物技术是指应用生物学、分子生物学、生物化学、微生物学、遗传学等生命科学的基本原理，结合工程学、信息学等学科的方法，对食品原料、生产过程、产品进行科学研究和工程技术改造的技术领域。
2. 范围：食品生物技术的研究和应用范围广泛，主要包括以下几个方面：- 基因工程：通过基因克隆、基因转移等技术，对食品生物的遗传特性进行改造。
- 细胞工程：利用细胞培养、细胞融合等技术，进行细胞水平的操作和改造。
- 蛋白质工程：设计和改造蛋白质，提高其功能性和稳定性。
- 酶工程：研究和应用酶在食品加工中的作用，提高酶的效率和稳定性。
- 发酵工程：利用微生物发酵生产食品和食品添加剂。
3. 特点：- 科学性：基于严谨的科学原理和方法。
- 创新性：不断推动食品产业的技术创新。
- 安全性：关注食品安全，确保生物技术产品的安全性。
- 环保性：减少污染，提高资源利用效率。
二、传统食品生物技术与现代食品生物技术1. 传统食品生物技术：传统食品生物技术主要包括自然发酵、选种育种、食品加工等基于经验的技术。
这些技术历史悠久，但通常生产效率较低，产品品质不稳定。
2. 现代食品生物技术：现代食品生物技术以分子生物学为基础，采用基因工程、细胞工程、蛋白质工程等高新技术，具有以下特点：- 高效性：能够大幅度提高食品生产效率。
- 精确性：能够精确改造生物体的特定性状。
- 可控性：能够实现对生产过程的精确控制。
3. 差异与发展：- 技术层面：传统技术依赖于经验和直觉，现代技术依赖于科学原理和精确操作。
- 效率层面：现代技术能够实现规模化、自动化生产，提高产量和效率。
- 品质层面：现代技术有助于提高食品的品质和营养价值。
三、食品生物技术研究的内容1. 食品原料改良：- 基因工程：通过转基因技术，培育抗病、抗虫、高产的新品种。
- 细胞工程：通过细胞培养和筛选，获得优质的食品原料。
蛋白质与酶化学课程总结1
蛋白质与酶化学课程总结第一章蛋白质的制备第一节蛋白质分离纯化的一般程序生物组织无细胞抽取液溶解度分级各种层析方法和电泳法结晶精制品冻干品第二节蛋白质的粗分离：蛋白质的提取和纯化蛋白质的色谱分离基本原理：色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在固定相（solid phase）和流动相（mobile phase）中。
混合物各组分在色谱柱中以不同的速度移动，经过一定的时间便可获得分离。
第三节蛋白质的电泳分离琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳两类。
电泳的检出方法：考马斯亮蓝染色法、银染色法、荧光染色技术、酶活性染色法、专一性配体结合检测法、用荧光抗体标记的抗体检测、凝胶上蛋白质的定量检出。
第五节蛋白质的鉴定主要方法：电泳法、蛋白质含量测定法、蛋白质的纯化标准和方法。
在开始纯化蛋白质之前要进行的工作：了解蛋白质分离纯化的一般过程、设计纯化蛋白质基本方案。
第二章酶的分子结构基础及其催化作用机理第一节酶是生物催化剂酶的定义：酶是生物体内一类具有催化活性和特殊空间构象的生物大分子物质，称为生物催化剂。
生物催化剂包括，酶（一般指化学本质是蛋白质），核酶（有催化活性的RNA），脱氧核酶（有催化活性的DNA）。
酶催化的生物化学反应，称为酶促反应。
在酶催化下发生化学变化的物质，称为底物。
第二节酶的催化特性酶的催化作用特性：共性：用量少、催化效率高（加快反应速度，缩短反应时间）；不改变化学反应的平衡点，在反应前后其性质、数量均不变；降低反应的活化能。
特性：催化效率极高具有高度的专一性、酶易失活、酶的活性受到调节和控制。
第三节酶的结构和酶的催化作用机制酶分子结构：结合部位、催化部位、调控部位、酶活性中心的必需基团、酶活性中心的测定方法。
酶催化作用的机制：酶显著降低反应的活化能、中间产物学说、决定酶作用高效效率的机制。
总结：1、酶催化作用的本质：降低反应活化能。
2、酶催化作用的中间产（络合）物学说在酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶－底物中间复合物。
酶的分离与纯化
（RCF)≤1×104g (2)高速离心机 1×104 r/min≤转速≤2.6×104 r/min,
8×103g≤RCF≤1×105g (3)超速离心机 转速≥2.5×104 r/min, RCF≥1×105g
酶的分离与纯化
酶的分离与纯化
• 有机溶剂沉淀法 优点：分辨率高；密度低，便于离心分离；沉淀不需脱
盐；溶剂易于蒸发除去，适于食品工业用酶制剂的制备。 缺点：容易使酶变性失活；安全要求较高；操作必须在
低温下进行。
酶的分离与纯化
（2）有机溶剂的选择和用量 与水互溶有机溶剂包括甲醇、乙醇和丙酮，其中甲醇和丙
酮有一定毒性。沉淀能力顺序是丙酮>乙醇>甲醇。工业上多用 乙醇作为沉淀剂。 （3）影响有机溶剂沉淀的因素
原理 P164-165
利用具有一定孔径的微孔滤膜，对生物大分子溶液进行过滤（常压、 加压或减压），使大分子保留在超滤膜上面的溶液中，小分子物质及 水过滤出去，从而达到脱盐、更换缓冲液或浓缩的目的。这种利用超 滤膜过滤分离大分子和小分子物质的方法叫做超滤法。超滤膜的截留 分子量范围从5000到500000。
2酸碱溶液提取3有机溶剂提取13四离心分离1离心机种类1常速离心机最大转速8000rmin相对离心力rcf1102高速离心机110rmin8103超速离心机转速2510rminrcf11014tgl16m高速台式冷冻离心机152离心分离方法1差速离心differentialcentrifugation2密度梯度离心densitygradientcentrifugation3等密度梯度离心sendimentationequilibriumcentrifugation3离心条件1离心力相对离心力rcf112105rn2离心时间3温度和ph161000g5min真核细胞4000g10min叶绿体真核细胞碎片细胞核15000g20min线粒体细菌30000g30min溶酶体细菌菌体碎片100000g180min核糖体多聚核糖体用差速离心法分离亚细胞成分171819五沉淀分离1盐析法盐溶salting在低浓度盐溶液中酶的溶解度增加
酶工程：酶的提取与分离纯化
中空纤维超滤膜组件
清洗液出口 （c）
渗出液
渗出液
清洗液
五、膜及膜的使用性能
（一）膜的结构 表层：孔径各异，厚度为0.1~5um 膜 基层：起支持作用，厚度为50~250um
（二）制膜材料
1、 无机材料 主要有：陶瓷、微孔玻璃、不锈钢和碳素等。 适用：微滤膜。 特点：是机械强度高，耐高温、耐化学试剂和耐有机溶剂， 但缺点是不易加工，造价较高。 2、有机高分子材料 目前，实用的有机高分子膜材料有：纤维素酯类、聚砜 类、聚酰胺类及其他材料。 可用作反渗透膜、微滤膜和超滤膜。
选择一定的条件使酶液中存在的某些蛋白质等杂质变性沉 淀，而不影响所需的酶。 1、热变性法：根据目的酶与杂蛋白热稳定性差异，可以在较 高温度下，使杂蛋白变性沉淀，而酶则保持可溶状态。 2、酸碱变性法：与热变性原理类似，目的酶与杂蛋白的酸碱 稳定性不同，可以调整不同的pH使杂蛋白变性沉淀。
第四节 膜过滤技术在酶分离纯 化中的应用
酶的提取与分离纯化
本章知识点：
（1）细胞的破碎、酶的抽提
重点（2）酶的分离纯化：沉淀分离、离心分离、
膜过滤、层析分离、电泳分离 （3）酶液的浓缩、结晶、干燥、成型
一、生物下游加工技术
下游加工过程包括目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化 等过程。 生物产物从原料（培养液或细胞）生产到产品的后处理技 术（分离纯化技术）的发展，使低成本、高收率地纯化目标 产物成为现实。 大多数酶的回收纯化过程成本约占70%； 医用酶的生产回收过程的成本高达85%；
一、膜分离的类型
1、按推动力不同可分为： （1）加压膜分离：微滤（Microfiltration）、超滤 （Ultrafiltration）、纳滤（Nanofiltration ）、反渗透 （Reverse Osmosis） （2）电场膜分离：电渗析（Electrodialysis） （3）扩散膜分离：渗透（ Osmosis）、透析（Dialysis ） 2、按膜孔径或截留物质的大小： 微滤 —— 超滤 —— 纳滤 、电渗析 、透析 —— 反渗透
蛋白质和酶的分离与纯化
蛋白质和酶的分离纯化及鉴定蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。
从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。
要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。
蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。
要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。
目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。
一、质分离纯化的一般原则1. 原料的选择原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。
蛋白分布：体液、组织、细胞定位2. 破碎方法：(1)机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。
如：捣碎法、研磨、匀桨法(2)物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。
如：反复冻融、渗透压、超声破碎(3)化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法.如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween）(4)酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等3.目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法4.先粗后细，分级分离粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。
如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。
精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。
5.避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等）二、常用的蛋白质的分离纯化技术可以根据各种蛋白质的结构、理化性质不同设计分离方法。
（一）根据蛋白质的溶解度不同进行分离1.蛋白质盐析蛋白质属于生物大分子之一，分子量从1万至100万之巨，其分子的直径可达1-100nm，为胶粒范围之内。
蛋白质的表面电荷和水化膜是其主要的稳定性因素。
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第一章酶的分离提取与纯化
1.1离心分离和层析分离
1.1.1酶的提取方法
离心是利用离心机旋转所产生的的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异，进行分离浓缩和提纯生物样品的一种方法。
离心分离时，要根据待分离物质以及杂志的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。
1.1.1.1离心机的种类与用途
常速离心机，高速离心机，超速离心机
1)常速离心机：转速<8000 r/min 用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣
及粗结晶等较大颗粒
2)高速离心机：转速：1~2.5*104 r/min 用途：分离各种沉淀物、细胞碎片
及较大的细胞器
3)超速离心机：转速：2.5~12*104 r/min 用途：用于DNA、RNA、蛋白质
等生物大分子以及细胞器、病毒的分离纯化
1.1.1.2离心方法
差速离心，密度梯度离心，等密度梯度离心
1)差速离心：原理：是采用不同的离心速度和离心时间，是沉降速度不同的颗
粒分不分离的方法。
用途：分离沉降系数相差较大的蛋白质分子
2)密度梯度离心原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用
下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
常用介质：蔗糖、甘油
3)等密度梯度离心：原理：当待分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密
度梯度范围内时，不同浮力密度的颗粒在离心力作用下一直移动到与各自浮力密度相等的位置，形成区带。
介质：铯盐
1.1.1.3层析分离技术
又称色谱技术，是一种物理的分离方法。
利用混合物中的各组分的物理化学性质（分子的大小和形状，分子极性，吸附力，分子亲和力）的不同，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（固定相），另一个相则流过固定相（流动相）并使各组分以不同速度一定，从而达到分离
根据分离原理分类
吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等
1)吸附层析
原理：是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合物中各组分分离的方法。
2)分配层析
原理：在一个有两相同时存在的溶剂系统中，根据不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。
3)分配层析
原理：在一个有两相同时存在的溶剂系统中，根据不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。
离子交换剂载体：离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖
阳离子交换剂：平衡粒子带正电的离子交换剂，能与带正电的离子基团发生交换作用
阴离子交换剂：平衡粒子带负电的离子交换剂，能与带负电的离子基团发生交换作用
4)凝胶层析
原理：是以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子量不同，而达到物质分离的一种层析技术。
常用凝胶：葡聚糖凝胶；琼脂凝胶
5)亲和层析
原理：是利用生物分子与配基之间所具有的转移而又可逆的亲和力，而使蛋白质分子分离纯化的技术。
1.1.2讨论与问题
1)利用梯度混合器制备得到的密度梯度可以有哪几种？
线性、凸性、凹性
2)制备密度梯度溶液，一般采用什么仪器进行制备？
梯度混合器
3)沉降系数比较接近的蛋白质分子适用于哪种分离方法？
A.差速离心法
B.密度梯度离心法
4)常用的层析方法有？
吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析
5)在酶的离子交换层析中，阳离子交换剂可吸附带负电荷的蛋白质（X）。
6)凝胶层析过程中，小分子量的蛋白质能直接通过凝胶珠之间的缝隙，首先被
洗脱下来。
（X）
7)凝胶层析分离酶蛋白的依据是各组分的相对分子质量不同。
（√）
解析:当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的
蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长！凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。
因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。
1.2过滤和膜分离技术
过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。
过滤（非膜过滤和膜过滤）介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维等非膜过滤：采用高分子膜以外物质作为过滤介质。
粗滤和部分未滤
膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质。
大部分微滤、超滤、反渗透
1.2.1过滤的分类及特性
1.2.2非膜过滤
粗滤：
截留颗粒直径大于2μm,用于分离酵母、霉菌、动植物细胞、培养基残渣等。
过滤介质有滤纸、滤布、多孔陶瓷等
常压过滤以液位差为推动力，易操作，分离效果差，难成规模。
加压过滤以压力泵或压缩空气为推动力。
效果较好，生产上应用广泛。
减压过滤真空过滤、抽滤。
多用于粘性不大的物料。
微滤：
微孔过滤，截留颗粒直径0.2~2μm,光学显微镜可见颗粒，采用微孔陶瓷、烧结金属等
1.2.3膜分离技术
借助于一定孔径的各种高分子薄膜，将不同大小。
不同形状和不同特性的物质颗粒或分子分离的技术。
薄膜有丙烯啨、醋酸纤维素、硝酸纤维素等高分子聚合物制成的高分子膜。
1.2.3.1根据颗粒或分子通过薄膜的原理和推动力不同分三类
1.2.3.2加压膜分离
以薄膜两边的流体静压差为推动力。
根据截留颗粒大小分为3种：微滤（0.2-2um/细菌）；超滤（截留菌丝体和可溶性蛋白）；反渗透（分离各种离子和小分子物质）
1.2.3.3电场膜分离
在半透膜的两侧分别装上正负极，电厂作用下小分子带电物质或离子向其与本身电荷相反的电极移动，通过半透膜，达到分离目的。
电渗析
离子交换膜电渗析
1.2.3.4扩散膜分离
利用小分子扩散作用透过半透膜，而大分子被截留;用于酶、蛋白质、核酸等生物大分子的分离。
透析设备简单，但操作时间长，要更换水或缓冲液。
1.2.4电泳分离
带电粒子在电厂中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。
按其使用的支持体不同，电泳分为纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳，自由电泳、等电聚焦电泳。
1.2.4.1基本原理
是指在电场作用下，带点颗粒由于所带电荷不同及分子大小差异而有不同迁移行为，从而彼此分离开来的一种实验技术。
由于混合样品中各组分带电性质、带电量、相对分子量不同，在同一电场作用下，涌动的方向和速率各异，从而达到分离鉴定的目的。
1.2.4.2电泳装置
1.2.4.3影响电泳分离的主要因素
1)待分离生物大分子的性质
电荷量越大，直径越小，形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快
2)缓冲液的性质
3)电场强度
4)电渗
5)支持介质的筛孔
1.2.4.4电泳的分类
1)区带电泳：各组分在支持介质中被分离成许多条明显的区带，是当前应用最
广泛的电泳技术。
2)自由界面电泳：无支持介质，分离效果差，现已被其他电泳技术所取代。
3)等速电泳：需专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各
4)电泳区带相随，分成清晰界面，以等速向前运动。
5)等电聚焦电泳：由两性电质在电场中自动形成pH梯度，当被分离的生物大
分子移动到各自等电点的pH处聚集成很窄的区带
1.2.4.5电泳技术的应用
1)分离各种有机物
2)分析物质的浓度
3)测定某种物质的相对分子质量
4)与其他技术（层析法）结合，用于蛋白质结构分析如“指纹法”。