卟啉光敏剂的合成、生物活性筛选与构效关系研究

卟啉光敏剂的合成、生物活性筛选与构效关系研究光动力疗法(Photodynamic Therapy, PDT)是近年来发展起来的一种新的物理化学治疗技术,其基本原理是光敏剂在特定波长光源的激发下进行能量跃迁,随后将能量转移给生物体内的氧,后者形成单线态氧、自由基或自由基离子等,它们作用于靶细胞,引起细胞死亡或凋亡。PDT以有效、可协同性、重复性和相对成本低等优点引起广泛关注。

光敏剂是PDT治疗的关键,针对目前临床常用光敏剂存在的细胞摄取量低、缺乏靶向性和暗毒性较强、代谢缓慢引发滞后的光毒性等缺陷,本论文设计合成了一系列新型的卟啉类光敏剂,并对其光动力生物活性进行了评价和构效关系研究,以期筛选出暗毒性低,选择性强,活性好的光敏剂。本论文工作主要分为两个部分：第一部分为四苯基卟啉衍生物的合成与光动力抗菌活性研究。

细菌感染近年来呈现上升趋势,而且由于抗生素的过度使用,出现了多重耐药菌。迫切需要新的药物或新的替代疗法。

光动力抗菌化学疗法(Photodynamic antimicrobial chemotherapy, PACT)是利用光敏剂和可见光诱导微生物病原体光动力灭活的一种抗菌方法,目前尚未发现其耐药性。卟啉类光敏剂具有良好的光谱特性和较高的单线态氧产率,且在生物体内广泛存在,代谢途径明晰,生物相容性好,作为抗菌光敏剂受到广泛的研究。

以往的文献报道阳离子卟啉光敏剂对革兰氏阳性菌与阴性菌均有灭活作用,但在结构中引入许多非天然的修饰基团,易造成光敏剂的毒性增强,体内生物相容性差、细菌吞噬量有限等缺陷。考虑到碱性氨基酸如L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸为生物所需营养物质,且在生理条件下携带正电荷,因而作为阳离子基

团卟对卟啉进行修饰将可获得生物相容性优越且靶向性强的新型光敏剂。

在该部分我们以三个天然碱性氨基酸L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸作为

修饰基团合成了新型的阳离子光敏剂,共合成了化合物56个,其中38个化合物未见相关文献报道,目标产物24个。涉及合成路线5条。

所有化合物的结构均经过‘HNMR、 MS确证。并对所有目标产物的熔点、紫外光谱、光稳定性、脂水分布系数、单线态氧的产率、热稳定性进行了测定。

化合物的紫外光谱显示：所合成的化合物具有卟啉化合物典型的420nm左右的Soret带与500-670nm弱吸收的Q带,并且随着氨基酸取代数目的增加,化合物的最大吸收波长逐渐发生蓝移。光漂白实验结果显示：随着激光照射时间的增加,目标化合物的最大紫外吸收波长的吸光度值有稍许降低,且随着氨基酸取代的数目增多,其光漂白速率增加,光稳定性相对下降,但总体变化不大,所得化合物具

有一定的光稳定性,符合作为光敏剂的条件。

化合物的单线态氧测定结果显示：氨基酸的引入使化合物的单线态氧产率有增加的趋势,其中四赖氨酸取代的卟啉轭合物4i有相对较高的产率(ΦΔ=0.95)。另外,在所测得的目标化合物中,随着氨基酸取代基数目的增多,化合物的脂水分配系数逐渐下降,水溶性得到了改善。

化合物的热重分析实验显示：所得化合物在200℃之前对热稳定。化合物的光动力抗菌实验包括吞噬曲线的测定、MIC与MBC的测定、浓度效应曲线及激光共聚焦显微成像。

结果显示：氨基酸基团的引入,提高了细菌对光敏剂的吞噬量,其光动力抗菌活性得到了显著提高,且随着氨基酸数目的增多而呈逐渐增加的趋势。4c,4e,4g 为连接两个赖氨酸基团的化合物,在浓度为10μM时,它们对三种菌的最大杀灭

作用为：存活率降至3.0-log10(E. coli),<6.0-log10(MRSA),2.5-log10(P. aeruginosa)。

其中带有四个赖氨酸基团的化合物4i,具有最强的光动力灭菌活性,浓度在3.9μM时,能够杀灭细菌MRSA使其存活率降至4.0-log10, P. aeruginosa至3.0-log10, E. coli至<6.0-log10，值得进一步的研究。第二部分为卟啉类化合物光动力抗肿瘤活性的评价与构效关系研究。

本论文在本实验室前期工作的基础上,进一步探讨或完善该类化合物抗肿瘤作用的构效关系,对第一部分与本部分合成的共21个卟啉衍生物进行了光动力抗肿瘤药理活性的评价。MTT法测试结果显示：随着化合物浓度从1.25μM上升至20μM,其光毒性逐渐增强,具有明显的量效依赖关系,其中化合物4a,4j其浓度在5μM时,抑制率大于80%,且在该浓度下,其暗毒性较小(<30%)；化合物4f,4b,4c,4e在2.5μM时化合物对肿瘤细胞Hela的抑制率分别为

87.91%,79.31%,81.64%,85.06%,IC50值分别为：<0.05μM,1.24μM,0.90μM,1.85μM;可以作为新一代的光敏剂先导物进行开发和研究。

该类化合物的光动力抗肿瘤作用的初步构效关系分析表明：四苯基卟啉环上的氨基的存在对活性产生有利影响,而当引入一个或两个氨基酸时,活性增强,而多个氨基酸基团的引入会降低抗肿瘤活性。