单抗腹水制备过程中遇到的问题及对策

通过小鼠腹水如何大量制备单克隆抗体

教学中产生的问题：单克隆抗体的制备过程中，大家都关注了筛选过程，往往没有关注制备的两条途径，其中之一，细胞培养的途径许多学生能理解，而腹水生产的途径就不熟悉，教材中也没有介绍，而这对内环境的知识也是有帮助的。
单克隆抗体（monoclonal
antibody，MAb），是针对专一的抗原决定簇产生的抗体。
单克隆技术又名杂交瘤技术起源于1975年，主要原理是利用产生抗体的B细胞与骨髓瘤细胞杂交融合成杂交瘤细胞，生产抗体。
两种方法生产单克隆抗体：
目前大量制备单抗的方法主要有两种方法，一种是动物体内生产法（腹水制备），在小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞，杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体，约1-2周，可见小鼠腹部膨大，用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体；另一种是细胞体外培养法，将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养，在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。
由于腹水中单克隆抗体的产生通常会导致内源性宿主蛋白的污染，因此细胞培养对于小规模和大规模单克隆抗体的生产至关重要。
重点问题解疑：如何通过腹水产生单克隆抗体？
杂交瘤细胞被注射到小鼠腹腔内，由于有组织液提供足够的营养，所以能够大量分裂。同时部分杂交瘤细胞分泌抗体，这些细胞和抗体导致腹腔组织液渗透压增高，血浆和淋巴就会渗出并潴留在腹腔内形成腹水。
腹水制备法的优点：
腹水制备法操作简单、制备成本低，是目前国内生产抗体的主要方式，但是，得到的腹水常混有小鼠的各种杂蛋白（包括免疫球蛋白Ig），而且还有污染动物病毒的危险。而体外培养法通过转代培养制备的细胞培养得到的抗体，不但不含小鼠杂蛋白和动物病毒，而且抗体易纯化，目前在国外抗体生产中非常流行。

实验中可能出现的常见问题与解决办法

实验中可能出现的常见问题与解决办法一．污染污染是指由于微生物的侵染，在组织培养容器中滋生大量菌斑，使组培材料不能正常生长和发育的现象，主要有以下5方面的原因：1.器具灭菌：实验的所有器具都要在121°C消毒25min，若灭菌温度不够或者时间不足，都会导致污染。

灭菌时要求冷空气完全排除，否则会达不到指定温度。

其次，要做好灭菌登记，杜绝出现人为失误造成的污染。

此外，在接种过程中，每用一次都要在火焰上彻底灼烧，特别在接触到污染物时极易引起器具污染。

2.外植体：很多材料在灭菌后其实还是带菌的，不过量比较少，短期应该观察不到被感染的现象。

3.接种操作：首先，接种人员的手，手腕要用酒精棉球好好擦拭。

其次，对于放置在外的培养物（灭菌好的培养基）其瓶子外壁上有灰尘与微生物，放入超净台前可以用酒精消毒一下。

再者，很容易出现瓶口的污染，所以接种人员的技术要娴熟，干练。

4.环境条件：加强环境的灭菌消毒。

若有污染的材料不可以就地清洗，必须高压杀菌后再清洗，否则会导致大量孢子弥漫。

此外，要及时打扫卫生，定期蒸熏消毒。

保证环境的干净。

5.超净工作台：要定期对初过滤器进行清洗和更换。

此外，每次使用前要提前20min打开机器预处理，并对台面进行酒精喷雾消毒。

二．材料死亡实验过程中，很可能出现材料死亡，主要有以下几个方面：1.外植体灭菌过度：一旦材料太小或灭菌时间太长，剂量太大，就会导致材料死亡，所以要严格控制时间。

2.污染：大量污染会造成材料死亡。

3.培养基配置出现问题：在激素配置或营养成分配置出现问题时，材料易死亡，常常发生在无生长点的材料和愈伤组织中。

4.培养环境的恶化：温度过高，透气不好，培养过于密集，久不转移，有害气体的累积都会造成培养材料的死亡。

【措施】：【1】.选用较为温和的灭菌剂，降低药物浓度，减少灭菌时间，或选取较为坚强的外植体（eg：生长季节取芽）【2】注意个人卫生，严格按照规则进行操作。

【3】认真配置各种母液及培养基，选用盐含量较低的培养基，也可以试着用1/2或1/4的培养基，并调整各激素的用量和配比。

单克隆抗体制备流程

单抗制备流程1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。

这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。

一、细胞融合前准备(一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。

一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。

下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／ ip (腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／ ip↓3周后加强免疫(融合前三天) 1×10７／ ip或iv(静脉内注射)↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。

要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。

商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般～1ml ／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。

小鼠单抗腹水纯化步骤

小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。

辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。

【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。

○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。

2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。

3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。

注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。

单抗制备

杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤包括：（1）抗原制备；（2）免疫动物；（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；（4）细胞融合；（5）杂交瘤细胞的选择培养；（6）杂交瘤细胞的筛选；（7）杂交瘤细胞的克隆化；（8）单克隆抗体的检定；（9）分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；（10）单克隆抗体的大量制备。

下面简要介绍单克隆抗体的制备过程：1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。

一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。

抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。

2、细胞融合采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。

将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。

在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。

3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT 选择性培养基。

在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。

未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。

只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。

4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。

通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。

采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。

经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。

制剂生产过程中常见问题和处理方法

制剂生产过程中常见问题和处理方法在制剂生产中，由于涉及到众多环节和复杂的工艺流程，常常会遇到各种各样的问题。

这些问题如果不加以妥善处理，不仅会影响产品的质量和产量，还可能导致生产延误、成本增加甚至安全事故。

下面我们就来探讨一下制剂生产过程中的一些常见问题以及相应的处理方法。

一、原材料质量问题原材料的质量是影响制剂产品质量的关键因素之一。

常见的问题包括原材料的纯度不达标、含水量过高、杂质含量超标等。

处理方法：1、加强原材料的采购管理，选择质量可靠的供应商，并建立严格的原材料检验制度。

对每一批次的原材料进行全面的检测，包括外观、纯度、含水量、杂质含量等指标，确保原材料符合质量标准。

2、对于纯度不达标或杂质含量超标的原材料，应进行进一步的提纯或去除杂质处理。

如果无法处理，应坚决予以退货。

3、控制原材料的储存条件，避免受潮、受污染等情况。

对于易吸湿的原材料，应存放在干燥的环境中；对于易氧化的原材料，应采取密封、避光等措施。

二、设备故障问题制剂生产需要依靠各种设备，如混合机、粉碎机、压片机、灌装机等。

设备故障会导致生产中断，影响生产效率。

处理方法：1、建立完善的设备维护保养制度，定期对设备进行检查、清洁、润滑、调试等保养工作，及时发现和排除潜在的故障隐患。

2、配备专业的设备维修人员，提高维修人员的技术水平和应急处理能力。

当设备出现故障时，能够迅速准确地诊断故障原因，并采取有效的维修措施。

3、储备必要的设备备件，以便在设备出现故障时能够及时更换，减少设备停机时间。

4、对于关键设备，可以采用双机备份或备用生产线的方式，以确保生产的连续性。

三、工艺参数控制问题制剂生产过程中的工艺参数，如温度、压力、搅拌速度、反应时间等，对产品的质量和产量有着重要的影响。

如果工艺参数控制不当，可能会导致产品质量不稳定、收率降低等问题。

处理方法：1、在生产前，对工艺参数进行充分的研究和验证，确定最佳的工艺参数范围。

在生产过程中，严格按照工艺规程控制工艺参数，确保工艺参数的稳定性和准确性。

单克隆抗体生产过程中的杂质去除技术之现状与展望

单克隆抗体生产过程中的杂质去除技术之现状与展望生物制剂在临床治疗和商业上的成功，推动了全球对生物产能的巨大需求。

生物制剂上游产能已经得到显著提升，但同时也给下游去杂和纯化过程造成障碍，开发高通量去杂和纯化技术成为新的瓶颈。

细胞培养环境的多样性使得制品中的杂质复杂多样，痕量的杂质残留都会在人体产生严重的免疫反应，因此必须使制品所含杂质的成分和浓度控制在制品的质量要求之下。

制品中的杂质主要由两部分组成，一种与制品本身相关，另一种由生产过程中带入。

与制品相关的杂质包含制品组分的多聚体、降解产物、错误翻译产物等；生产过程中带入的杂质包括残留的细胞组分、添加剂、培养基等。

其中宿主细胞蛋白质（HCPs）和核酸（DNA）是最主要的杂质。

杂质去除始于制品纯化的初始阶段，以减轻下游纯化的负担，也有利于保护下游纯化设备、提高纯化效率。

所使用去杂技术的的适用性、去杂效率、运行成本等都需要纳入考虑范畴。

本文主要介绍三种去杂技术：沉淀、絮凝和深层过滤。

沉淀技术沉淀技术长期用于血浆蛋白纯化、抗体分离和富集，通过降低目标组分的溶解度实现。

沉淀极大浓缩产物，实现溶剂置换。

改变培养液pH、电导率和加入沉淀剂等可选择性地改变沉淀对象。

改变细胞培养液pH，尤以使培养液pH低于杂质等电点，可有效地去除HCPs和DNA。

沉淀剂是一类低溶解度物质。

沉淀剂破坏胶体的平衡状态，触发沉淀。

降低培养液pH与沉淀剂共同作用，低pH条件进一步降低沉淀剂的溶解度从而引起共沉淀。

辛酸及其钠盐用于沉淀血浆、血清和腹水蛋白质。

酸性条件下，酸性蛋白质（如HCPs）被沉淀，偏碱性的抗体保持溶解状态。

有研究发现，辛酸对抗体的纯化效果优于抗体片段（FC片段），可能由于抗体的疏水基团包裹于内。

辛酸破坏包膜病毒的脂质层，使病毒失活，但对非包膜病毒效果不明显。

有机溶剂通过分步沉淀达到纯化混合蛋白质的目的。

但高浓度的有机溶剂引起蛋白质变性，其疏水基作用产生的高温同样使蛋白质变性。

细胞冻存复苏及腹水制备-LM

细胞冻存复苏及腹水制备-LM
四，细胞培养时的注意事项：
1，要定期观察细胞的状态，发现问题及时处理，切忌将细胞弃之不顾。 2，不能频繁将细胞拿进拿出，会影响细胞的生长。 3，不能频繁更换培养基，细胞生长有一个适应过程。 4，必须更换培养基时应严格无菌操作，避免交叉污染。如液体变黄，死细胞过多等原因可考虑换液。 5，培养基应该做到专人专用。 6，发现细胞污染后需要及时处理，避免传染。
第二章，细胞的复苏
一，确定复苏的细胞数二，制备适量的饲养细胞三，细胞的复苏四，细胞复苏的注意事项
细胞冻存复苏及腹水制备-LM
一，首先确定复苏的细胞数
1，比较紧急的项目对于研发性腹水一般要先和领导沟通确定哪些项目紧急，
紧急的项目要随时准备复苏。例如，目前紧急的有肿瘤系列细胞如CA153CR，CA724，colo205等。中样腹水一般由领导直接下单子。 2，根据实际情况自行安排
细胞冻存复苏及腹水制备-LM
二，细胞培养的污染
细菌污染培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，PH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。
小鼠胃癌细胞的球菌感染
2021/2/1
细胞冻存复苏及腹水制备-LM
二，细胞培养的污染
真菌污染
培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。
细胞冻存复苏及腹水制备-LM
二，小鼠的选择
小鼠的选择很研发重要，不仅关系到腹水的数量还关系到质量，研发性和中样细胞必须挑选状态好的小鼠，小鼠健康标准：1,食欲旺盛；2,眼睛有神，反应敏捷； 3,体毛光滑，肌肉丰满，活动有力；4,身无伤痕，尾不弯曲，天然孔腔无分泌物，无畸形；5,粪便黑色呈麦粒状；6,小鼠的尾、趾有无溃烂；7,检查眼、耳、鼻、肛门有无分泌物和异常增殖物;8,肚子不瘪进去

小鼠单抗腹水纯化步骤

小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。

辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。

【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。

○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。

2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。

3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。

注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。

单克隆抗体制备常见问题分析

单克隆抗体制备常见问题分析一、前言1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。

这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。

虽然单抗技术已经非常成熟，但是由于其经济价值，仍然有很多人在从事这项研究，而且其中也会遇到很多这样那样大问题。

我本人就是其中一个，由于是第一次做单抗，所以过程中遇到了很多困难，终于在前几天得到了几株阳性克隆。

鉴于此，我将单克隆抗体制备的整个过程贴出来，同时搜索了园子里面一些战友的求助帖以及一些经典的应助帖，希望能对将要或是正在从事这项研究的战友们有些帮助。

二、动物的免疫选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。

一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

1. 颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。

下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10,,0.5ml ip (腹腔内注射)? 2,3周后第二次免疫1×10,,0.5ml ip? 3周后加强免疫(融合前三天) 1×10,,0.5ml ip或iv(静脉内注射)?取脾融合2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂:福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。

要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。

商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

初次免疫Ag 1,50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射? (一般0.8,1ml 0.2ml,点)?3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip? (ip剂量不宜超过0.5ml)?3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip? (5,7天后采血测其效价，检测免疫效果)?2,3周后加强免疫，剂量50,500μg为宜，ip或iv?3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如?将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。

单抗中常见问题解析

1. 为什么免疫后没有效价或免疫后效价低？答：可以从这几个方面一一考虑：（1）设计的抗原与被免疫的动物内源蛋白有极高的同源性或者抗原是免疫原性极差的小分子物质。

对于前一种情况应该重新设计抗原，设计抗原时尽量选取目标蛋白特异性的序列，可以设计为短肽然后再与载体蛋白偶联之后免疫；对于后一种情况，首先确认小分子物质是否已经正确地和载体蛋白偶联，如果偶联没有问题，可以更换其它的载体蛋白，一般来说KLH是所有载体中较为优先考虑的蛋白。

（2）免疫的周期不正确。

免疫周期过长或过短，各免疫步骤之间的间隔过长或过短都有可能影响免疫效果，详细请参考本站有关动物免疫的部份，实际操作中的相关程序与本站推荐的程序相差尽里不超过50%的偏差。

（3）免疫佐剂不合适。

TiterMax等佐剂在免疫时，对于某些抗原可能效果不佳，弗低佐剂也不能保证完全有效，此时可以考虑更换佐剂尝试。

（4）免疫剂量不合理。

过大的免疫剂量可能导致免疫耐受，过少的免疫剂量可能无法激活免疫应答。

一般来说，实际免疫剂量与本站所推荐的剂量不要相差两倍以上。

（5）免疫途径不合理。

对于有些免疫原性弱的抗原，可以考虑脾内免疫方法，具体操作本站上也有详细的讲解。

（6）测效价的过程存在错误操作，尤其考虑包被是否成功或二抗使用是否正确。

同时，一抗（即血清）稀释梯度尽量放宽，一般建议从1：500或1：1000开始作梯度稀释。

对于小分子物质，效价达到1：2000仍可视为免疫成功。

2. 为什么融合后细胞不长或者融合后克隆很少？答：可以从这几个方面考虑：（1）免疫用的动物品系不正确或者品系不纯。

免疫用的动物一般应该与骨髓瘤来源的动物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤细胞时应该选用Balb/C小鼠，同时必须使用品系纯正的小鼠。

（2）培养基中加入了过高浓度的HAT，或者仅A的浓度过高或HT的浓度过低，建议用纯的骨髓瘤和已有的杂交瘤作HAT浓度筛选。

（3）培养基不正确或血清浓度不正确或使用了劣质血清。

浅析单抗原液的生产工艺

浅析单抗原液的生产工艺单抗即单克隆抗体，是通过将抗原注入到宿主动物体内启动机体免疫应答而产生的。

单抗药物在病毒性疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤及烈性传染病的防治领域有着突出的作用。

单抗都是采用哺乳动物细胞进行表达，主要以中国仓鼠卵巢细胞系（CHO）为主。

在抗体纯化过程中除了要考虑回收率和纯度以外，还需有效的灭活和清除病毒。

单抗原液车间生产的原液不适用热力灭菌工艺，通常选择无菌操作的非最终灭菌生产工艺。

单抗生产中病毒污染风险：CHO细胞系是制造许多治疗性蛋白质的主力。

CHO细胞的生物安全等级为一级，CHO本身存在内源性逆转录病毒，这是已经被证实了的，但这种病毒对人类不具有致病性。

从药物质量安全角度出发，遵循SFDA 公布的《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》，加入病毒去除和灭活方法。

此外，基于哺乳动物细胞进行的培养发酵，产品被病毒污染是考虑的主要生产风险之一。

病毒污染的其他潜在来源可能还有：使用已经被污染了的主细胞种子库或工作细胞种子库；操作员可能带进病毒，污染工艺；细胞线残留上一级仍有活力的病毒。

因为哺乳动物细胞为带入的病毒污染物提供了合适的宿主细胞，因此病毒量可能会随着细胞培养而放大，进而可能增加生产过程的整体风险。

单克隆抗体药品生产通常包含四个模块：上游培养、下游纯化、分析质控和制剂。

单抗的生产工艺：单抗原液的生产工艺主要概括为两个阶段：上游细胞的培养、发酵和下游的纯化。

细胞种子经摇瓶、WAVE反应器、一、二、三级种子培养扩增后进入发酵罐进行发酵培养。

发酵结束后经离心机进入下游进行纯化。

离心后的料液经过层析、超滤后变成原液。

具体的工艺流程描述如下：（1）细胞复苏：细胞复苏和冻存讲究“慢冻快溶”，复苏时一定要将冻存在液氮或-80℃中凝固的细胞冻存液快速融化至37℃，使胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

（2）细胞传代培养：①悬浮细胞培养：是指细胞在培养液中呈悬浮状态进行生长繁殖，能连续培养和连续收获的培养技术。

腹水的制备

这里还有一个获得腹水经验性步骤，不知道能否帮的了你1) 选用雌性Balb/c小鼠，小鼠一定要健康。

2) 腹腔注射0.5ml石蜡油/鼠，1-2周后（我一般选用注射10天后的小鼠，不过注射3-4周后的小鼠仍可用）腹腔注射细胞。

3) 打腹水时，细胞要处于对数生长期，细胞数量过多过少都不好，我一般是注射10^6/鼠，每株杂交瘤打3只。

4) 约7天后，触摸小鼠腹部有肿胀感时，即可用16号针头采集腹水，针头刺入腹腔后，一般即有腹水喷出，若没有腹水流出，可轻旋针头，操作时要有耐心。

我每次可采集4-5ml 腹水/鼠，有时甚至可达6ml，隔天后再次采集，一般可采集三次左右，每只小鼠可采集十多ml腹水。

有时一只小鼠采到20多ml腹水后仍然活得很好（这也很烦）。

还有一点，采集用的针头要事先灭菌！小鼠对不同杂交瘤细胞的敏感性不同，有的注射后一周即死亡，有的会出现血性腹水，有的可以反复收取腹水2-3次。

我做过2种类别10株细胞的腹水，以下供参考：1、每组细胞准备2只小鼠，8-10周龄，最好与制备单抗的小鼠同系；接种杂交瘤细胞前预先使用致敏剂，可以用石蜡油（提前一周）或不完全弗氏佐剂（提前三天）；2、第一只接种细胞数可以控制在10的6次方，如果出现腹水少、死得快的现象，则第二只小鼠接种细胞数不能超过5*10的5次方；注射细胞少腹水形成慢但效价会更高；3、待第7天左右开始密切观察小鼠的腹水及存活情况，如果活力佳，有明显移动性腹水，可以放腹水2次左右；一旦发现小鼠活动受限，要立即处死放腹水；4、一般每次可以收取2-3ml。

制备小鼠腹水细节剪刀剃毛，酒精消毒止血钳、镊子夹提腹部皮毛小号针头，越细越好，减少损伤eppendorf管或玻璃试管装均可，但要高压灭菌刺入针头时注意先提起腹部皮毛，在腹部中线旁刺入空隙，勿扎住内脏腹水采集分成两类：1：活着是抽取腹水2: 处死抽取腹水活着抽取腹水主要用到的是酒精棉球与注射器（2-5ml）以及灭后菌的eppendorf管(因为腹水还要分离所以用这个最好，便于离心）。

单克隆抗体制备流程

单抗制备流程1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫旳小鼠脾细胞进行融合，形成旳杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。

这一技术上旳突破不仅为医学与生物学基本研究开创了新纪元，也为临床疾病旳诊、防、治提供了新旳工具。

制备单克隆抗体涉及动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞旳克隆化、冻存以及单克隆抗体旳大量生产，要通过几种月旳一系列实验环节，下面按照制备单克隆抗体旳流程顺序，逐个简介其实验措施。

一、细胞融合前准备(一) 免疫方案选择合适旳免疫方案对于细胞融合杂交旳成功，获得高质量旳McAb至关重要。

一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原旳特性不同而定。

1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得较好旳免疫效果。

下面以细胞性抗原为例旳免疫方案:初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0.5ml ip↓3周后加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射)↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。

规定抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水旳乳糜状，放一滴在水面上不易立即扩散呈小滴状表白已达到油包水旳状态。

商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀旳分枝杆菌充足混匀。

初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0.8～1ml 0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不适宜超过0.5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是某些弱抗原)旳免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原旳免疫原性，另一方面可减少抗原旳使用量。

配制输液液体中存在的问题及对策(一)

配制输液液体中存在的问题及对策(一)【关键词】配制液体;问题;对策目前临床应用的药物存在着效价高、剂型小、价格贵等特点。

护士，特别是大医院配液护士，在执行医嘱操作过程中，由于赶时间或不正确的操作习惯，往往忽视了那些喷洒在墙面、地面和残留在安瓿小瓶底部的药液，使病人不能如数得到治疗量;一些配伍禁忌的药物用于患者，不仅给患者造成经济负担，更可怕的是，是否会给患者生命造成威胁。

如何将药物安全、及时、准确的用于患者是每个临床工作者需要面对的严肃而谨慎的问题，我们结合工作体会对此进行探讨。

1药液丢失原因分析我们近日对某院9个科室进行了详细观察，发现治疗室、墙面、窗户上及治疗护士的工作服上均有药迹存留，经过认真分析，有以下原因：1.1小瓶内的压力在当今种类繁多的抗生素小瓶内，压力是不一样的，有的是正压，有的是负压，有的则是等压，我们曾经试用输液的方法，想将注射用水注入抗生素小瓶内，但90%的抗生素小瓶通过等压输液方式，注射用水是进不到抗生素小瓶内，只有10%的抗生素瓶内是负压，液体可以进入。

因此护士每天需从溶媒中抽出液体，注入抗生素小瓶，稀释后又从抗生素小瓶中抽出注入溶媒中，当碰上小瓶内是负压，护士手上的注射器毫不费力，溶媒就可以进入小瓶，再抽吸一定空气注入小瓶内，很轻松抽出稀释后的药液注入溶媒中，完成配制。

如果抗生素小瓶内是正压，我们向小瓶内应直接注入溶媒，不可注射空气，否则瓶内迅速溶解的液体可从针眼的侧面喷出，在抽液过程中，以手上的感觉决定是否推空气，不可用力过猛，加大瓶内压力，使药液从针眼处喷出。

如瓶内是等压，我们在注入溶媒时，尽量不推注空气，在抽吸药液时，视手上感觉的压力大小注入空气，但必须边推气边抽吸，推气速度不可过猛，有时我们看到小瓶内的药液从针孔喷出，护士手中的注射器无论用力持住针栓，但针头刺入的小孔侧边仍有药液喷出，这是推注空气过多、过猛造成。

此时，必须将小瓶颈向上，立即抽出空气才能阻止药液喷出。