酶联免疫反应.ppt
免疫学实验二 ELISA(双抗夹心法)1
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注意事项：
1. 试剂及待测标本使用前应平衡至室温，并将试剂混匀， 弃去1～2滴垂直滴加；
2. 严格按照操作程序依次加样，以保证实验结果准确性； 3. 应尽量避免孔中有气泡，以免所测得OD值不准确。
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思考题：
1.免疫标记技术有哪些？各有何特点？。 2.ELISA操作过程中应注意哪些问题？
7. 终止反应：各孔加终止液50μl （2mol/L H2SO4 ）。 8. 比色：将反应板以酶标仪450nm处用空白孔调零，测各孔
OD值。
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6.显色
各孔（包括空白对照）加底物 A液50μl（1滴），底物B液 50μl（1滴），置37℃避光温 育15min
7.终止反应
各孔加终止液50μl （2mol/L H2SO4 ）
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OPD（邻苯二胺）经酶 作用后的显色反应
终
终
止
止
前
前
终
终
止
止
后
TMB四甲基联苯胺经酶作后
用后的显色反应
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结果判断：
计算：判断值＝阴性对照平均OD值×2.1 结果判断：待测样品孔OD值大于或等于判断值为阳性；
小于判断值为阴性。 注：阴性对照OD值小于0.05按0.05计算，
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2009级医疗专科复习题
一、名词解释2.5*8,共20分
免疫、抗原、抗原决定基(表位)、异嗜性抗原、白细胞分
化抗原、TD-Ag、 TI-Ag、抗体、免疫球蛋白、单（多）克 隆抗体、补体、经典途径、旁路途径、细胞因子、IL、IFN、 CSF、TNF、MHC、MHC限制性、TCR、BCR、模式识别 受体（PRR）、抗原提呈细胞（ APC）、适应性免疫应答、 免疫耐受、免疫调节、超敏反应、人工主动免疫、人工被动 免疫、计划免疫
酶联免疫吸附试验ELISA.ppt
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
4. 原理（以间接ELISA为例）：
显色
间接法测定猪瘟抗体 ——定性检测
间接法测定猪瘟抗体 ——定性检测
实验材料
猪瘟病毒（CSFV） —— 抗原 样品 —— 待测猪血清 HRP标记猪抗兔IgG —— 二抗 包被缓冲液：0.025M pH9.6碳酸盐缓冲液 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS 底物缓冲液： pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液 底物溶液：TMB ，底物缓冲液，30% H2O2 酶标板，酶标仪
• 分类：
酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)
1.定义
用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液） 中未知抗体或抗原的方法。
2.原理
（1）利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连
（3）双抗体夹心法测定抗原
A. 将抗体吸附于固相表面; B. 加待检抗原，形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体;
E. 加底物。底物的降解量＝抗原量。
（4）竞争法测定抗原
A. 将抗体吸附在固相载体表面; B. 加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。
2、洗板：甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，200μl/孔，每次在干净吸水纸上 拍干。
3、每孔加酶标二抗（抗猪IgG-HRP结合物）100μl，置37℃温育30分钟。 4、洗板：洗涤3次（方法同步骤2）。 5、显色与终止：每孔加底物A液、B液各1滴(50μl)，混匀。室温避光显色，10分钟
酶联免疫反应的原理和步骤
酶联免疫反应的原理和步骤一、酶联免疫反应的原理酶联免疫反应是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析抗原或抗体的存在和浓度。
其原理基于抗原与抗体之间的特异性结合反应，通过将酶标记的二抗与特异性抗体结合形成免疫复合物，再利用酶的催化作用产生可定量检测的产物，从而实现对抗原或抗体的检测和定量。
酶联免疫反应的原理可以简单概括为以下几个步骤：1. 免疫吸附：将待测物（抗原或抗体）吸附在固相载体（如酶标板、磁珠等）上，使其与固相载体结合。
2. 阻断：为了防止非特异性结合，需要在免疫吸附之前或之后对固相载体进行阻断处理，通常使用牛血清蛋白（BSA）或牛血清白蛋白（BSA）来阻断非特异性结合位点。
3. 特异性结合：加入特异性抗体与待测物进行结合反应，形成抗原-抗体复合物。
4. 二抗结合：加入酶标记的二抗，该二抗与特异性抗体结合，形成二抗-抗原-抗体复合物。
5. 底物反应：加入底物，该底物受酶的催化作用产生可定量测量的产物。
常用的底物有TMB（三甲基苯胺）、ABTS（2,2'-联氨基丙烷磺酸）等。
6. 反应终止：加入适当的反应终止液，停止底物反应过程。
7. 测量：通过光度计或荧光计测量产物的光吸收或荧光强度，以反映抗原或抗体的浓度。
二、酶联免疫反应的步骤酶联免疫反应通常包括以下几个步骤：1. 表面处理：将固相载体（如酶标板）表面进行处理，以增强待测物的吸附能力和特异性结合。
常用的方法有物理吸附、化学共价结合、亲和结合等。
2. 阻断处理：为了防止非特异性结合，需要对固相载体进行阻断处理，通常使用牛血清蛋白（BSA）或牛血清白蛋白（BSA）来阻断非特异性结合位点。
3. 特异性结合：加入待测物（抗原或抗体），与固相载体上的特异性抗体进行结合反应，形成抗原-抗体复合物。
4. 二抗结合：加入酶标记的二抗，该二抗与特异性抗体结合，形成二抗-抗原-抗体复合物。
5. 底物反应：加入底物，该底物受酶的催化作用产生可定量测量的产物。
酶联免疫反应
均相酶免测定的对象为小分子抗原或半 抗原，主要用于药物测定。可以直接用 于全自动生化分析仪测定。
非均相酶免疫分析法（heterogeneous enzyme immunoassay） 常用的酶免疫分析 法多为非均相法，又可分为液相酶免疫法和 固相酶免疫法两种，以后者最常用，称为酶 联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。ELISA是 临床上最常用的免疫分析方法。需经过结合 的标记物和游离的标记物的分离才能测定. 分离的方法主要通过固相载体吸附后清洗未 结合的游离标记物。
环 境 因 素
通风、采光与防尘。 控制温度及湿度, 环境温度与湿度随地理位 置不同可有很大差异应使用系统空调进行控 温, 并要求控制空气湿度为40%～70%之间 消除噪音与电磁干扰。 稳定水电, 实验过程中应采用蒸馏水(纯水) 或经软化处理的自来水。
六、ELISA应用
ELISA在饲料安全检测中的应用
固相抗原或抗体
1、固相载体的性状 固相载体在ELISA 测定过程中作为吸附剂和容器，不 参与化学反应。 ELISA 载体的形状主要有：膜（NC膜、PVDF膜、尼 龙膜）、微量滴定板（96孔板）、小珠和小试管，以 微量滴定板（96孔板）最为常用。 良好的ELISA 用96孔板应该是吸附性能好，空白值低， 孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。 2、包被用抗原 用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗 原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。 3、包被条件
酶免疫组化技术
双抗体夹心法
竞争法
双抗原夹心法
间接法
双抗体夹心法
竞争法
间接法
ELISA基本实验过程 包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附 到固相载体表面，使抗原或抗体固相化 抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶 结合物，使之与固相抗原或抗体发生免 疫反应而被结合固定 酶促反应：在反应体系中加入酶作用的 底物，使发生酶促反应而显色
ELISE(酶联免疫)
简介酶联免疫实验板酶联免疫吸附剂测定法，简称酶联免疫法，或者ELISA法。
它的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。
基本原理①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。
在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。
由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有3种必要的试剂:①固相的抗原或抗体②酶标记的抗原或抗体③酶作用的底物。
根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
注意事项⒈正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。
有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
⒉在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:⑴固相载体的选择:许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。
其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。
当前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。
不管何种载体，在使用前均可进行筛选:用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
⑵包被抗体(或抗原)的选择:将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好，吸附时一般要求PH在9.0~9.6之间。
吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响，一般多采用4℃18~24小时。
酶联免疫反应的原理
酶联免疫反应的原理
酶联免疫反应（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）
是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量分析目标物（例如蛋白质、抗原或抗体）在样本中的存在和浓度。
酶联免疫反应的原理基于特定抗原与其对应的抗体的高度特异性结合。
典型的酶联免疫反应包括以下步骤：
1. 固定：首先，在固相（例如试管、酶标板等）表面上，直接或间接地固定特定抗原或抗体。
直接固定指将抗原或抗体直接吸附在固相上，而间接固定则需要先加入一种可与抗原或抗体结合的二抗。
2. 绑定：样本中的目标物与固定的抗体或抗原结合形成复合物。
如果样本中含有目标物，则目标物将与固定的抗体结合；如果样本中含有抗体，则抗体将与固定的抗原结合。
3. 洗涤：通过洗涤步骤去除未结合的物质，以减少非特异性背景信号。
4. 信号发生：添加与目标物结合的检测抗体。
检测抗体通常会与目标物不同的部位结合。
这个检测抗体可以是已标记的抗体，其标记物可以是酶（例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）等，也可以是免疫荧光、生物素/亲和素等。
5. 洗涤：再次通过洗涤步骤去除未结合的检测抗体。
6. 信号测定：将适合于检测的底物（例如染色底物、荧光底物或发光底物）添加到反应体系中，底物在酶的作用下产生可测量的信号。
酶标板读板仪等设备可测量这种信号的强度。
通过测量光学信号的强度，可以确定目标物在样本中的存在和浓度。
由于酶标记的检测抗体产生的信号可被放大，酶联免疫反应具有高灵敏度和特异性，被广泛用于医学诊断、生物学研究以及药物研发等领域。
酶联免疫法和pcr
酶联免疫法和pcr
酶联免疫法（ELISA）和聚合酶链式反应（PCR）是两种常用的
生物医学实验技术，它们在医学诊断、生物学研究和生物制药等领
域发挥着重要作用。
首先，让我们来看看酶联免疫法。
酶联免疫法是一种用于检测
特定蛋白质或其他分子的方法。
它利用抗体与待测分子结合的原理，通过酶的作用产生可测量的信号。
ELISA广泛应用于临床诊断，例
如检测HIV抗体、肿瘤标志物等。
它也被用于科研领域，用于检测
蛋白质相互作用、测定蛋白质浓度等。
接下来，让我们来了解一下聚合酶链式反应（PCR）。
PCR是一
种用于扩增DNA片段的技术。
它通过循环反应使得特定DNA区段在
体外被放大，从而能够在实验室中大量复制特定的DNA序列。
PCR
在基因组学研究、医学诊断、法医学和生物学研究中有着广泛的应用。
例如，在病毒检测中，PCR可以被用来检测病毒的DNA或RNA，
从而帮助诊断疾病。
两种技术各有其优势和局限性。
ELISA对于蛋白质的检测具有
高灵敏度和特异性，但不能用于检测DNA或RNA。
而PCR能够扩增
特定的DNA序列，但对于蛋白质的检测能力有限。
因此，在实际应用中，科研人员和临床医生通常会根据具体的研究目的或临床需求选择合适的技术。
总的来说，酶联免疫法和PCR都是生物医学领域中非常重要的实验技术，它们在医学诊断和科学研究中发挥着不可替代的作用。
希望这样的回答能够满足你的需求。
酶联免疫反应的原理和步骤
酶联免疫反应的原理和步骤酶联免疫反应是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析生物样品中的抗原或抗体。
它基于抗原与抗体之间的特异性结合，通过酶的催化作用使其产生可测量的信号。
本文将介绍酶联免疫反应的原理和步骤。
一、原理酶联免疫反应的原理基于抗原与抗体之间的特异性结合。
抗原是一种能够引起免疫系统产生抗体反应的物质，抗体则是由免疫系统产生的一种蛋白质分子。
在酶联免疫反应中，一种特定的抗体被固定在固相（如微孔板）上，待测样品中的抗原与固相上的抗体结合形成抗原-抗体复合物。
然后，另一种与抗体结合的酶标记抗体被加入，与抗原-抗体复合物结合。
最后，通过添加底物使酶催化产生可测量的信号，从而确定待测样品中的抗原或抗体的数量。
二、步骤1. 准备试剂和设备：包括微孔板、抗体、酶标记抗体、底物、洗涤缓冲液等。
确保试剂和设备的质量和保存条件符合要求。
2. 固相吸附：将特定的抗体溶液加入微孔板孔中，使其在孔壁上吸附。
然后，将孔壁上的未结合抗体洗涤掉，以减少非特异性结合。
3. 样品孔加样：将待测样品加入微孔板中，与固相上的抗体发生特异性结合。
对于检测抗体，待测样品即为抗原；对于检测抗原，待测样品即为抗体。
4. 酶标记抗体加样：将与酶标记抗体结合的抗体加入微孔板中，与抗原-抗体复合物结合。
这种酶标记抗体通常与较早加入的抗体具有不同的特异性。
5. 洗涤：将微孔板中的未结合抗体和其他杂质洗涤掉，以减少非特异性结合。
洗涤缓冲液的成分和洗涤次数应根据实验要求进行调整。
6. 底物加样：将含有底物的溶液加入微孔板中，酶催化底物产生可测量的信号。
底物的选择应根据酶的特性和实验要求进行。
7. 反应停止：通过加入反应停止剂，终止酶催化反应。
反应停止剂的选择应根据底物和酶的特性进行。
8. 信号检测：使用光谱仪、荧光仪或比色计等仪器检测底物催化产生的信号。
信号的强度与待测样品中目标物质的浓度成正比。
9. 数据分析：根据信号的强度和标准曲线，计算出待测样品中目标物质的浓度。
酶联免疫法原理
酶联免疫法原理
酶联免疫法是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析目标蛋白质或抗原的存在和浓度。
其原理是利用特定抗体与目标蛋白质或抗原之间的特异性结合，再借助酶的催化作用，将目标物与酶的反应产物相关联，通过测量反应产物的信号强度来间接测定目标物的存在和浓度。
酶联免疫法的步骤通常包括以下几个主要步骤：
1. 预涂板：将具有特异性的抗体或抗原预先涂覆在微孔板的表面上，形成抗原或抗体捕获层；
2. 孵育：将待检测样品加入微孔板中，样品中的目标物与捕获层上的抗体或抗原结合，形成特异性复合物；
3. 洗涤：通过洗涤步骤，去除未结合的样品成分，减少背景干扰；
4. 二抗结合：加入与目标物结合的抗体标记物，这种抗体与目标物不同的抗体结合，形成“夹心”结构；
5. 再次洗涤：去除未结合的二抗成分，减少背景干扰；
6. 底物添加：加入底物，底物与酶结合，酶的催化作用使底物产生可测量的信号，例如颜色变化；
7. 反应停止：通过加入反应停止剂，停止底物与酶的反应；
8. 信号检测：使用仪器测量底物的信号强度，常见的方法包括吸光度测定或荧光测定；
9. 数据分析：根据测得的信号强度，通过对照样品进行定量分析，计算目标物的浓度。
酶联免疫法通过将酶的催化作用与特异性抗体或抗原结合，能够高灵敏度地检测目标物，并且可同时处理多个样品，因此在生物医学研究和临床诊断中得到了广泛应用。
elisa检测技术 ppt课件
该方法可用于抗原、抗体以及DNA和RNA（生物素）检测。
BAS-ELISA实验原理
竞争法ELISA
竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分 为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液 和酶标记物（酶标抗原）；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检 样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形 成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗 原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色 产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗 原结合，加入底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗 原和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越 高，说明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一 定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，用分 光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从 而进一步得知样本中抗原的多少。
37℃, 30min
洗涤3次, 拍干 加底物溶液 (空孔除外) 避光 37℃, 10-30min 加终止液 (空孔除外)
上机检测、绘制标准曲线 (空孔调零)
从标准曲线上 读取样品含量
ELISA试验中的注意事项
必须设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制试验条件并检验 试剂盒的质量； 待测样品应设立双复孔或三复孔； 酶标板洗涤时确保洗涤干净，避免假阳性过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
酶联免疫分析法
第一节 酶联免疫分析概述
• 抗体是能与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。 • 所有的抗体都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋 白都是抗体。 • 例如无免疫活性的免疫球蛋白（如骨髓瘤蛋白）就不 是抗体，尽管其结构与抗体相似。 • 抗体主要存在于血清内，但在其他体液及外分泌液中 也有存在。 • 抗原抗体分子之间存在着结构互补性和亲和性，使得 抗原与相应抗体之间极易发生结合反应，这种反应具 有高特异性（即专一性）和可逆性。
第一节 酶联免疫分析概述
• “免疫（immunity）”一词源于 “immunitas”，原 意是免除税赋和差役。 • 研究早期免疫学多集中在抗体抗感染能力研究。 • 20世纪中期以后，人们逐渐开始对各种抗原、微生物 的作用进行研究，发展出基础免疫学、临床免疫学、 免疫学检测、医学免疫学等多个分支。 • 现代免疫学将“免疫”定义为：机体对“自己”和“ 异己”识别、应答过程中所产生的生物学效应的总和 ，正常情况下是维持内环境稳定的一种生理性功能。
第一节 酶联免疫分析概述
二、酶标记免疫分析法及常用标记酶 放射免疫分析法 1、免疫析法分类
化学发光免疫分析法 标记免 疫分析 免疫 分析 电化学免疫分析法 荧光免疫分析法 竞争性酶联免疫分析 酶联免疫 分析法 非竞争性酶联免疫分析 均相酶联免疫分析 非均相酶联免疫分析 非标记免疫 分析 沉淀反应、凝集反应、 免疫电泳、免疫扩散
第一节 酶联免疫分析概述
2、抗原、抗体与免疫反应 • 抗原是能够引起免疫反应的分子。 • 免疫原性（immunogenicity）指诱导刺激免疫系统产 生抗体或致敏淋巴细胞的能力。 • 具有免疫原性的物质称为免疫原（immunogen）。 • 免 疫 反 应 原 性 （ immunoreactivity ） 或 抗 原 性 （ antigenicity），指能与相应抗体或致敏淋巴细胞发 生特异性结合，引起免疫反应的性能。 • 具备上述两种特性的物质为完全抗原，仅具有免疫反 应性的物质被称为半抗原（hapten）。
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环境因素
通风、采光与防尘。 控制温度及湿度, 环境温度与湿度随地理位
置不同可有很大差异应使用系统空调进行控 温, 并要求控制空气湿度为40%～70%之间 消除噪音与电磁干扰。 稳定水电, 实验过程中应采用蒸馏水(纯水) 或经软化处理的自来水。
六、ELISA应用
ELISA在饲料安全检测中的应用
酶联免疫反应
概述
免疫分析：是以抗原抗体相互结合的免疫反应 为基础，研究免疫学技术及其在医学领域中 的应用。
免疫分析的分类 根据分析过程中是否需要标记物可分为两类 一、标记免疫分析：根据标记物的种类可分为 1、酶免疫分析 2、放射免疫分析 3、发光免疫分析 4、荧光免疫分析 5、金（银）免疫标记分析
二、非标记免疫分析： 免疫沉淀实验、免疫浊 度分析技术
一、酶免疫分析：是利用酶的高效催化和放大 作用与特异性免疫反应结合而建立的一种标 记免疫技术。
原理： 用酶标记的抗原（或抗体）用于免疫反 应，并以相应的底物被酶分解的显色反应对 样品中的抗体（或抗原）进行定位的分析和 鉴定。
根据是否需要分离结合与游离的酶标记物可 分为可分为非均相(或异相)酶免疫测定和均 相酶免疫测定两种方法 。
一、ELISA简介
•1971年瑞典学者 Engvall和Perlmann，荷兰学 者Van Weeman和Schuurs分别报道将免疫技术 发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方 法，称为酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）。 •自上世纪70年代初问世以来， ELISA发展十 分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学 的许多领域。
二、ELISA原理
•ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体 的酶标记。 •结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学 活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性， 又保留酶的活性。 •在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与 固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记 的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。 此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的 比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有 色产物，产物的量与标本中受检物质的 量直接相关，故可根据呈色的深浅进行 定性或定量分析。
分离的方法主要通过固相载体吸附后清洗未 结合的游离标记物。
ELISA既可以测定抗原，也可以测定抗体。 根据测定对象不同，可采用不同的模式，主 要有双抗夹心法、间接法和竞争法等。
一、ELISA简介 二、ELISA原理 三、ELISA分类 四、ELISA相关试剂 五、ELISA影响因素 六、ELISA应用
实验中对照的设置
阳性对照 阴性对照 空白对照 临界标准品
ELISA试剂
（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附 剂）；
（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），
参考标准品和控制血清（定量测定中）； （5）结合物及标本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液。
双抗体夹心法
竞争法
双抗原夹心法
间接法
其他标记技术
双抗体夹心法
竞争法
间接法
ELISA基本实验过程
包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附 到固相载体表面，使抗原或抗体固相化
抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶 结合物，使之与固相抗原或抗体发生免 疫反应而被结合固定
酶促反应：在反应体系中加入酶作用的 底物，使发生酶促反应而显色
颜色终止条件
ELISA实验终止剂选用引起的持续发展的颜色加深 影响了阴性和弱阳性样品及定量检测样品的结果, 特别在大批样品需较长时间进行读数时, 这种潜在 的颜色逐渐加深现象成为结果影响的重要因素。
ELISA的洗板过程
洗液冲力过大会造成酶结合物丢失, 本底偏浅, 吸光 度值偏低, 且洗板后残留液规定一般不超过2ul。
外源性物质主要为：标本溶血、标本细菌污染、标本 储存时间过长、标本凝集不全和采血管中含有添加剂 等。
自身免疫产品：胆红素浓度小于0.05mg/mL的黄疸， 血红蛋白浓度小于5.0mg/mL的溶血和甘油三酯浓度 小于25.0mg/mL的脂血对检测结果没有影响。
实验原理或操作方法
钩状效应（HOOK效应）及交叉反应 现象
非均相酶免疫分析法（heterogeneous enzyme immunoassay） 常用的酶免疫分析
法多为非均相法，又可分为液相酶免疫法和
固相酶免疫法两种，以后者最常用，称为酶 联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。ELISA是
临床上最常用的免疫分析方法。需经过结合 的标记物和游离的标记物的分离才能测定.
植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素
河豚毒素
苯并芘
ELISA在疾病诊断中的作用
ELISA检测 “非典型肺炎”冠状病毒
ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用 检测抗异质性胞核核）33抗体
ELISA法检测幽门螺杆菌抗体
五、ELISA影响因素
试剂因素 标本因素 实验原理或操作方法 环境因素
试剂因素
● 抗原抗体的纯度 ● 标准品定值的准确性 ● 抗体的亲和力、滴度和特异性 ● 标记物的比活性或免疫活性
标本因素
内源性物质常见的有: 类风湿因子（RF）、嗜异性抗 体（Id）、补体、人抗动物抗体（HAAA）、药物及 其导致的代谢产物和交叉反应物质等。
2、包被用抗原
用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗 原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。
3、包被条件
酶标记的抗原或抗体（结合物）
1、酶 用于ELISA 的酶应符合以下要求： （1）纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质
稳定，来源丰富，价格不贵；
（2）制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催 化能力；
二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）和ABTS 。 TMB 经HRP作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。
TMB 性质较稳定，可配成溶液试剂，无致癌性等优点。 酶反应用HCl或H2SO4 终止后，TMB 产物由蓝色呈黄 色，可在比色计中定量， 2、 AP 的底物 AP 为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯（p‐NPP） 作为底物。 产物为黄色的对硝基酚，用NaOH终止酶反应后，黄色 可稳定一时间。 NBT/BCIP，紫色反应，水冲洗终止反应。
固相抗原或抗体
1、固相载体的性状 固相载体在ELISA 测定过程中作为吸附剂和容器，不
参与化学反应。
ELISA 载体的形状主要有：膜（NC膜、PVDF膜、尼 龙膜）、微量滴定板（96孔板）、小珠和小试管，以 微量滴定板（96孔板）最为常用。
良好的ELISA 用96孔板应该是吸附性能好，空白值低， 孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。
②酶标记的抗原或 抗体（标记物）
③酶作用的底物（显色剂）
①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）
加样本
振荡、洗板
加入酶标记得抗原
酶 轻链 螯合剂
标
记 辣根 物 过氧
化物 酶
重链
V
振荡、洗板
加入底物显色液
三、ELISA分类
免疫标记技术
放射物标记技术
酶标技术
免疫荧光技术
酶联免疫吸附技术 酶免疫组化技术
均相酶免疫分析法（homogeneous enzyme immunoassay，HEI）是在检测过程中抗原 抗体反应后，无需分离结合和游离酶标记物， 直接根据反应前后酶活性的改变进行待测物 质的测定的分析方法。
均相酶免疫分析主要有酶扩大免疫测定技术 和克隆酶供体免疫测定两种方法。
均相酶免测定的对象为小分子抗原或半 抗原，主要用于药物测定。可以直接用 于全自动生化分析仪测定。
饲料中盐酸克伦特罗的测定 饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素， 简曲霉毒素 ） 饲料中有害微生物的快速筛检 （如沙门氏 菌）
ELISA用于农药残留的检测
甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析
农药的检测
主要有除草剂与杀虫剂两大类 例如杀暝松（ FN ）、 甲氟磷酸异已酶（ SOMAN ）、 草不绿（ Alachor ）、 西维因（ Carbaryl ）、 多菌灵及克菌丹（ Captan ）等。
（3）在受检标本中不存在相同的酶； （4）相应底物易于制备和保存，价格低廉； （5）有色产物易于测定，光吸收高。 常用的酶为辣根过氧化物（horseradish peroxidase，
HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phosohatase，AP）。
酶的底物
1、HRP 的底物 HRP 催化过氧化物的氧化反应，常用的供氢体有邻苯