高效液相色谱分析法4
色谱分析(中国药科大学)第4章第1-6节高效液相色谱分析
本法采用未改性的原形硅胶为固定相，以水性溶液作流动相。常用于分析中药中的生物碱成分，或化学合成的生物碱类药物。
该方法的保留机制是基于硅胶表面的硅羟基在一定的条件下具有离子交换特性，改变任一流动相条件（pH, 离子强度，含水量），都会对保留时间产生影响。
（二）流动相
该法常用的流动相为：乙醇（或甲醇）—1~3%三乙胺水溶液（磷酸或醋酸调节pH值至6~7.5）（85：15）或（80：20）。该法的色谱保留机理相当于离子交换机理，主要依碱性强弱出峰。色谱峰的对称性很好，峰形尖锐。适合于分离在反相HPLC中不宜分离的生物碱类混合物（反相HPLC中生物碱可能拖尾及峰展宽，有时tR相差很大）。
经典柱色谱填料颗粒粒径一般大于100um，颗粒较大，传质扩散缓慢，手工装柱不易装均匀，涡流扩散现象较严重，因此经典液相色谱法柱效较低，分离能力差，只能胜任各组分分配系数相差较大的样品（各组分性质相差较大的样品）的分离，HPLC填料粒径一般为5-10μm，传质快，采用高压均浆技术装柱，装柱均匀性号，涡流扩散小，因此HPLC柱效很高，比经典柱色谱高数百～数千倍，25cm长的硅胶柱柱效可达2万理论塔板，能胜任复杂物的分离，峰容量大。
色谱柱不能很长，柱效不会太高
载气不影响分配，靠改变固定相来改变选择性
固定相：没有GC那样种类繁多靠改变流动相来改变选择性
回收困难
可定量回收，可用于制备
第二节 液－固吸附色谱及液－液分配色谱
一 液－固吸附色谱（LSC）
(一)定义
色谱分离是基于吸附效应的色谱法称为吸附色谱，又称液－固吸附色谱、正相色谱法（normal phase chromatography，NPC）。
影响NS/RE色谱保留的因素如下：
1. 水的比例增加，洗脱能力减小；
高效液相色谱分析
数 据 处 理
检 测 器
色 谱 柱
高效液相色谱仪一般可分为5个主要部分： 高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、 计算机控制及数据处理系统。此外还配有辅助装 置：如梯度洗脱，也叫梯度淋洗，自动进样及数 据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液 器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从 控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流 经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱 进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪 将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色 谱图。
纯 水 制 备 仪
超 纯 水 制 备 仪
乙腈 这是反相高效液相色谱常用的溶剂，实验室常用的 只能满足紫外检测器的需要。这样的试剂很难符合荧光 和电化学检测器的要求。 甲醇 反相高效液相色谱常用的溶剂之一，其杂质主要是 水。市面上能够买到紫外光谱纯的商品，但它的主要问 题也是有些特性满足不了荧光和电化学检测分析。 氯代烃类溶剂 在正相高效液相色谱中常用的二氯甲烷等 氯代烃类溶剂中，添加稳定剂甲醇或乙醇。乙醇能够提 高流动相的极性，缩短正相高效液相色谱分析中各组分 的保留时间。各批次之间浓度的变化也许会影响重复性。 国内市场上可能不容易买到不含稳定剂的氯代烃类溶剂， 但是可以用氧化铝柱吸附的办法或者用水萃取脱掉。不 含稳定剂的氯代烃类溶剂可以缓慢的分解，特别是与其 他溶剂共存时。分解的盐酸会腐蚀不锈钢部件，损害色 谱柱。以戊烯为稳定剂的氯代烃类溶剂可避免上述产生 的问题。
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相 阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输 液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是 核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐 腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流 泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱 引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其 流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差，它 们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称 机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的 是机械往复泵。
高效液相色谱仪测定邻苯4P作业指导书 - 亿鑫仪器
高效液相色谱仪测定邻苯4P作业指导书一、范围本指导书适用于Rohs2.0中管控的四种邻苯二甲酸酯含量的测定。
四种邻苯二甲酸酯：邻苯二甲酸丁苄酯（BBP）、邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP）、邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）。
本指导书适用于Rohs2.0中管控的四种邻苯二甲酸酯的高效液相色谱测定方法。
二、规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB/T26792-2011高效液相色谱仪SJ/T11692电子电气产品中有害物质检测样品拆分指南三、术语和定义四种邻苯二甲酸酯Four Phthalates（PAEs）四种邻苯二甲酸酯是指表1中四种碳氢化合物。
四、原理将分析试样破碎后，用乙腈提取，经可控温超声波清洗器超声，过滤洗涤后定容，用高效液相色谱仪（HPLC）测定，采用目标分析物的保留时间定性，外标法定量。
五、试剂与材料5.1乙腈：色谱纯。
5.2甲醇：色谱纯。
5.3水：符合GB/T6682中一级水。
5.4滤膜和滤器：有机相针筒过滤膜，0.22um或相当者。
5.5四种邻苯二甲酸酯标准物质：邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）纯度>98.0%；邻苯二甲酸丁苄酯（BBP）纯度>98.0%；邻苯二甲酸二丁酯（DBP）纯度>98.0%；邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP）纯度98.0%。
六、仪器和装置6.1高效液相色谱仪：配置紫外检测器。
6.2色谱柱：C18柱,250mm×4.6mm×5.0um或相当者。
6.3粉碎机或等效设备：转速高于2700r/min。
6.4分析天平：精度0.1mg。
6.5可控温超声波清洗器：频率（400±100）Hz，功率（120±10）W，水浴温控范围：（25±5）℃至（80±5）℃。
高效液相色谱法操作步骤
高效液相色谱法操作步骤
高效液相色谱法的操作步骤如下:
1. 过滤流动相并根据需要选择不同的滤膜。
溶剂必须为色谱纯，且溶剂及样品必须过膜（0.45μm）。
超声脱气30分钟以上。
2. 用流动相冲洗金属过滤器，然后将过滤器浸入储液罐的流动相中。
有一段时间没用或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。
3. 将储液罐放置在一定的高度，以避免由于搬运和其他操作人员的移动而造成不必要的跌落。
4. 然后按以下顺序依次启动高效液相色谱仪：泵→检测器→高效液相色谱软件→设置软件参数，如分析时间、检测波长、流速等。
5. 启动泵，运行5分钟，主要是为了排除系统中的气泡，结束后关闭所有排气阀。
6. 然后按照预先计划的速度，以固定的速率，如1mL/min左右，运行流动相，走基线，直到基线平稳。
7. 基线平稳后，在软件中设置样品的运行参数，如流速和分析时间等。
分析时间会因样品、流速、柱长等因素变化。
8. 设计走样方法。
9. 在进样和进样后操作的过程中，需要及时调整和监控各项参数。
仪器分析 高效液相色谱法
第17章HPLC法17.1 内容提要17.1.1 基本概念高效液相色谱法──在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱(GC)的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，使之发展成为高分离速率、高分离效率、高检测灵敏度的高效液相色谱法，易称为现代液相色谱法。
高效液相色谱仪──采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。
梯度洗脱──用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变流动相的浓度、配比和极性，使样品中各组分能在最佳的分配比下出峰的操作技术。
也称为梯度淋洗。
低压梯度──又称外梯度，特点是先混合后加压。
它是采用在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱系统，易称为泵前混合。
高压梯度──又称内梯度，特点是先加压后混合。
它有两台高压输液泵、梯度程序器(或计算机及接口板控制)、混合器等部件组成。
两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱柱系统，是一种泵后高压混合形式。
柱外效应──由色谱柱以外的因素引起的色谱峰形扩展的效应。
柱外因素常指从进样口到检测器之间，除色谱柱以外的所有死时间，如进样器、连接管、检测器等的死体积，都会导致色谱峰形加宽、柱效下降。
液固吸附色谱法──以固体吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力，样品分子被流动相带入柱内，它将与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附性。
K值大的强极性组分易被吸附，K值小的弱极性组分难被吸附，样品组分因此被分离。
液液分配色谱法──根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。
分配系数较大的组分保留值也较大。
正相分配色谱法──流动相极性低而固定相极性高的称为正相分配色谱法。
反相分配色谱法──流动相极性高而固定相极性低的称为反相分配色谱法。
化学键合相──利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而形成的各种性能的固定相。
高效液相色谱法测定酸奶中四种有机酸
网络出版时间：2012-10-16 17:38网络出版地址：/kcms/detail/43.1183.TS.20121016.1738.014.html高效液相色谱法测定酸奶中四种有机酸Determination of 4 organic acids in yogurt by high-performanceliquid chromatography田辉1,2孙懿琳1,2周元良1,2霍贵成1,2TIAN Hui1,2SUN Yi-lin1,2ZHOU Y uan-liang1,2HUO Gui-cheng1,2（1.乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150030；2.东北农业大学，黑龙江哈尔滨150030）(1.Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Harbin, Heilongjiang 150030, China;2.Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang 150030, China)摘要：测定酸奶中风味有机酸，精确评价酸奶风味，并对比3种发酵剂的发酵性能。
使用3种直投式发酵剂以半工业化方式生产酸奶，测定3种酸奶在发酵及冷藏过程中的酸度变化，感官评定酸奶成品，并通过高效液相色谱法（HPLC）分析酸奶中的4种有机酸成分（乳酸、柠檬酸、丙酮酸及甲酸）。
结果表明：3种发酵剂产酸迅速，所产酸奶品质优良，M与自制发酵剂后酸化弱。
冷藏期间3种酸奶中有机酸含量的变化存在细微差异。
利用高效液相色谱法有效测定了酸奶中4种有机酸（乳酸、柠檬酸、丙酮酸及甲酸），成功评定了3种发酵剂的的发酵性能。
关键词：高效液相色谱；有机酸；酸奶；感官评定Abstract: The research is to determine the organic acids in yogurt by high-performance liquid chromatography(HPLC), evaluate the flavor of yogurt by sensory evaluation, and compare the performances of 3 cultures. Threekinds of direct-vat-set cultures were used to produce yogurt respectively in a semi-industrialized way, and then theacidities of yogurt during fermentation were determined. Sensory evaluation was made to assess the quality ofyogurt, and 4 kinds of organic acids (lactic, citric, pyruvic and formic acids) in yogurts were determined by HPLC.Results: It showed that all 3 cultures had quick acidity production, and all yogurt was proved to hold high qualities.The culture M and the self-made culture showed a weak post acidification while N culture showed strong. Somedifferences of the organic acids contents among 3 kinds of yogurt were observed. 4 organic acids (lactic, citric,pyruvic and formic acids) in yogurt were determined effectively by HPLC, and the performances of 3 cultures基金项目：教育部长江学者和创新团队发展计划项目（编号：IRT0959）作者简介：田辉(1984—)，男，东北农业大学在读博士研究生。
第四章 色谱分析法
（2）外标法
外标法也称为标准曲线法。 特点及要求： • • • 外标法不使用校正因子，准确性较高， 操作条件变化对结果准确性影响较大。 对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的
快速分析。
（3）内标法
内标物要满足以下要求：
（a）试样中不含有该物质；
（b）与被测组分性质比较接近； （c）不与试样发生化学反应； （d）出峰位置应位于被测组分附近。
从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息： (1) 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组 分的最少个数． （2）根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行 定性分析． (3) 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分 析． （4）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色 谱柱分离效能的依据． （5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流 动相)选择是否合适的依据．
相同的色谱分析条件下，某组份2的调整保留值与组份 1的调整保留值之比，称为相对保留值：
2.1
VR2 tR2 t R1 VR1
由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关，而与柱 径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色 谱法中，特别是气相色谱法中，广泛使用的定性数 据． 必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时 间或保留体积之比 .
⑵保留时间tR 试样从进样开始到柱后出现峰极大值时所 经历的时间，称为保留时间，如图中 O′B．它相应于样品 到达柱末端的检测器所需的时间． ⑶调整保留时间tR′某组份的保留时间扣除死时间后称为该 组份的调整保留时间，即 tR′ = tR-tM
⑷死体积 VM 指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒 间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间 以及检测器的空间的总和．当后两项很小而可忽略 不计时，死体积可由死时间与流动相体积流速F0 （L／min）计算：
超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法
超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法一、概述在当今的科学研究和工业生产中，高分辨质谱技术已经成为一种非常重要的分析方法。
它不仅可以用于大分子的结构鉴定和分析，还可以用于微量成分的检测和定量分析。
超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法作为一种新兴的高分辨质谱分析技术，具有很高的分辨率和灵敏度，受到广泛关注。
在本文中，将介绍该技术的原理、应用及发展前景。
二、原理超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法的原理主要包括超高效液相色谱、四极杆质谱和静电场轨道阱质谱三部分。
1. 超高效液相色谱（UHPLC）是一种高分辨率、高灵敏度的液相色谱技术，它通过使用亚毫米级的柱内粒子和高压泵，能够大大提高分离效率和分析速度。
2. 四极杆质谱是一种广泛应用的成熟质谱分析技术，它通过四个电极产生交变电场，对离子进行筛选和分析。
3. 静电场轨道阱质谱是一种高分辨率、高灵敏度的质谱分析技术，它通过静电场将离子束限制在一个稳定的轨道上，以便进行准确的质量测定。
三、应用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法在许多领域都有着重要的应用价值，例如医药、食品安全、环境监测等。
1. 医药领域：该技术可以用于药物代谢动力学研究、天然产物的结构鉴定和药物残留的检测。
2. 食品安全领域：该技术可以用于食品中农药、兽药残留的检测、食品添加剂的分析及食品成分的定量分析。
3. 环境监测：该技术可以用于大气、水体和土壤中微量有机物和无机物的分析与检测。
四、发展前景随着分析技术的不断发展，超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法也在不断完善和提高。
未来，预计该技术将在分析速度、分辨率、灵敏度和样品通量方面都会有显著的提升。
1. 提高分辨率：通过优化仪器结构、信号处理算法等手段，提高分辨率，实现更为精准的分析。
2. 提高灵敏度：改进离子传输和捕获方式，提高仪器的灵敏度，能够对更小浓度的物质进行分析。
3. 提高分析速度：通过改进柱子材料、优化流动相等手段，提高分析速度，实现更为高效的分析。
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是目前广泛应用于仪器分析领域的一种重要分析方法。
它通过利用柱子中流动的流动相和样品的物理化学性质的相互作用，使样品组分在柱子中发生分离，再通过检测器对各组分进行定量或定性分析。
仪器分析高效液相色谱法主要由流动相供给系统、进样器、柱子、检测器和数据处理系统等组成。
流动相供给系统通过恒压或恒流的方式将流动相送入进样器中，进样器将样品注入柱子中，柱子根据物理化学性质的差异，使不同组分发生分离，之后检测器检测进入检测器的各组分的浓度，并通过数据处理系统对数据进行分析和整理。
高效液相色谱法具有分离效率高、分离时间短、适用范围广等特点。
与传统的液相色谱法相比，高效液相色谱法的流动相的流速更高，柱子填充物颗粒更小，从而大大提高了分离效率。
同时，高效液相色谱法对样品的需求量较小，具有较好的分析灵敏度。
因此，高效液相色谱法被广泛应用于生物、环境、食品、药物、化工等领域的组分分析和质量控制。
在生物领域中，高效液相色谱法常用于生物样品中代谢产物和药物的分析。
通过绑定柱子、手性柱子以及使用不同的检测器，可以对复杂的生物样品中的不同组分进行准确的分析和定量测试。
例如，对尿液中的代谢产物进行分析可以帮助人们了解人体健康状态，对药物的残留物进行分析可以保证食品和水的安全等。
在环境领域中，高效液相色谱法常用于水质、大气和土壤等环境样品中有机污染物的分析。
通过连接各种不同相的柱子，可以对复杂的环境样品中的有机污染物进行有效的分离，使用紫外-可见光检测器或质谱检测器可以对分离后的各组分进行检测和定量。
在食品领域中，高效液相色谱法常用于食品中添加剂、农药残留物和食品中的有害物质的分析。
通过选择合适的柱子和检测器，可以对复杂的食品样品进行分离和检测，以保证食品的安全性和质量。
在药物领域中，高效液相色谱法常用于药品中活性成分和杂质的分析。
高效液相色谱分析法
现代食品检测技术第一部分——色谱分析——高效液相色谱第七章高效液相色谱分析法High performance liquid chromatograph 第一节高效液相色谱的特点与仪器第二节主要分离类型与原理第三节液相色谱的固定相与流动相第四节影响分离的因素与操作条件的选择第五节新型液相色谱简介2010-1-25第一节高效液相色谱的特点与仪器2010-1-25一、高效液相色谱法的特点在经典的液体柱色谱法基础上，引入了气相色谱法的理论。
在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化。
高效液相色谱法的突出特点：1）高效（柱效约为30000n /米）2）高速（较经典色谱法））3）高压（150 -350*105Pa4）高灵敏度（高灵敏度的检测器：紫外10-9g，荧光：10-11g ）2010-1-251. HPLC与经典LC区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1）经典LC：仅做为一种分离手段柱内径1～3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀；常压输送流动相，柱效低（H↑，n↓）；分析周期长、无法在线检测。
2）HPLC：分离和分析柱内径2～6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱）；高压泵输送流动相，柱效高（H↓，n↑）；分析时间大大缩短、可以在线检测。
2010-1-252. HPLC与GC差别9相同：兼有分离和分析功能，均可以在线检测9主要差别：分析对象、流动相及操作条件的差别1）分析对象GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测，仅能分析有机物的20％。
HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制；分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测，用途广泛，占有机物的80％。
2010-1-252）流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性3）操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大）2010-1-25二、液相色谱仪器2010-1-25三、流程及主要部件Process and main assembly of HPLC 1.流程2010-1-252.主要部件(1) 高压输液泵♥主要部件之一，压力：150～350×105Pa。
分析化学 高效液相色谱法
'
2
W
H eff
L neff
2、 分离度
R 2(tr2 tr1 ) neff • 1 (W1 W2 ) 4
3、 速率方程
H A B Cu u
B 2DM
溶质在液相流动相 中的扩散系数，约 为气相中扩散系数
的万分之一
在大多数情况下， B 0 u
修正的速率方程： H A Cu
柱径：0.9 cm
F：30 mL/h
t分离: >20 h
高效液相色谱仪
经典液相色谱 HPLC
150-200 μm 3-10 μm 重力或低压泵 高压泵
HPL C
t分离：1 h
很慢
快(1-10mL/min)
与经典液相色谱法相比
颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相，(键合相) 传质阻抗小，柱效高，分离效率高；
注意：
流动相的pH一般应在3-8，否则会引起硅胶溶解；(也有适用宽pH 范围的键合相)。
固定相
固体吸附剂
硅胶－强极性 氧化铝－弱极性 活性炭－非极性 分子筛－强极性 高分子多孔微球(GDX)
硅胶表面结构
硅胶表面结构经热处理发生的变化
二、化学键合相色谱法的流动相
对流动相的要求：
与固定相不发生化学反应。
2、固定相
键合烷基的疏水性随碳链的延长而增 加，溶质的k也增大。 硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶 质的k越大。
3、流动相
极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大
溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂
溶剂比例：水的比例增加，使k增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大
pH：影响弱酸、弱减的离解
流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大； 弱碱k变小。
高效液相色谱对二苯甲烷4，4'-二异氰酸酯（MDI）及中间产物的快速测定
高效液相色谱对二苯甲烷4，4'-二异氰酸酯（MDI）及中间产物的快速测定贺春梅;陈国强;陈蓝天【摘要】本文利用高效液相色谱法对二苯甲烷4,4'-二异氰酸酯（MDI）及中间产物的乙醇衍生物进行分析，实现了MDI及中间产物的测定。
色谱条件：采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱分离，以水-甲醇（体积比40∶60）溶液为流动相，流速1.2mL·min-1，检测波长：245nm，柱温30℃，中间产物和MDI衍生物的线性较好（r均在0.999以上）。
该方法重复性好，灵敏度高，简便且快速。
%A new hight performance liquid chromatography(HPLC) method was established for the determina-tion of diphenylmethane 4,4'-diisocyanate(MDI) and the middle of produce was derived by ethanol without water. The chromatographic conditions:the separation was performed on a Agilent Eclipse XDB-C 18 column with Water-methyl alcohol (40∶60,V/V)as the mobile phase at a flow rate of 1.0mL·min-1. The detection wavelength was set at 245 nm, the column temperature was 30℃. Under the optimized condition ,there was good li near relationship be-tween the mass concentration and the peak area of MDI and the middle of produce with the correlation coefficient r>0.999. The method is good reproducibility, hight sensitivity, simple and rapid.【期刊名称】《化学工程师》【年(卷),期】2014(000)008【总页数】4页(P40-42,78)【关键词】二苯甲烷4,4'-二异氰酸酯(MDI);高效液相色谱法;衍生物【作者】贺春梅;陈国强;陈蓝天【作者单位】中国石油乌鲁木齐石化公司研究院，新疆乌鲁木齐 830019;中国石油乌鲁木齐石化公司研究院，新疆乌鲁木齐 830019;中国石油乌鲁木齐石化公司研究院，新疆乌鲁木齐 830019【正文语种】中文【中图分类】O657.7二苯甲烷4,4'-二异氰酸酯（简称MDI）是聚氨基甲酸酯（简称聚氨酯）的主要原料[1]。
高效液相色谱定性定量分析方法
1 所选浓度范围使检测器的响应值超出了该检测器 响应值的线性范围；
2 实验数据的精密度太差，过于分散。
无论何种原因，都应重新绘制标准工作曲线 。
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• 在某些限定条件下，被测组分的浓度与检测器的 响应值成正比的关系。（蒸发光散射检测器浓度 与峰面积不成线性，分别取对数后呈线性。）
• Ci=fiAi • Ci=fiHi
• 实际修饰公式为：y=ax+b
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定量分析方法
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面积归一化法
不能作为准确定量的方法、仅在特殊情况下使用
• •
公式： 特点：
C%
Ai Ai
100%
– 各组分要全部流出、全部被检测，要求所有响 应因子相当
– 进样量不要求严格
– 不需标样
– 无需做校正、简单、快速
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内标法
• 选择适宜的物质作为欲测组分的参比物， 定量加到样品中去，依据欲测组分和参比 物在检测器上的响应值（峰面积或峰高） 之比和参比物加入的量进行定量分析的方 法。
• 内标法与标准曲线法相比，有利于消除色 谱条件不完全重现、进样量不准确等所带 来的误差。
《仪器分析》4-高效液相色谱法
(4) 示差折光检测器： 是一种中等灵敏度(10–6 g/mL)的通用型检测器。
是利用纯流动相和含有待测组分的流动相之间折射率的 差别进行检测的。
可分为三类：反射式；折射式（偏振式）和干涉式。常 用前两种。
优点：灵敏度适宜，操作简便是一种通用型的检测器； 缺点：对温度变化敏感，不能用于梯度洗脱。 应用范围：聚合物、糖。还用于分析以紫外检测和荧光
精选课件
药典中的液相色谱检测器
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常用的检测器:
(1) 紫外光度检测器：是一种选择性浓度检测器，仅 对那些在紫外波长有吸收的物质有响应。
作用原理：基于待测试样对特定波长的紫外光有选择 性的吸收，试样浓度与吸光度的关系服从比尔定律。
结构：
1－低压汞灯 2－透镜 3－遮光板 4－测量池 5－参比池 6－紫外滤光片 7－双紫外光敏电阻
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⑶ 色谱柱 GC柱很长，特别是毛细管柱可长至几十米至上百米，柱效
很高(理论塔板数N = 104~106)。HPLC柱较短，一般为15~25 cm，柱效(理论塔板数N = 103~104)，低于GC柱。 ⑷ 检测器
与GC相比，HPLC检测器种类较多。 ⑸ 制备色谱
GC难以制备样品，因为进样量小，难以收集或被破坏。 HPLC可进行制备，即制备色谱。
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2. 进样系统
在高效液相色谱中，常用的进样方式： 高压阀进样：优点是能用于高压，适于大体积进样，重现性
好；缺点是进样阀进样时需排掉一部分试样，不同的进样 量需用不同的定量管，同时峰的扩展也比注射进样大。 微量注射器进样：也可由微量注射器注入取样环少量样品， 即采用较大体积取样环而进少量试样，进样量由注射器控 制，试样不充满取样环，只填充一部分体积。
高效液相色谱法
液相色谱法固定相
(三) 离子交换色谱法固定相
1. 薄膜型离子交换树脂: 即以薄壳玻璃珠为担体， 在它的表面涂约 1% 的离子交换树脂而成。
2. 离子交换键合固定相: 用化学反应将离子交换基 团键合在惰性担体表面。
液相色谱法固定相
（四） 亲和色谱固定相
亲和色谱是一种基于分离物与配体间特异
的生物亲合作用来分离生物大分子的技术，它
五 高效液相色谱分离类型的选择
要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的 了解样品
的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应
用范围。选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分子质 量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度
以及化学结构等物理、化学性质。
1、相对分子质量 对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比
的作用越来越大，主要应用如下：
多环芳烃、农药、酚类、真菌毒素、异腈酸酯等
等。 特别是有机农药方面的检测。
1. 有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m)
流动相：正己烷
流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径)
检测器：差示折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药残 留量进行分析。
极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱
适于分离极性组分
反相色谱——固定液极性 < 流动相极性（RLLC）
极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分
载体又称担体
(1) 全多孔型担体：
a.
HPLC早期使用的担体与GC类似，是颗粒均匀的多孔球 体，如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的 Φ 100μ m全多孔型担体。
高效液相色谱法实验报告
高效液相色谱法实验报告高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的分离和检测技术，被广泛应用于化学、生物和医药等领域。
以下是高效液相色谱法实验报告的示例：实验名称：高效液相色谱法分离和检测混合物一、实验目的1.学习高效液相色谱法的基本原理和实验操作；2.利用高效液相色谱法分离和检测混合物中的组分；3.分析实验数据，得出结论。
二、实验原理高效液相色谱法是一种基于色谱分离原理的检测技术。
样品中的组分在流动相和固定相之间的分配平衡，通过不同性质的固定相实现组分的分离。
在分离过程中，组分在色谱柱上的保留时间和洗脱顺序可用于定性分析，而组分的浓度或含量可通过检测器进行定量分析。
三、实验步骤1.准备试剂和仪器：选择合适的流动相、固定相、检测器等，确保仪器正常运行；2.配置样品：将待测混合物溶解于适当的溶剂中，制备成适当浓度的样品溶液；3.连接仪器：将流动相泵、色谱柱、检测器和数据采集系统连接起来，确保密封良好；4.平衡色谱柱：在开始进样之前，让色谱柱通过流动相进行平衡，使固定相达到稳定状态；5.进样分析：将样品溶液注入进样器中，由流动相带入色谱柱进行分离。
记录各个组分的保留时间和洗脱顺序；6.清洗色谱柱：实验结束后，用适量的流动相清洗色谱柱，以除去残留的样品组分；7.数据处理：对实验数据进行处理和分析，包括峰识别、定量和定性分析等。
四、实验结果与数据分析1.记录各个组分的保留时间和洗脱顺序；2.根据实验数据绘制色谱图，标注各个峰对应的组分；3.根据峰面积或峰高计算各个组分的浓度或含量；4.分析实验结果，与标准品进行比较，确定组分的性质。
五、结论根据实验结果和数据分析，得出以下结论：1.利用高效液相色谱法成功分离和检测了混合物中的各个组分；2.通过与标准品比较，确定了各个组分的性质；3.本实验表明高效液相色谱法是一种有效的分离和检测方法，可应用于实际生产和科研中。
高效液相色谱法测定高纯度4-甲基邻苯二酚
高效液相色谱法测定高纯度4-甲基邻苯二酚陈素青【摘要】研究了用高效液相色谱-反相色谱内标法测定由4-甲酚与低浓度过氧化氢水溶液反应生成的高纯度4-甲基邻苯二酚.色谱条件为:C18反相柱,流动相为V(甲醇):V(质量分数为0.2%的乙酸水溶液)=50:50,紫外检测波长为282nm,流速0.8mL/min.4-甲基邻苯二酚的最低检测质量浓度为0.04μg/mL,在0.1～100μg/mL范围内4-甲基邻苯二酚的峰面积与质量浓度的线性关系良好(r=0.9999).以对苯二酚为内标物,用内标法检测由4-甲酚与低浓度过氧化氢水溶液反应生成的高纯度4-甲基邻苯二酚含量,用此方法4-甲基邻苯二酚回收率为99.9%～100.2%.【期刊名称】《淮海工学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(019)001【总页数】3页(P46-48)【关键词】反相高效液相色谱法;内标法;4-甲基邻苯二酚;对苯二酚【作者】陈素青【作者单位】连云港三吉利化学工业有限公司,江苏,连云港,222047【正文语种】中文【中图分类】O6580 引言4-甲基邻苯二酚又名高儿茶酚,是重要的精细化工中间体,广泛应用于医药(抗菌剂)、农药、苹果型香料、抗氧化剂及高效阻聚剂等生产领域。
对高纯度4-甲基邻苯二酚纯度的测定目前尚无国家标准可循。
虽然已有厂家在生产4-甲基邻苯二酚,但多用气相色谱检测。
气相色谱法对高含量的样品分析准确度不高[1]。
在查不到4-甲基邻苯二酚国家标准和4-甲基邻苯二酚国际标准的情况下,用本文测定方法检测,实际应用效果很好,该方法主要是针对高纯度的4-甲基邻苯二酚的测定,一般低含量的4-甲基邻苯二酚(如在合成中的中间控制样品)直接用高效液相色谱法外标法就可以了,而对高纯度的4-甲基邻苯二酚的测定,用外标法误差太大,不能满足实际需要。
高效液相色谱法的特点就是高速、高效、高灵敏度。
在常用的内标法、外标法和归一法3种定量分析方法中,内标法由于有进样量的变化和色谱条件的微小变化对内标法定量结果的影响不大的优点[2],通常精确度更高,所以,相对来说对高含量的样品分析采用高效液相色谱法内标法较好。
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2.流速
流速大于0.5 cm/s时, H～u 曲线是一段斜率不大的直线。 降低流速，柱效提高不是很大。 但在实际操作中，流量仍是一 个调整分离度和出峰时间的重 要可选择参数。
3.固定相及分离柱
二、分离类型的选择
choice of separation types
三、液相色谱的应用
application of HPLC
四、液相制备色谱
preparative liquid chromatography
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一、影响分离的因素
factors influenced separation
线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 ºC 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器
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四、制备型液相色谱
preparative liquid chromatography
获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。 半制备柱（内径8mm，长度15 ～ 30cm），一次制备量 ０.1～１mg；
超载，分离切分使待分离组分成 为主成分（富集）后，再次分离 制备。
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3. 制备型液相色谱
制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进 样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。
制备柱：内径20～50mm，柱长50cm。
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第一节 高效液相色谱的特点与仪器
feature and instrument of HPLC
1.色谱柱的柱容量（柱负荷）
对分析柱：不影响柱效时的最大进样量； 对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量； 超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。
超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降 低10%为宜。
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2. 液相制备色谱的方法
收集组分时，通常有以下情况： （1）可获得良好分离，主峰 使用制备柱，超载提高效率； （2）两主成分之间的小组分；
气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其 选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱 的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。
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二、分离类型选择
choice of separation types
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三、 HPLC的应用
application of HPLC
1. 环境中有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：差示折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药 残留量进行分析。
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2. 稠环芳烃的分析
稠环芳烃多为致癌物质。 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 ～100%甲醇
第五节 离子色谱法
ion chromatograph
第六节 超临界流体色谱
结束
supercritical fluid chromatograph
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第十章 液相色谱分析法
high performance liquid chromatograph
第四节 影响分离的因素与操
作条件的选择
factors influenced separation and choice of operation condition
一、影响分离的因素
factors influenced separation
第二节 基本原理与主要分离类型
basic principle and main separating types
第三节 固定相与流动相
stationary phase and mobile phase
第四节 影响分离的因素与操作条件选择
factors influenced separation and choice of operation condition
1. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一 ，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：
H=A+Cu 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。
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• 液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故 降低传质阻力是提高柱效主要途径。 • 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。