免疫比浊检验技术原理与进展
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自动化分析 (免疫比浊)
力强的多抗； 抗原抗体反应的溶液，合适的PH（6.5～8.5） 和离子强度； 使用增浊剂可增强检测信号。
自动化免疫比浊
免疫比浊分析技术发展 两 个 阶 段
测定抗原抗体形成后的阶段 散射(终点)比浊
测定抗原抗体结合的峰值 速率散射比浊
免 疫 比 浊 法 分 类
当一束光 线通过溶 液受到光 散射和光 吸收两个 因素的影 响而使光 的强度减 弱
准曲线，
对抗原过量进行阈值限定
先测定预反应时段抗原-抗体复合物的散射光信 号，若未超过阈值，可进行全量样本测定。若超 过阈值，提示样品浓度过高，需稀释后测定。
三、速率散射比浊分析
三、速率散射比浊分析 （一）基本原理
— 是测定抗原抗体结合反应的动态过程。 — 所谓速率，是在单位时间内抗原抗体结合形成 复合物的速度。将各单位时间内形成复合物的 速率及测定的散射信号连接在一起，即是动态 的速率比浊分析。 — 当仪器测定到某一时 间内形成速率下降时， 即出现速率峰，该峰 值的高低，即代表所 测抗原的量。
检 测时 分间 两 个
在预反应时段， 加小量样本与 抗体反应， 测定第一次散 射光信号值
加全量样本， 约反应 2分 钟后，第二 次测定散射 光信号
信号峰值
计算机处理 转换为样 品浓度
（二）抗原过量检测
采用两项保证措施：
抗体过量
在检测中抗体结合抗原的能力可达到相当于正常 血清的50倍以上，以保证高浓度样本中的抗原与 抗体的结合。
免疫散射比浊法
免疫散射比浊法
免疫散射比浊法是一种分析化学和生物样品中特定元素的可靠
测定方法。它的原理是以免疫抗体的相互作用作为根据，从而实现物质的分子尺度上的测量。在实际应用中，免疫散射比浊法可以检测到特定的元素，从而为科学家、设计师以及分析师提供重要的信息。
免疫散射比浊法是一种非平衡的技术，它可以被用来测量物质中极低浓度的元素。因此，它在微量成分分析和样品分析中都得到了广泛的应用。免疫散射比浊法的优点是它可以检测非常低的元素浓度，而且它在检测不同元素时，测量速度可用较快，并可以得到准确可靠的结果。
在免疫散射比浊法中，研究人员首先将样品分装成浓度较低的悬浮液，然后以特定的浓度将免疫抗体添加到样品中。接着，将样哮明装入特殊的仪器中，当抗体与抗原发生结合时，仪器就能够测量出相关元素的特定含量。
除此之外，免疫散射比浊法还可以对细胞、微生物和大分子组织进行测量。它的可靠性非常高，可以检测到极低的浓度的元素，而且具有极高的灵敏度和精确度。此外，它还可以比较多种元素，从而得出有价值的结论。
然而，免疫散射比浊法也有一定的局限性。它的结果受到环境因素的影响，对温度、pH和有机溶剂等因素有较高的敏感性。而且，免疫散射比浊法也需要准备特殊的仪器，耗费工作量较大。
总之，免疫散射比浊法是一种可靠的测量技术，它可以检测到特
定元素的非常低浓度，应用范围很广，同时也有一定的局限性。因此，在分析化学和生物样品中特定元素时，应该谨慎考虑这一技术的优缺点，选择最合适的方法。
免疫比浊法
6
免疫比浊法的特点：
整理版ppt
实验原理
优点
稳定性好，敏感性高(达ng/L)、精确度高，干扰因素少，结果判断更加客观、 准确。
快速、简便，结果回报时间短，便于及时将各种信息向临床反馈，又可节约 大量人力物力，利于大批量样品的处理。
能更好地避免标本之间的污染及标本对人的污染。
可利用多道计数器、测光仪，同一份样品同时测定几十种和临床有关的分析 项目，血清用量少，具有明显的应用优势。
8
整理版ppt
实验材料
1.免疫球蛋白A,M,G（IgA, IgM, IgG）测定试剂 2.免疫球蛋白A,M,G （IgA, IgM, IgG）校准品，蒸馏水， 血清样本 3.微量加样枪、试管 4.分光光度仪、水浴箱
9
实验方法 整理版ppt
空白管
+蒸馏水 （10mL）
校准管 +IgX试剂 37℃ （1mL） 5min
实验 免疫比浊法检 测免疫球蛋白
整理版ppt
免 1疫 系
整理版ppt
1
实验原理
2
材料和方法
3
实验结果
2
整理版ppt
实验原理
免疫球蛋白（Ig）是指一类具有抗体样结构或具有抗体活性 的球蛋白，能与诱导其产生的抗原发生特异性结合，是体液免 疫应答的主要效应分子。免疫球蛋白水平增高常见于各种慢性 细菌感染，如慢性骨髓炎、慢性肺脓肿等。在多种自身免疫病、 肝脏疾病患者中可有IgG、IgA、IgM升高：在系统性红斑狼疮 患者中以IgG、IgA或IgG 、IgM升高较多见；在类风湿关节炎 中则以IgM升高为主。免疫球蛋白水平降低多见于先天性体液 免疫缺乏病、肾病综合症、吸收不良综合症、淋巴瘤、放射损 伤和免疫抑制剂治疗后等情况。
免疫比浊法的特点：
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实验原理
优点
稳定性好，敏感性高(达ng/L)、精确度高，干扰因素少，结果判断更加客观、 准确。
快速、简便，结果回报时间短，便于及时将各种信息向临床反馈，又可节约 大量人力物力，利于大批量样品的处理。
能更好地避免标本之间的污染及标本对人的污染。
可利用多道计数器、测光仪，同一份样品同时测定几十种和临床有关的分析 项目，血清用量少，具有明显的应用优势。
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实验材料
1.免疫球蛋白A,M,G（IgA, IgM, IgG）测定试剂 2.免疫球蛋白A,M,G （IgA, IgM, IgG）校准品，蒸馏水， 血清样本 3.微量加样枪、试管 4.分光光度仪、水浴箱
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实验方法 整理版ppt
空白管
+蒸馏水 （10mL）
校准管 +IgX试剂 37℃ （1mL） 5min
实验 免疫比浊法检 测免疫球蛋白
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免 1疫 系
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1
实验原理
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材料和方法
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实验结果
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实验原理
免疫球蛋白（Ig）是指一类具有抗体样结构或具有抗体活性 的球蛋白，能与诱导其产生的抗原发生特异性结合，是体液免 疫应答的主要效应分子。免疫球蛋白水平增高常见于各种慢性 细菌感染，如慢性骨髓炎、慢性肺脓肿等。在多种自身免疫病、 肝脏疾病患者中可有IgG、IgA、IgM升高：在系统性红斑狼疮 患者中以IgG、IgA或IgG 、IgM升高较多见；在类风湿关节炎 中则以IgM升高为主。免疫球蛋白水平降低多见于先天性体液 免疫缺乏病、肾病综合症、吸收不良综合症、淋巴瘤、放射损 伤和免疫抑制剂治疗后等情况。
免疫比浊分析
2020/11/4
4
免疫比浊技术分类：
透射免疫比浊法
（turbidimetric immunoassay）
散射免疫比浊法
（nephelometry immunoassay）
终点散射比浊法 速率散射比浊法
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6
一、免疫透射比浊法
（一）原理：
一定波长的入射光线通过抗原抗体反应后的溶液 时，由于溶液中的免疫复合物微粒对光线的吸收、反射 和折射而使透射光减少，可用吸光度表示。
所谓速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成免疫复 合物的量（不是免疫复合物累积的量），连续测定各时间 复合物形成的速率与其产生的散射光信号联系在一起，形
成动态的速率散射比浊法，每项检测仅1～2min即可完成
。
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抗原抗体复合物形成时间与速率的关系
累计时间
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
复合物（<19S），在增浊剂（如PEG、NaF等）的作用 下，迅速形成免疫复合物微粒（>19S），使反应液出现浊
度。这种浊度可用仪器检测，用吸光度表示。
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3
第一节 免疫浊度分析原理
在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量 随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即待 测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。
免疫比浊法检测免疫球蛋白
滤光片 光源
透射比浊法的缺陷：
1溶液中存在的抗原－抗体复合物分子应足够大,分 子太小则阻挡不了光线的通过.
2溶液中的抗原－抗体复合物的数量要足够多.如果 数量太小,溶液浊度变化太小,对光通量影响不大.
3 透射比浊是依据透射光减弱的原理来定量的,因此 只能测定抗原－抗体反应的第二阶段,检测仍需抗 原－抗体温育反应时间,检测时间较长.
透射比浊法: 在光源的光路方向00 测量透射光强度和被检测 溶液微粒浓度关系的方法.
透射比浊法和散射比浊法光路
IC
透射比浊法
I
检测器A
I0
θ
Iθ 检测器B
散射比浊法
免疫透射比浊法
一基本原理 ❖ 是个极其简单的方法.在抗原过量情况下,与待测样
品中相应的Ig发生抗原-抗体反应,形成可溶性复合物, 使反应介质的浊度发生改变.
散射比浊法的缺陷
1因为是一次性测定光吸收值,没有考虑每一个待 测样本的吸收和散射效果,可测定结果不准确
2测定的仍是抗原－抗体反应的第二阶段,不适合 快速检测.
3 终点法存在反应本底,测定样本的含量越低本底 比例越大,故在微量测定时,本底的干扰是影响 准确测定的重要因素.
影响免疫比浊测定的因素
1、抗原抗体比例 2、抗体的质量
免疫比浊法检测免疫球蛋白
免疫学系
实验原理
免疫浊度法是可溶性抗原、抗体在液相中 特异结合,产生一定大小的复合物,形成光的 折射或吸收,测定这种折射或吸收后的透射 光或散射光作为计算单位.
透射比浊法的缺陷：
1溶液中存在的抗原－抗体复合物分子应足够大,分 子太小则阻挡不了光线的通过.
2溶液中的抗原－抗体复合物的数量要足够多.如果 数量太小,溶液浊度变化太小,对光通量影响不大.
3 透射比浊是依据透射光减弱的原理来定量的,因此 只能测定抗原－抗体反应的第二阶段,检测仍需抗 原－抗体温育反应时间,检测时间较长.
透射比浊法: 在光源的光路方向00 测量透射光强度和被检测 溶液微粒浓度关系的方法.
透射比浊法和散射比浊法光路
IC
透射比浊法
I
检测器A
I0
θ
Iθ 检测器B
散射比浊法
免疫透射比浊法
一基本原理 ❖ 是个极其简单的方法.在抗原过量情况下,与待测样
品中相应的Ig发生抗原-抗体反应,形成可溶性复合物, 使反应介质的浊度发生改变.
散射比浊法的缺陷
1因为是一次性测定光吸收值,没有考虑每一个待 测样本的吸收和散射效果,可测定结果不准确
2测定的仍是抗原－抗体反应的第二阶段,不适合 快速检测.
3 终点法存在反应本底,测定样本的含量越低本底 比例越大,故在微量测定时,本底的干扰是影响 准确测定的重要因素.
影响免疫比浊测定的因素
1、抗原抗体比例 2、抗体的质量
免疫比浊法检测免疫球蛋白
免疫学系
实验原理
免疫浊度法是可溶性抗原、抗体在液相中 特异结合,产生一定大小的复合物,形成光的 折射或吸收,测定这种折射或吸收后的透射 光或散射光作为计算单位.
免疫实验,对流免疫电泳 ,免疫比浊溶血实验
免疫实验,对流免疫电泳 ,免疫比浊溶血实验
免疫实验是生命科学中非常重要的一种实验技术，它通常用于检测血清中抗体或其它免疫反应分子的含量、识别特定的分子结构，以及鉴定抗原和抗体的交互作用等。其中涉及到的技术手段也非常繁多，下面我将着重介绍对流免疫电泳和免疫比浊溶血实验这两种技术。
对流免疫电泳是一种利用电泳和抗体-抗原交互作用原理的分析技术。它可以快速地分离和检测出血清中的不同类型免疫球蛋白。具体操作步骤如下：
首先，将需要检测的血清标本加入一种被分离物抗体浸渍的石蜡条或高分子凝胶中，拍平并等待凝胶凝固。然后，加上一种被检测的抗原标记物，通常使用放射性同位素、酶或荧光染料作为标记。当抗体与抗原结合时，这些标记物也随之紧密结合在其上，形成复合物。随着复合物的形成，它们在凝胶中开始移动，直到其达到与该复合物大小同等的电荷质量比。然后，加上电场，复合物将沿电场布局在凝胶中，从而形成一条与电场方向大致平行的对流带。在对应位置破裂凝胶，分析不同样品的对流带，可以快速、准确地确定其免疫球蛋白的种类和含量。
免疫比浊溶血实验是一种利用血清中抗体与相应抗原间的特异性结合作用引起溶血反应析出现象，以检测抗体的含量和活性的实验方法。在此实验中，我们需要将血清和口香糖酐混合，使其等比例溶解，然后加入一定浓度的相应抗原（通常为红细胞抗原）。随着抗体与抗原结合，它们最终会形成网状复合物，从而导致红细胞溶解，此过程可观察到裂解和溶解反应的现象。
通常情况下，使用抗人丙型溶血球素（血型试剂）作为抗原，将其加到不同的稀释血清中，通过测量反应光密度，可以得到抗体与抗原之间的复合和溶解反应程度。免疫比浊溶血实验的优点是检测速度快，灵敏度高，适用范围广泛。
免疫比浊检验技术原理与进展
肿瘤标志物检测ຫໍສະໝຸດ Baidu的应用
01
肝癌
通过检测甲胎蛋白（AFP）等肿 瘤标志物，可辅助诊断肝癌及判 断其预后。
卵巢癌
02
03
前列腺癌
免疫比浊法可检测癌抗原125 （CA125），用于卵巢癌的诊断 和病情监测。
通过检测前列腺特异性抗原 （PSA），有助于前列腺癌的早 期发现和诊断。
05 免疫比浊法研究进展及挑 战
自身免疫性疾病诊断中的应用
类风湿性关节炎
免疫比浊法可检测类风湿因子（RF）和抗环 瓜氨酸肽抗体（CCP），用于类风湿性关节炎 的诊断和病情监测。
系统性红斑狼疮
通过检测抗核抗体（ANA）、抗双链DNA抗体 （dsDNA）等自身抗体，有助于系统性红斑狼疮的诊 断和分型。
强直性脊柱炎
免疫比浊法可检测人类白细胞抗原B27 （HLA-B27），为强直性脊柱炎的诊断提供 重要依据。
发展历程
该技术自20世纪70年代开始发展，随 着单克隆抗体技术的出现和自动化分 析仪器的普及，免疫比浊检验技术得 到了广泛应用和不断完善。
原理及特点
原理
免疫比浊检验技术利用抗原抗体在液相中特异性结合，形成一定大小的免疫复 合物，使反应液出现浊度。在一定条件下，浊度与抗原或抗体的浓度呈正比， 通过测量浊度可以推算出待测物质的浓度。
06 总结与展望
本次课程重点内容回顾
免疫沉淀类试验——双扩、免疫比浊1解析
2. 抗体种类
实验证明兔抗血清优于马、羊抗血清，兔 抗血清可测抗原0.1~1IU/ml，马抗血清为 1~10IU/ml，羊为0.4~4IU/ml，为提高实验 敏感度，应首选敏感度高的抗血清。
3. 抗体稀释度 抗体浓度大，沉淀环小，则敏感度低；
抗体浓度小，沉淀环增大，不同浓度抗原 间的差别较显著，敏感度高。但沉淀环过 大，常造成边缘糊不清，致使测量误差也 增大。因此要求在沉淀环清晰的基础上加 大稀释度以提高敏感度。下图为抗体分别 以1:25、1:50、1:75、1:100稀释，所 形成的4条标准曲线。
(三) 方法评价
单向琼脂扩散试验是一种稳定、简 便、毋需特殊设备，一般实验室均 可使用的常规方法，试验的重复性 和线性均好。敏感度为1.25mg/L
(四) 影响因素
1. 抗原分子量
抗原分子量大，扩散慢，沉淀环较小；抗 原分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求 待检血清和抗原标准品在血清学上具有均一性， 否则可能出现结果偏高或偏低。
3. 加样 在相对孔内加抗原或抗体。
4. 孵育 使抗原抗体自由扩散，在两孔之间抗 原抗体相遇，在比例适时形成可见的沉淀线。 沉淀线的数目、形态和位置与抗原和抗体的 纯度、浓度和扩散速度有关。
(三) 双向免疫扩散试验的应用
1. 检测未知抗原或抗体及其相对含量 将已知的抗体或抗原与待检标本加入成对孔中， 见图 :
实验证明兔抗血清优于马、羊抗血清，兔 抗血清可测抗原0.1~1IU/ml，马抗血清为 1~10IU/ml，羊为0.4~4IU/ml，为提高实验 敏感度，应首选敏感度高的抗血清。
3. 抗体稀释度 抗体浓度大，沉淀环小，则敏感度低；
抗体浓度小，沉淀环增大，不同浓度抗原 间的差别较显著，敏感度高。但沉淀环过 大，常造成边缘糊不清，致使测量误差也 增大。因此要求在沉淀环清晰的基础上加 大稀释度以提高敏感度。下图为抗体分别 以1:25、1:50、1:75、1:100稀释，所 形成的4条标准曲线。
(三) 方法评价
单向琼脂扩散试验是一种稳定、简 便、毋需特殊设备，一般实验室均 可使用的常规方法，试验的重复性 和线性均好。敏感度为1.25mg/L
(四) 影响因素
1. 抗原分子量
抗原分子量大，扩散慢，沉淀环较小；抗 原分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求 待检血清和抗原标准品在血清学上具有均一性， 否则可能出现结果偏高或偏低。
3. 加样 在相对孔内加抗原或抗体。
4. 孵育 使抗原抗体自由扩散，在两孔之间抗 原抗体相遇，在比例适时形成可见的沉淀线。 沉淀线的数目、形态和位置与抗原和抗体的 纯度、浓度和扩散速度有关。
(三) 双向免疫扩散试验的应用
1. 检测未知抗原或抗体及其相对含量 将已知的抗体或抗原与待检标本加入成对孔中， 见图 :
免疫比浊法(共10张PPT)
实验原理
免疫比浊法的特点：
缺点
少量小抗原抗体复合物极难形成浊度，除非放置较长时间 。 在多种自身免疫病、肝脏疾病患者中可有IgG、IgA、IgM升高：在系统性红斑狼疮患者中以IgG、IgA或IgG 、IgM升高较多见； 聚乙二醇即PEG是中性、无毒且具有独特理化性质和良好的生物相溶性的高分子聚合物，聚乙二醇具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动
正相关。当抗体浓度固定时，样品的浊度与其中所含抗原量成正比。
实验原理
聚乙二醇即PEG是中性、无毒且具有独特理化性质和良好的生物 相溶性的高分子聚合物，聚乙二醇具有高度的亲水性，在水溶液中有 较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。
在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂，如3-4％的
聚乙二醇等，利用其破坏抗原抗体的水化层，促进其靠近反应，但如 浓度不适合，高了会影响其它溶质或产生非特异性聚集影响结果。
聚乙二醇即PEG是中应性维、持无毒反且应具管有独中特的理抗化体性质蛋和白良量好的始生终物过相溶剩性，的此高值分子要聚预合先物，测聚定乙。二醇具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动
力学体积，并且没有免疫原性。 在沉淀反应中形成的复合物微粒具有特殊的光学性质， 聚乙二醇即PEG是中性、无毒且具有独特理化性质和良好的生物相溶性的高分子聚合物，聚乙二醇具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动
免疫比浊法。 其中很重要得一类就是 如要形成较大的的复合物，抗原抗体量应较大。
免疫比浊分析
(三)方法评价
散射比浊法是目前临床应用较多的一种方法，本 法自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精密
等优点。采用抗原过量检测方法，保证了结果的
准确性。但仪器和试剂价格比较贵, 对抗体的质 量要求很高。
三、免疫胶乳比浊法
（一）原理：
用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗
粒（一般为0.2 μm），在遇到相应抗原时，胶乳
二、免疫散射比浊法
(一) 原理 粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到 光线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而形成 散射光。 悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒的 大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等因 素密切相关。
不同大小的微粒形成的散射光分布不同。
当微粒直径小于入射光的波长的十分之一时，
（三）技术要求
• 待测的抗原抗体复合物分子量足够大。
• 抗原抗体复合物数量足够多。 • 具有充分的反应时间，只能测定抗原抗 体反应的第二阶段。 • 高亲和力的抗体，并保证抗体过量。
（四）方法评价
优点: 灵敏度高，稳定性好，操作简便，结果准确 不足: ①抗体用量较大； ②溶液中存在的抗原－抗体复合物分子应足够大 ③透射比浊测定在抗原－抗体反应的第二阶段，检 测需在抗原抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。
免疫比浊分析是将液相内的沉淀反应
与现代光学仪器和自动分析技术相结合的 一项分析技术。
免疫比浊检验技术原理与进展
平光线
射 散
透射光
光源 透镜 滤光片
检测器
比浊测定法原理示意图
光波
λ
当复合物大于入射光波的1/20时，形成不对称前向散射， 在90o以前的角度测量散射光皆取得最佳效果，散射光 的量代表复合物的量
d
当复合物小于入射波长时呈全透射， 透射与散射相当
三、免疫比浊技术原理
免疫比浊技术分类：
按光路 透射免疫比浊 散射免疫比浊 终点比浊 速率比浊 无增敏 PEG增敏 胶乳增敏
1、抗原与抗体
根据轻链C区抗原性不同，免疫球蛋白可分 为 2型 ) κ(kappa)型 λ(lambda)型 轻链存在于各类免疫球蛋白中 同一个免疫球蛋白分子中的轻链同型
1、抗原与抗体
抗体的生物学功能——特异性结合抗原 超变区－表位 结合基础 静电力、氢键、范德华力 可逆 影响因素：PH、温度、电解质
1、抗原与抗体
1、抗原与抗体
免疫原性 免疫原性（immunogenecity）是指 抗原分子能够刺激机体产生免疫应答（产生特 异性抗体及免疫效应细胞）的性质。
T 致敏T细胞
Ag
B 活化浆细胞
免疫原性示意图
抗体
1、抗原与抗体
免疫反应性：是指抗原分子与免疫应答产物 （抗体或免疫效应细胞）发生特异性结合的性 质。
峰值信号与抗原抗体反应之间的关系图 散 射 光 峰 值
免疫比浊法ppt
-
实验原理
血浆蛋白分析技术经历了： 试管沉淀反应、琼脂凝胶的扩散实验发展到现代免疫 分析技术，其中很重要得一类就是免疫比浊法。
-
实验原理
抗体（Ab）与可溶性抗原（Ag）反应，形成一定结构的免疫 复合物，在PEG作用下，成为悬浮于反应溶液中的微粒，使样品浊 度发生变化。在沉淀反应中形成的复合物微粒具有特殊的光学性质， 当一定波长光线通过浊度发生变化的反应混合物时，由于被不溶性 免疫复合物吸收而减弱，故在一定范围内吸光度与免疫复合物量呈 正相关。当抗体浓度固定时，样品的浊度与其中所含抗原量成正比。
1.免疫球蛋白A,M,G（IgA, IgM, IgG）测定试剂 2.免疫球蛋白A,M,G （IgA, IgM, IgG）校准品，蒸馏水， 血清样本 3.微量加样枪、试管 4.分光光度仪、水浴箱
- 实验方法
空白管
+蒸馏水 （10mL）
校准管 +IgX试剂 37℃ （1mL） 5min
+校准品 （10mL）
混匀
37℃,10min OD340
样本管
+样品血清 （10mL）
结果计算方法：
-
实验结果
Байду номын сангаас
样本管吸光度
Ig浓度（g/L）=
× Ig校准浓度（g/L）
校准管吸光度
IgA：1.72 g/L IgG：9.77 g/L IgM：1.37g/L
临床免疫学：第七章 免疫比浊技术
第七章 免疫比浊技术
第一节 免疫比浊的类型
免疫比浊技术 （immunoturbidimetric assay, IA）
将液相中沉淀反应与现代光学仪器和自动化分析 技术相结合的一项免疫分析技术。
当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合 适时，在一定的缓冲液中它们快速形成一定大小 的抗原抗体复合物，使反应液出现浊度，利用现 代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含 量。
• 入射光被吸收的量与抗原抗体复合物形成的量呈 正相关。
• 测量通过反应体系后的透射光强度，或者测定反 应体系的吸光度，即可推导出溶液中待测物质的 浓度。
分光光度计/ 光电比色计
浊度仪
透射免疫比浊法
• 基本流程与方法
定标（calibration）
1、将已知浓度的抗原标准品作适当稀释； 2、将不同浓度的标准抗原溶液与适当过量的抗血清混合，在一定的反应条 件下，待抗原抗体反应完成后，在一定波长下检测各标准管的吸光度； 3、按一定方法进行曲线拟合，以标准抗原浓度及所测得吸光度值确定剂量 -反应曲线；
2. 近红外光源 (NIPIA)
3.光栅
• 第二光径(2→4 →6), 速率 1.激光光源 透射法, 近红外光源, 波长
940nm, 180度检测角, 主要
测定大分子。
4.反应杯
3.光栅
6. 透射 探测器
5.散射探测器
第一节 免疫比浊的类型
免疫比浊技术 （immunoturbidimetric assay, IA）
将液相中沉淀反应与现代光学仪器和自动化分析 技术相结合的一项免疫分析技术。
当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合 适时，在一定的缓冲液中它们快速形成一定大小 的抗原抗体复合物，使反应液出现浊度，利用现 代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含 量。
• 入射光被吸收的量与抗原抗体复合物形成的量呈 正相关。
• 测量通过反应体系后的透射光强度，或者测定反 应体系的吸光度，即可推导出溶液中待测物质的 浓度。
分光光度计/ 光电比色计
浊度仪
透射免疫比浊法
• 基本流程与方法
定标（calibration）
1、将已知浓度的抗原标准品作适当稀释； 2、将不同浓度的标准抗原溶液与适当过量的抗血清混合，在一定的反应条 件下，待抗原抗体反应完成后，在一定波长下检测各标准管的吸光度； 3、按一定方法进行曲线拟合，以标准抗原浓度及所测得吸光度值确定剂量 -反应曲线；
2. 近红外光源 (NIPIA)
3.光栅
• 第二光径(2→4 →6), 速率 1.激光光源 透射法, 近红外光源, 波长
940nm, 180度检测角, 主要
测定大分子。
4.反应杯
3.光栅
6. 透射 探测器
5.散射探测器
免疫比浊法检测免疫球蛋白
免疫球蛋白与疾病关系
第一季度
第二季度
第三季度
第四季度
免疫缺陷病
由于先天性或后天性原 因导致的免疫球蛋白缺 乏或功能障碍，可引起 免疫缺陷病，如X-连 锁无丙种球蛋白血症、 选择性IgA缺乏症等。
自身免疫病
当机体免疫系统异常时 ，可能会产生针对自身 抗原的免疫球蛋白，导 致自身免疫病的发生， 如系统性红斑狼疮、类
在免疫学、生物医学等领域的研究 中，免疫比浊法可用于研究抗原抗 体反应、免疫复合物形成等过程。
02
免疫球蛋白简介
免疫球蛋白分类
IgG
IgM
IgA
IgE
IgD
是血清中主要的免疫球 蛋白，占总免疫球蛋白 的70-80%。它广泛分布 于体液中，具有抗菌、 抗病毒和中和毒素的作 用。
是分子量最大的免疫球 蛋白，主要存在于血液 中。它是机体早期抗感 染免疫的主要抗体，具 有强大的凝集抗原和激 活补体的能力。
慢性感染
如慢性肝炎、结核病等，长期感 染刺激机体免疫系统，使得免疫 球蛋白合成增加。
肿瘤
某些恶性肿瘤如淋巴瘤、多发性 骨髓瘤等，肿瘤细胞异常增殖并 分泌免疫球蛋白，导致血液中免 疫球蛋白水平升高。
案例二：某患者免疫球蛋白异常降低原因分析
先天性免疫缺陷
如先天性低丙种球蛋白血症等，由于基因缺陷导致免疫球蛋白合 成不足。
免疫比浊法
3
整理版ppt
实验原理
血浆蛋白分析技术经历了：
试管沉淀反应、琼脂凝胶的扩散实验发展到现代免疫 分析技术，其中很重要得一类就是免疫比浊法。
4
整理版ppt
实验原理
抗体（Ab）与可溶性抗原（Ag）反应，形成一定结构的免疫 复合物，在PEG作用下，成为悬浮于反应溶液中的微粒，使样品浊 度发生变化。在沉淀反应中形成的复合物微粒具有特殊的光学性质， 当一定波长光线通过浊度发生变化的反应混合物时，由于被不溶性 免疫复合物吸收而减弱，故在一定范围内吸光度与免疫复合物量呈 正相关。当抗体浓度固定时，样品的浊度与其中所含抗原量成正比。
5
整理版pLeabharlann Baidut
实验原理
聚乙二醇即PEG是中性、无毒且具有独特理化性质和良 好的生物相溶性的高分子聚合物，聚乙二醇具有高度的亲水 性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。
在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂，如34％的聚乙二醇等，利用其破坏抗原抗体的水化层，促进其靠 近反应，但如浓度不适合，高了会影响其它溶质或产生非特 异性聚集影响结果。
7
整理版ppt
实验原理
免疫比浊法的特点：
缺点
当抗体或抗原大量过剩时，出现可溶性的复合物，造成误差。
应维持反应管中的抗体蛋白量始终过剩，此值要预先测定。
受血脂浓度影响。脂蛋白的小颗粒可形成浊度，造成假性升高。
整理版ppt
实验原理
血浆蛋白分析技术经历了：
试管沉淀反应、琼脂凝胶的扩散实验发展到现代免疫 分析技术，其中很重要得一类就是免疫比浊法。
4
整理版ppt
实验原理
抗体（Ab）与可溶性抗原（Ag）反应，形成一定结构的免疫 复合物，在PEG作用下，成为悬浮于反应溶液中的微粒，使样品浊 度发生变化。在沉淀反应中形成的复合物微粒具有特殊的光学性质， 当一定波长光线通过浊度发生变化的反应混合物时，由于被不溶性 免疫复合物吸收而减弱，故在一定范围内吸光度与免疫复合物量呈 正相关。当抗体浓度固定时，样品的浊度与其中所含抗原量成正比。
5
整理版pLeabharlann Baidut
实验原理
聚乙二醇即PEG是中性、无毒且具有独特理化性质和良 好的生物相溶性的高分子聚合物，聚乙二醇具有高度的亲水 性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。
在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂，如34％的聚乙二醇等，利用其破坏抗原抗体的水化层，促进其靠 近反应，但如浓度不适合，高了会影响其它溶质或产生非特 异性聚集影响结果。
7
整理版ppt
实验原理
免疫比浊法的特点：
缺点
当抗体或抗原大量过剩时，出现可溶性的复合物，造成误差。
应维持反应管中的抗体蛋白量始终过剩，此值要预先测定。
受血脂浓度影响。脂蛋白的小颗粒可形成浊度，造成假性升高。
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交叉反应（cross-reaction）指抗体或致敏淋巴细胞对具有相同或相似 表位的不同抗原均具有的反应（交叉结合）。
2021/2/21
12
1、抗原与抗体
抗体（antibody, Ab）功能性概念 是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗原发生
特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。抗体主要存在 血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、小肠粘膜液、唾液 以及乳汁等其它体液中。 免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）结构性概念
具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。 抗体一定是球蛋白，球蛋白未必是抗体
2021/2/21
13
1、抗原与抗体
抗体的分子结构
2021/2/21
14
1、抗原与抗体
“Y”型，四肽链 重链 （5种: 、 、、、
） 轻链 （2种: 、） 可变区 （V区）
超变区（ 又称CDR 互补 决定区）
骨架区: FR 恒定区 （C区） 铰链区
1、抗原与抗体
根据轻链C区抗原性不同，免疫球蛋白可分 为2型) κ(kappa)型 λ(lambda)型
轻链存在于各类免疫球蛋白中 同一个免疫球蛋白分子中的轻链同型
2021/2/21
19
1、抗原与抗体
抗体的生物学功能——特异性结合抗原
结合基础
超变区－表位 静电力、氢键、范德华力
可逆
影响因素：PH、温度、电解质
2、抗原抗体的结合——免疫学反应
抗原抗体反应的特点
特异性 按比例 可逆性
2021/2/21
23
2、抗原抗体的结合——免疫学反应
2021/2/21
Antigen added →
24
2、抗原抗体的结合——免疫学反应
影响抗原抗体反应的因素
电解质（离子强度）：抗原与抗体发生特异性结合后，虽由亲水胶体变为 疏水胶体，若溶液中无电解质参加，仍不出现可见反应。为了促使沉淀物 或凝集物的形成，常用0.85％氯化钠或各种缓冲液作为抗原及抗体的稀释 液。由于氯化钠在水溶液中解离成Na+和C1－，可分别中和胶体粒子上的 电荷，使胶体粒子的电势下降。当电势降至临界电势（12～15mV）以下 时，则能促使抗原抗体复合物从溶液中析出，形成可见的沉淀物或凝集物。
抗原结合价：抗原结合价（antigenic valence）是指能够 与抗体分子结合的决定簇数目。
2021/2/21
9
1、抗原与抗体
2021/2/21
10
1、抗原与抗体
抗原表位的性质、数目、位置、空间排列和立体构象决 定着抗原-抗体反应的高度特异性。
2021/2/21
11
1、抗原与抗体
共同表位（common epitope）指不同抗原之间含有的相同或相似的抗 原表位。
抗原抗体的结合使电荷减少或消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水 胶体。
四种分子间引力（电荷引力、范登华引力 、氢键结合力 和疏水作 用 ）参与并促进抗原抗体间的特异性结合。
2021/2/21
wk.baidu.com21
2、抗原抗体的结合——免疫学反应 典型的抗原抗体结合反应
2021/2/21
特异性识别
形成抗原抗体复合物
22
半抗原（hapten，又称不完全抗原 incomplete antigen ） 无免疫原性，只有抗原性的物质。
载体（carrier）赋予半抗原以免疫原性的蛋白质。
半抗原 + 蛋白质（载体） ＝ 完全抗原。
2021/2/21
7
半抗原
载体
+
完全抗原
BB B
B
Th Th
抗体
半抗原—载体效应示意图
2021/2/21
2021/2/21
20
2、抗原抗体的结合——免疫学反应
抗原抗体反应的原理
抗原与抗体能够特异性结合是基于两种分子间的结构互补性与亲和 性，这两种特性是由抗原与抗体分子的一级结构决定的。
抗原抗体反应可分为两个阶段。第一为抗原与抗体发生特异性结合 的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应。 第二为可见反应阶段，抗原抗体复合物在环境因素（如电解质、 pH、温度、补体）的影响下，进一步交联和聚集，表现为凝集、 沉淀、溶解、补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应。
2021/2/21
15
2021/2/21
16
1、抗原与抗体
根据重链抗原性的不同，免疫球蛋白可以 分为5类： IgG —γ(gamma) IgA — α(alpha) IgM — μ(mu) IgD — δ(delta) IgE — ε(epsilon)
2021/2/21
17
2021/2/21
18
免疫比浊检验技术原理与进展
一、免疫学基本原理 二、免疫沉淀 三、免疫比浊技术原理
2021/2/21
1
一、免疫学基本原理
1、抗原与抗体 2、抗原抗体的结合——免疫学反应 3、免疫学反应的检测技术
2021/2/21
2
1、抗原与抗体
抗原（Antigen, Ag）是刺激机体产生免疫应 答的物质。
“应” 是指抗原刺激机体产生免疫应答产物-抗体或免疫效应细胞
酸碱度（pH）：抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行。蛋白质具有 两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点。抗原抗体反应一般在 pH为6～8进行。PH过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质，例如pH 达到或接近抗原的等电点时，即使无相应抗体存在，也会引起颗粒性抗原 非特异性的凝集，造成假阳性反应。
“答” 是指相应抗原与免疫应答产物结合并 将其排除体外）
抗原的免疫原性和免疫反应性 完全抗原与半抗原 抗原表位与抗原结合价位
2021/2/21
3
1、抗原与抗体
2021/2/21
4
1、抗原与抗体
免疫原性 免疫原性（immunogenecity）是指 抗原分子能够刺激机体产生免疫应答（产生特 异性抗体及免疫效应细胞）的性质。
T
致敏T细胞
Ag
2021/2/21
活化浆细胞 B
免疫原性示意图
抗体
5
1、抗原与抗体
免疫反应性：是指抗原分子与免疫应答产物 （抗体或免疫效应细胞）发生特异性结合的性 质。
Ag
2021/2/21
T
致敏T细胞
浆细胞 B
抗原性（免疫反应性）示意图
抗体
6
1、抗原与抗体
完全抗原（complete antigen) 具有免疫原性和抗原 性的物质。
半抗原 + 蛋白质（载体） ＝ 完全抗原
8
1、抗原与抗体
抗原决定簇：抗原分子存在的能TCR/BCR或抗体Fab片 段特异性结合的特殊化学基团，是免疫应答特异性的 物质基础。
构象决定簇 ：构象决定簇（conformational determinant） 由空间构象形成的决定簇，序列上不连续。
顺序决定簇：顺序决定簇（sequence determinant），又 称线性决定簇（linear determinant），序列相连续的 氨基酸肽片段构成的决定簇。
2021/2/21
12
1、抗原与抗体
抗体（antibody, Ab）功能性概念 是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗原发生
特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。抗体主要存在 血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、小肠粘膜液、唾液 以及乳汁等其它体液中。 免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）结构性概念
具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。 抗体一定是球蛋白，球蛋白未必是抗体
2021/2/21
13
1、抗原与抗体
抗体的分子结构
2021/2/21
14
1、抗原与抗体
“Y”型，四肽链 重链 （5种: 、 、、、
） 轻链 （2种: 、） 可变区 （V区）
超变区（ 又称CDR 互补 决定区）
骨架区: FR 恒定区 （C区） 铰链区
1、抗原与抗体
根据轻链C区抗原性不同，免疫球蛋白可分 为2型) κ(kappa)型 λ(lambda)型
轻链存在于各类免疫球蛋白中 同一个免疫球蛋白分子中的轻链同型
2021/2/21
19
1、抗原与抗体
抗体的生物学功能——特异性结合抗原
结合基础
超变区－表位 静电力、氢键、范德华力
可逆
影响因素：PH、温度、电解质
2、抗原抗体的结合——免疫学反应
抗原抗体反应的特点
特异性 按比例 可逆性
2021/2/21
23
2、抗原抗体的结合——免疫学反应
2021/2/21
Antigen added →
24
2、抗原抗体的结合——免疫学反应
影响抗原抗体反应的因素
电解质（离子强度）：抗原与抗体发生特异性结合后，虽由亲水胶体变为 疏水胶体，若溶液中无电解质参加，仍不出现可见反应。为了促使沉淀物 或凝集物的形成，常用0.85％氯化钠或各种缓冲液作为抗原及抗体的稀释 液。由于氯化钠在水溶液中解离成Na+和C1－，可分别中和胶体粒子上的 电荷，使胶体粒子的电势下降。当电势降至临界电势（12～15mV）以下 时，则能促使抗原抗体复合物从溶液中析出，形成可见的沉淀物或凝集物。
抗原结合价：抗原结合价（antigenic valence）是指能够 与抗体分子结合的决定簇数目。
2021/2/21
9
1、抗原与抗体
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抗原表位的性质、数目、位置、空间排列和立体构象决 定着抗原-抗体反应的高度特异性。
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11
1、抗原与抗体
共同表位（common epitope）指不同抗原之间含有的相同或相似的抗 原表位。
抗原抗体的结合使电荷减少或消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水 胶体。
四种分子间引力（电荷引力、范登华引力 、氢键结合力 和疏水作 用 ）参与并促进抗原抗体间的特异性结合。
2021/2/21
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2、抗原抗体的结合——免疫学反应 典型的抗原抗体结合反应
2021/2/21
特异性识别
形成抗原抗体复合物
22
半抗原（hapten，又称不完全抗原 incomplete antigen ） 无免疫原性，只有抗原性的物质。
载体（carrier）赋予半抗原以免疫原性的蛋白质。
半抗原 + 蛋白质（载体） ＝ 完全抗原。
2021/2/21
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半抗原
载体
+
完全抗原
BB B
B
Th Th
抗体
半抗原—载体效应示意图
2021/2/21
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2、抗原抗体的结合——免疫学反应
抗原抗体反应的原理
抗原与抗体能够特异性结合是基于两种分子间的结构互补性与亲和 性，这两种特性是由抗原与抗体分子的一级结构决定的。
抗原抗体反应可分为两个阶段。第一为抗原与抗体发生特异性结合 的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应。 第二为可见反应阶段，抗原抗体复合物在环境因素（如电解质、 pH、温度、补体）的影响下，进一步交联和聚集，表现为凝集、 沉淀、溶解、补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应。
2021/2/21
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16
1、抗原与抗体
根据重链抗原性的不同，免疫球蛋白可以 分为5类： IgG —γ(gamma) IgA — α(alpha) IgM — μ(mu) IgD — δ(delta) IgE — ε(epsilon)
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18
免疫比浊检验技术原理与进展
一、免疫学基本原理 二、免疫沉淀 三、免疫比浊技术原理
2021/2/21
1
一、免疫学基本原理
1、抗原与抗体 2、抗原抗体的结合——免疫学反应 3、免疫学反应的检测技术
2021/2/21
2
1、抗原与抗体
抗原（Antigen, Ag）是刺激机体产生免疫应 答的物质。
“应” 是指抗原刺激机体产生免疫应答产物-抗体或免疫效应细胞
酸碱度（pH）：抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行。蛋白质具有 两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点。抗原抗体反应一般在 pH为6～8进行。PH过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质，例如pH 达到或接近抗原的等电点时，即使无相应抗体存在，也会引起颗粒性抗原 非特异性的凝集，造成假阳性反应。
“答” 是指相应抗原与免疫应答产物结合并 将其排除体外）
抗原的免疫原性和免疫反应性 完全抗原与半抗原 抗原表位与抗原结合价位
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1、抗原与抗体
2021/2/21
4
1、抗原与抗体
免疫原性 免疫原性（immunogenecity）是指 抗原分子能够刺激机体产生免疫应答（产生特 异性抗体及免疫效应细胞）的性质。
T
致敏T细胞
Ag
2021/2/21
活化浆细胞 B
免疫原性示意图
抗体
5
1、抗原与抗体
免疫反应性：是指抗原分子与免疫应答产物 （抗体或免疫效应细胞）发生特异性结合的性 质。
Ag
2021/2/21
T
致敏T细胞
浆细胞 B
抗原性（免疫反应性）示意图
抗体
6
1、抗原与抗体
完全抗原（complete antigen) 具有免疫原性和抗原 性的物质。
半抗原 + 蛋白质（载体） ＝ 完全抗原
8
1、抗原与抗体
抗原决定簇：抗原分子存在的能TCR/BCR或抗体Fab片 段特异性结合的特殊化学基团，是免疫应答特异性的 物质基础。
构象决定簇 ：构象决定簇（conformational determinant） 由空间构象形成的决定簇，序列上不连续。
顺序决定簇：顺序决定簇（sequence determinant），又 称线性决定簇（linear determinant），序列相连续的 氨基酸肽片段构成的决定簇。