过氧化物酶同工酶的分离提取
实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析(实验报告)
实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶生物111班杨明轩1102040128一、研究背景及目的过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在种子萌动以前,它们的过氧化物酶同工酶很少,待幼芽长到0.5 -1 厘米以后,它们的过氧化物酶才得到充分的表达。
这说明植物过氧化物酶同工酶的多寡和有无,与植物不同发育时期,与植物的不同组织、器官的分化形成及特定的生理状态等均有密切关系。
而同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能。
它们存在于生物的同一种属或同一个体的不同发育阶段，或同一发育阶段的不同组织，在细胞发育和代谢调解中起重要作用。
在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，体现各组织的特异功能，这一特点可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。
品种资源工作者借助同工酶分析品种的地理分布与亲缘关系来指导品种资源的收集与鉴定工作。
育种工作者常用同工酶来作为鉴定植物的种间杂交, 特别是远缘杂交的生化指标。
在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段。
要对同工酶展开研究，首先要实现对它的分离，因此要选择合适的分离技术。
基于“差异转化”的思路，层析和电泳是两种最为常见的大分子分离方法。
但由于二者技术细节上的差异，层析更常用于大分子的分离纯化，而电泳则主要用于大分子的分离检测。
因此在本次实验中，我们采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗中的过氧化物酶同工酶。
同时本实验利用电泳现象对过氧化物同工酶进行分离纯化和分析鉴定，通过电泳技术的实际操作体会电泳技术的原理和特点，比较分析电泳技术和其它分离技术如层析技术的不同，进一步学习应用更为广泛和纯化水平更高的分离技术。
几种植物中的过氧化物酶同工酶分析1)
将胶浸入染 色液 中 ５ ０ 神，取 出置 一１ 分
于 永 中＾ 沈 ， 止染 色。 ｀ ＇ 停
将胶 置于醋酸 缓冲液中沁 ２ 分钟， 。 再浸 入染色液中，２℃ 保佩染色 ２ ６ ０ ５ ０分钟 － 后， 取出 ， 水漂洗。
１ 酷酸联苯 ） 胺炸液：２ 克联茉胺溶于 １ 毫升醋酸中， ７ 毫升水。 ８ 加 ２
电泳在冰箱或低于 １ ℃ 的 室 温 下 进 行。 ５
力水至 １０ ｉ 」 ０ｎ１ １ ． 斗 ％ Ｆ 过硫酸 按（ ． 用前配划 、Ｆ Ｔｒ－ ． ｉ 泞檬酸缓冲 液忿 ｓ
１． 呢 ， ４ Ｉｒｓ ５． ８ ＋ 柠 檬 酸 ｉ １ ５
１０ ； ．ｇ
加水至 １ ０ １Ｐ Ｒ９ ０ ｍ， ． ０ Ｈ
＇ｒｓ ．ｑ ｒ ３ ０ ； ｉ ０
Ｔｒｓ ２ ； ｉ６ ｇ ．
甘氨ｌ １・ ； ， 斗斗 ｎ ： ９
甘氨酸 ２０； ． ｋ
至凝胶下端 ０ －１厘米处停止电泳。 电泳 时 ． ５
间约 ９－ １０分钟。 ０ ０ 过氧化物Ｒ 同工醉 的染色鉴定方 法 很 多，
染 色 方 法 染 色
加水至 １０ｒ ，爪 ｝３ 加水至 １０ｍｌ Ｈ ．； ０ ０ ｌ １ ． ： ｎ ００ ， ｈ７ ｐ 使用时杯释 １ 信－ ０ 随用时稀释 ５倍
个过氧化物酶同工酶相对活性的维生素 Ｃ 一联 苯胺染色法阁。 近些年来又较多地采用了丁子
香酚 （ｕｅ ｌ Ｅｇ ｏ ｎ ）一类夭然物作底物的新染
色法［ ９ １ ｃ 近年来， 由于同工酶测定、 分析技术在遗传
１ ）本工 作曾得到龚葵 同志的指导， 特致谢意 ， ２ 黄寿松：西北植物研究所进修人员。 ）
离心（５０．． １ 分钟， ３０ ：ｐｍ）５ ． 取上清液， 混人等
实验五过氧化物同工酶PAGE分析
成分
含量
作用
A液（30%Acr-0.8%Bis） 2.65mL
交联剂
B液（Tris+EDTA） 4.75mL
缓冲液
C液（TEMED）
10μL
加速剂
D液（10% AP）
50μL
催化剂
四、操作步骤
样品制备 称取小麦幼苗叶片0.5 克，放入研钵内，
加 pH8.0 样品提取液1mL，于冰浴中研 成匀浆，转入离心管，在高速离心机上以 8000rpm 离心 10 分钟，倒出上清液， 以等量 40%蔗糖混合，并加2滴溴酚蓝， 即为样品液。
同功酶是机体调节酶活性的一种方式，在各种生物体中 广泛存在。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。 它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。 在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此， 测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某 一时期植物体内代谢的变化。
（二）过氧化物同工酶及其活性染色（P98）
三、材料、仪器和试剂
试剂：
A液：30%Acr-0.8%Bis B液：Tris+EDTA C液：TEMED D液：10%AP 电极缓冲液：硼酸钠-硼酸（pH8.3） 0.5%溴酚蓝 染色液：0.1%联苯胺 样品提取液：pH8.0Tris-HCl缓冲液 40%蔗糖溶液
四、操作步骤
凝胶制备
四、操作步骤
装槽、上样
30-50μL
四、操作步骤
电泳 接好电源线(上槽接负极，下槽接正极)。
打开电源开关，调节电压，以10V/cm稳 定电压电泳，待前沿指示染料溴酚蓝下行 至距胶板末端1-2 厘米处，即可停止电泳。
四、操作步骤
剥胶、染色
过氧化物酶同工酶电泳分析(经典有用)
过氧化物酶同工酶电泳分析实验原理（1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。
上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。
（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。
本实验采用碱性系统。
电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。
而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。
（3）在电场中形成不连续的电位梯度。
在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。
下面以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用：（1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。
（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。
这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。
（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。
其原因如下：①由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。
使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄，浓度升高。
②在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH 8.9。
HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl－布满整个胶板。
待分离的酶蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲液中。
电泳一开始，有效泳动率最大的Cl－迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。
在pH6.7条件下解离度仅有0.1～1％的甘氨酸（pI = 6.0 ）有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。
这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。
在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。
生化实验四--果蔬中过氧化物酶分析
五,操作
1,贮液配制(已完成) ,贮液配制(已完成) 2,安装电泳槽(安装,封底) ,安装电泳槽(安装,封底)
3,制胶(分离胶,光聚合,浓缩胶) ,制胶(分离胶,光聚合,浓缩胶) 拔出梳子,倒入电极缓冲液,备用. 拔出梳子,倒入电极缓冲液,备用. 4,过氧化物酶的提取 , 按下列比例称取果蔬: 按下列比例称取果蔬: 冬 枣 , 柚 子 , 梨 : 1:2 ; 萝 卜 , 盘 菜 : 1:10 ( W:V) , 剪碎 , 放入研钵中 , 加适量石英砂及 ) 剪碎, 放入研钵中, 样品提取液于冰浴上研磨成匀浆, 置于离心管中, 样品提取液于冰浴上研磨成匀浆 , 置于离心管中 , 研钵用少量提取液清洗,洗液并入离心管,以 14000r/min的转速离心 / 的转速离心15min,取上清液贮存于低 的转速离心 , 温冰箱备用. 温冰箱备用.
三,实验步骤
1,取上述样品提取液 , 取上述样品提取液2.5mL,定容至 刻度, , 定容至50mL刻度, 备 刻度 用(仅指萝卜与盘菜,冬枣,柚子与梨不稀释). 仅指萝卜与盘菜,冬枣,柚子与梨不稀释) 2, 取光径 , 取光径1cm比色皿 只 , 于 1只中加入反应混合液 比色皿2只 比色皿 只中加入反应混合液 3mL和磷酸缓冲液 和磷酸缓冲液1mL, 作为对照 , 另 1只中加入反 和磷酸缓冲液 , 作为对照, 只中加入反 应混合液3mL和上述酶液 和上述酶液1mL(如酶活性过高可稀释 应混合液 和上述酶液 ( 立即开启秒表记录时间, 之),立即开启秒表记录时间,于分光光度计上测量 波长470nm下吸光度值 , 每隔 下吸光度值, 每隔1min读数一次 ( 连读 读数一次( 波长 下吸光度值 读数一次 5min,取平均值). ,取平均值)
四,试剂与材料
A(分离胶缓冲液) 1mol/L HCL (分离胶缓冲液) / /100mL Tris TEMED B(浓缩胶缓冲液) 1mol/L HCL (浓缩胶缓冲液) / /100mL C(分离胶贮液) (分离胶贮液) 贮液 /100mL D(浓缩胶贮液) (浓缩胶贮液) 贮液 /100mL Tris TEMED 丙烯酰胺 丙烯酰胺 48mL 36g 24L 48mL 5.9g 48L 30g pH 8.9 pH 6.7 pH 8.9
植物过氧化物酶的提取、
实验结果
记录实验的操作程序，检查是否和原设计 相符合？ 将各胶柱中酶带条数、宽度、着色深浅和 移动距离填入表中。 选择比较组分凝胶中着色最深的酶带或特 殊酶带（即该组分特有酶带），计算酶带 的相对迁移率Rf值。
四、植物过氧化物同工酶电泳技术
实验原理 同工酶（isozymes）是指作用于底物相似或完全相同的 酶的不同分子形式，即催化同一种反应而结构不同的一 族酶。它们是受遗传体系决定的酶的不同分子形式。利 用凝胶电泳技术（PAGE）可以将它们分开，用专一的 作用底物和特殊染料，把需要分析的酶染色，在胶柱上 呈现同工酶谱。 实验目的 通过实验掌握植物同工酶实验技术，了解植物同工酶分 析在遗传学研究中的意义。 着重掌握过氧化物酶的提取，电泳与染色技术和分析方 法。
三、植物过氧化物酶活性的测定（比色法）
原理
过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过 氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶 褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。 分光光度计 离心机 秒表 天平 研钵 磁力搅拌器 愈创木酚 30%过氧化氢 20mmol/L KH2PO4 100mmol/L 磷酸缓冲液， pH6.0（见附表2） 反应混合液
植物过氧化物酶的提取、 活性测定及同工酶的凝胶电泳分析
综合性、设计性实验 广州大学生命科学学院生物工程专业适用
2010年9月
一、植物过氧化物酶的提取
目的要求 学习制备植物过氧化物酶粗酶液的原理和方法 为后续实验提供酶液。 器材与仪器 电子天平； 冰冻高速离心机； 可见光分光光度计； 电动玻璃匀浆机等。 试剂 20mM KH2PO4， 100mM PBS：取0.2M 的Na2HPO4 12.3ml与0.2M的 NaH2PO4 87.7ml混合。加入100ml水稀释即成。
不同光照条件下龙眼体胚发生过程中过氧化物酶同工酶酶谱分析
１ ： 比例加入 提取缓 冲液以及 少许石英 砂 （ ４的 见表 １， 浴充 分研磨 ， ）冰 然后将提 取液转移 到 １ｍ ０ Ｌ离心
管 中 ，℃，２０ ｇ 离 心 ２ｒｉ。取上清液 ， ４ １０ ０ ， ０ ｎ ａ 分装后 ， 于一 ０ ２ ℃冰柜 保存 （ 凝胶贮 藏液见表 ２ 。 ）
了很 大的变化 。酶 带数 量总的 变化趋 势是胚性愈 伤组织谱 带条 数较 少， 形胚发 生过 程 中增 多。 球 到
了子叶形胚后谱 带条数 又减 少； 同光照条件 下 ， 不 蓝光 的谱 带条数 最 多， 明不 同光 照条件对龙 眼 说 体 细胞胚胎 发生有不 同效应， 意味 着蓝 光条件 下体 细胞胚胎 内物质代谢是 最活跃 的 ， 蓝光对体 细胞
时结束 。电泳须在 ４Ｃ 箱 中进行 ５ ７ 。 ｑ冰 — ｈ 分离胶 ： Ｃ： ： ＝ ： １ ４ Ｔ ７７ Ａ： Ｈ Ｇ Ｉ ２： ： ， ＝ ． ％
林小苹 一赖钟雄 ｔ ，
（． 建农 林 大 学 园艺植 物 生 物 工程 研 究 所 Ｉ福 福 建福 州 ３ ００ ： ５ ０ ２
２ 漳州城市职业学院 福建漳州 ３ ３０ ） ． ６０ ０
摘要 ： 验 以龙 眼胚性愈伤组 织为材料 ， 究不 同光 照条件对龙 眼体 细胞胚胎发生各 阶段 过氧 试 研 化物酶 （ Ｏ 同工酶 的影 响。结果表 明： Ｐ Ｄ） 龙眼体 细胞 胚胎发 生各 阶段 过氧化物酶 （ Ｏ 同工酶 出现 Ｐ Ｄ）
熟 而发生 规律性 的变化 。 这种变化在一定 程度上反 映 了植物在发 育过程 中基 因表达 的时空顺 序性 。 因 而 同工酶 的酶谱特 征可 以作 为植 物组 织培养 的一
绿光 、 自光 四个不 同光照条 件处理 。将不 同发育阶
实验二 过氧化物酶同工酶的提取、分离
实验二过氧化物酶同工酶的提取、分离苟亚峰摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定玉米幼苗过氧化物酶同工酶，实验结果显示玉米幼苗中至少含有5种过氧化物同工酶。
关键词：过氧化物同工酶；PAGE；电泳分离引言同工酶是指催化同一种化学反应，但酶的分子结构组成却有所不同的一组酶。
同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如过氧化物酶在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。
电泳(electrophoresis，简称EP ) 指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
1937年瑞典科学家Tiselius 成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖。
50年代，先后出现了以滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物的电泳技术。
60年代，出现了聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。
这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基团体系时，就会聚合。
引发产生自由基的方法有两种：（1）化学法：引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺单体形成单体长链。
化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；（2）光聚合法：光聚合法的催化剂是核黄素（VB2），光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。
过氧化物酶
植物体内过氧化物酶活性测定及同工酶电泳
过氧化物酶活性测定
一、原理
1. 过氧化物酶[perox idase, POD] ： 广泛存在于各种动物、植物和微生物 体内。催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应: RH2+ H2O2→2H2O + R 2. POD 分子结构特点：POD 是一种由单一肽链与卟啉构成的血红素蛋白, 脱 辅基蛋白分子须与血红素结合才构成全酶。
3. POD的主要生理功能： ◆ 参与活性氧代谢过程； ◆ 参与木质素和木栓质的合成； ◆ 参与生长素的降解。
二、实验材料与试剂 1.材料：玉米幼苗
2.试剂： 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）；0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0） 愈创木酚； H2O2
三、实验步骤
1. 提取酶液：取样品1.0g，加入2ml的0.05mol/L pH5.5的磷酸缓冲液，冰浴研 磨，10000rpm，4℃离心后取上清，即为粗酶液。 2. 酶活性测定：采用愈创木酚比色法测定，对照为煮沸5分钟的粗酶液，反应 体系包括：0.05mol/L pH5.5的磷酸缓冲液2.9ml；0.05 mol/L愈创木酚1ml; 2%H202 1ml；粗酶液0.1 ml，反应1分钟后，立刻在470nm下，测定OD值。 以每分钟在470nm处吸光度的变化0.01为一个酶活单位。 3. 计算酶活性：选取OD值变化较均匀的一段数据，代入公式计算； 以每分钟OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活力单位（U）。
二、材料、仪器设备及试剂
1.材料：玉米幼苗
2.仪器设备：稳流稳压电泳仪；冷冻离心机及离心管； pH试纸； 3.试剂： （1)分离胶缓冲液（pH8.9）：1mol/L HCl 48ml，Tris36.6g， TEMED0.23ml，加水定容 至100ml。 (2)分离胶贮液：30g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加水溶解并定容至100ml，过滤 后使用。 (3)过硫酸铵溶液：过硫酸铵0.2g，加水定容至100ml制胶时现配现用）。 (4)浓缩胶缓冲液：1mol/L HCl48ml＋Tris5.98g＋TEMED0.46ml，调pH6.7，并定容至 100ml。 (5)浓缩胶贮备液：丙烯酰胺10g，甲叉双丙烯酰胺2.5g,加水定容到100ml，使用前过滤。 (6)电极缓冲液：Tris 6.0g，Gly 28.8g， 用水定容至1000ml（pH8.3），用前稀释10倍。 (7)四甲基乙二胺（TEMED）。 (8)0.1％的溴酚蓝水溶液。 (9)联苯胺染色母液：联苯胺1g＋冰醋酸18ml＋H2O2ml溶解贮于棕色瓶中。
30种茶花过氧化物酶同工酶分析
１ ． ２ ． １ 酶 液提 取
Байду номын сангаас
取 上述 叶片洗净 ， 称取 １ ｇ于研
钵， 加７ ｍ Ｌ酶提 取 液 （ Ｔ ｒ ｉ ｓ —Ｈ Ｃ １ ， ｐ Ｈ ８ ． ０ ） 和少 量 石英 砂 ， 冰浴研磨 成匀浆 ， ４℃ 、 ４ ０ ０ ０ ｒ ／ ａ ｒ ｉ ｎ冷 冻离 心 １ ０ ｍｉ ｎ ， 取上 清液加入 等体积 质量分 数 ４ ０ ％的蔗 糖 溶 液 及 １滴 溴 酚 蓝 指 示 剂 制 成 样 品 液 ， 置 于
的怒 江红 【 Ｊ Ｊ 茶等 ３ ０个川茶 花 和引进 茶 化 的种 和 品
（ ｐ Ｈ ８ ． ３ ） ， 进样 量 ２ ５ Ｌ ， 以溴 酚 蓝作 前 沿 指示 剂 ，
电泳 电压强度 １ ０ Ｖ ／ ｃ ｍ， ０～ ４℃下 电泳 ３～ ４ ｈ ， 电
摘要 ： 以四川乐 山地 区怒江红山茶等 ３ ０个茶花种 和品种为材料 ， 用聚丙烯酰胺凝胶 电泳 （ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ ） 方法 检测了其过氧化物酶（ Ｐ Ｏ Ｄ ） 同工酶 ， 为茶花品种分类提供依据． 共 电泳 出 １ ３条酶带 ， 其中 ， ｅ ２、 ｅ ３ 、 ｅ ４为 ３条 基本酶带 ， 其余酶带各 种茶花间有差异 ， 有 ３种茶花具有 特异酶 带． Ｐ Ｏ Ｄ同工酶 可作为茶花 分类 的依 据之
１ ． ２ 实验 方法
标记技术迅速应用于茶花遗传多样性研究与分类 ， 邓 白罗 等 用 Ｒ Ａ Ｐ Ｄ标 记对 山 茶属 红 Ｉ Ｊ 』 茶 组 植 物
进 行 了分 类研究 ， 申屠 文月 等 也 利用 Ｒ Ａ Ｐ Ｄ标 记 对 ３个 山茶花变 异品种 进行 了鉴 定 ， 宾 晓芸 等 利 用 Ｉ Ｓ Ｓ Ｒ标 记 分 析 了金 花 茶 的遗 传 多 样 性 ， 倪 穗 等 采用 Ｉ Ｓ Ｓ Ｒ分 子 标 记 技术 对 ２ Ｏ个 国 内外 茶 花 品种进行 了遗传 关系 的分 析． 由于 同工酶 和分 子 标 ｆ 技术 一样在植 物分类 方 面具有 重 要意 义， 且 成 本 较低 ， 易于操 作 ， 所 以 已广 泛 应 用 于 腊梅 、 桂花、 菊 花、 梅花 、 荷花 、 兰花 、 月季、 葡萄、 月桂 等 多种 植 物
实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶（实验报告）
实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析⼩麦幼苗过氧化物酶同⼯酶（实验报告）⽣物化学实验报告实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析⼩麦幼苗过氧化物酶同⼯酶⼀、研究背景及⽬的电泳现象就是带电粒⼦在电场中向与其⾃⾝带相反电荷的电极泳动。
电泳技术最初是由瑞典的著名科学家Tisellius所奠基，⾃此⽣物⼤分⼦的分离纯化便进⼊了电泳技术的新纪元。
电泳技术的发明是⼈们在分离纯化技术中的“差异转换”思路上⼜⼀次伟⼤的飞跃。
⼈们清楚地意识到，要想使⽬标物得到分离，⽬标物与杂质之间的性质差异必须⾜够⼤，这⼜与某些性质差异⼩的物质的分离相⽭盾，⽽⼈为放⼤这些差异⼩的性质必然会破坏⽬标物的原有结构，因此需要借助第三者进⾏差异转化，即以其⾃⾝的性质为基础，转化为其他⽅⾯差异⼤的性质。
电泳技术就是利⽤⼀些⽣物⼤分⼦的电性特点，在⼀定的条件下使被分离物之间很⼩的差异转化为⾃⾝所带电荷性质与数量的差异，在外加电场的作⽤下便会体现出迁移⽅向及速度上的差异，通过时间上的积累进⽽体现为迁移距离的差异。
最初的电泳技术是在溶液中进⾏的⾃由电泳，后来⼈们想到，由于待分离物的⼤⼩、形状也存在差异，那么它们在电场中泳动的过程中必然会受到不同的阻⼒，这种阻⼒的差异⼜转化为了电场中迁移速度的差异，所以⼈们便发明了各种⽤于电泳的载体（⽀持介质），使分⼦的⼤⼩及形状差异得以转化和体现，⼤⼤提⾼了分辨率。
⾄此，电泳技术的基本理论就建⽴了。
此后，在实际操作中，⼈们不断进⾏探索、改进与完善，发明了诸多的电泳新技术，使电泳成为⼀项⽣物⼤分⼦分离纯化中令⼈瞩⽬的研究技术。
本实验基于电泳的基本原理对⼩麦过氧化物酶同⼯酶进⾏分离，旨在学习并掌握电泳技术的发明历程以及操作过程中的相关细节，同时更为深刻地理解⼀项新技术在实际应⽤中不断修正与完善的过程，体会电泳和层析两⼤技术各⾃的特点和优势。
⼆、原理[1]1.过氧化物酶同⼯酶同⼯酶是催化同⼀种化学反应，但其酶蛋⽩本⾝的分⼦结构组成却有所不同的⼀组酶。
过氧化物酶同工酶的分离提取
20min，沉淀。沉淀用 5ml 0.05 M PBS回溶（测含量和活性）低温保 存.
本实验以菠菜叶片（或苜蓿种子）为材料，低速离心 去除细胞碎片，上清用丙酮或硫酸铵沉淀得过氧化物酶同 工酶粗品。
实验材料与器材
（一）材料：菠菜叶片（或苜蓿种子） （二）器材：研钵、超声波粉碎仪、
高速冷冻离心机、酸Байду номын сангаас计
实验试剂
1． 丙酮
2． 提取缓冲液[pH5.5 0.05M PBS 1L ，需 磷酸氢二钠（含12个水）0.1433g、磷酸 二氢钠（含2个水）0.7178g]。
过氧化物酶同工酶的分离提取
制作人：王瑞刚
内蒙古农业大学 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验原理 实验材料与器材 实验试剂 实验步骤
实验原理
过氧化物酶是植物提内普遍存在、活性较高的一种酶， 它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系， 在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测 定这种酶的活性，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
实验步骤
1．精确称取10g左右植物样品（若是苜蓿种子，提前用水溶胀好，） +20ml提取缓冲液匀浆；
2．超声裂解5min； 3．13000g离心20min； 4．取清液（量体积），沉淀弃去（清液少许低温保存测定酶活和含量）； 5．沿烧杯壁缓慢加入等体积-30℃预冷的丙酮，4℃放置1h； 7．13000g离心20min，沉淀用3 ml 0.05 M PBS回溶(留作实验二测含量
黄芩过氧化物酶同工酶几种酶液提取方法的比较
关键 词 ： 黄芩 ； 氧化物 同工酶 ； 过 电泳
中图分类号 ： ６． ； ４ ． 文献标识码 ： 文章编号 ： ０ －００ （０８０ 一Ｏ３ —０ Ｓ５７ ９Ｑ ９６６ Ａ １ １ ０ ９２０ ）６ ０３ ３ ０
中药黄芩为唇形科植 物黄芩 （ｃｔ ｌｒ ｉ ｌ ｓ Ｓｕｅ ａ ｉ ｂ ｃ ｅ ｉ ｌ ａ ａ ａ ｎｓ Ｇ ｏｇ） ｅｒｉ的干燥根 ， 具有清 热燥湿 、 泻火解毒 、 止血安胎 等 功效Ｌ 。其主要成分黄 芩 甙 （ａ ａｉ， ａ 有抗 菌、 ｌ Ｊ ｂｉ ｌ Ｂ Ｄ具 ｃｎ 抗 病毒 、 抗炎 、 变态反应 、 抗 抗氧化 、 除氧 自由基 、 清 抗癌 、 抗 肿瘤 、 抗凝 、 血栓形 成 和保 护肝 脏 、 抗 心脑 血管 、 神经 元
１次 。
基金 项 目 ： 黑龙 江省普 通 高等 学校 骨干 教 师创 新能 力计 划资 助 项
目（ ｏ １ ５ Ｇ ６ ） Ｎ ．０４ Ｏ ６。
收 稿 日期 ：０ ８ ０ － ３ ２０ － １ ０
Ｓ ｕ ｙ ｏ ｈ ｆｃ ｉ ｇ Ｆａ ｔ ｒ ｎ Ｐｕ ｉｙｎ ｍｅ ｔｃＳ ｗａ ｅ ｂ ｗｏ Ｈｙ ｒ ｐ ｙ ｅ ｔ ｄ ｆ ｔ ｅ Ａｆｅ ｔ ｃｏ ｓｏ ｒｆ ｉ ｇ Ｄｏ ｓｉ ｅ ｇ ｙ Ｔ ｄ ｏ ｈ ｔｓ ｎ
植 物 细胞 工程 方面 的研 究 。Ｅｍａｌｚ ａｇｅ ２ ２ ３ ６ ＠ １３ Ｃ ｒ。 － ｉ：ｈ ｎ ｌ１ ０ ７ ８ ０ ６ ．Ｏ ｉ ｎ
体 ， 无 菌 外 植 体 接 种 于 附 加 ０ ２ｍ ／ ， 一 和 将 ． ｇ Ｌ ２ ４ Ｄ
２０ｒｇ Ｌ６Ｂ ． ／ －Ａ的 ＭＳ培养基 中（ 糖 ３ ， ａ 蔗 琼脂 １ ， ｐ ． ）（５ ）。 Ｈ ５ ８ ，２ ±１ Ｃ暗培养诱 导愈伤组织 。选取疏 松的 淡黄色的愈 伤组 织作 为继代培 养 的材料 。每 ３周继代
1种利用SDS-PAGE检测过氧化物酶同工酶的分析方法
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过 氧化 物 酶 （ ｅ０ｉａｅ Ｐ Ｄ） Ｐ ｒｘｄ ｓ ， Ｏ 同工 酶 作 为 一种 重要 的
Ｂａ ｒ 方法凹 以牛 血清白蛋白为标准ｏＯ ｒ ｏｄ ｆ ， Ｐ Ｄ活性测定采用
愈创木 酚方 法圈 。
遗传 标记 被 广 泛应 用 于 生物 学 研 究 的各 个 领 域 ，Ｏ Ｐ Ｄ同工 酶能 够 在很 大 程度 上 反 映植 物 个 体 之 间 的遗 传 差异 ， 探 是 测基 因差 异和遗 传变 异的一种 重要 手段［］ Ｏ ｉ。 Ｄ同工酶 作为 －Ｐ ３ 遗传标 记 ， 为农 作物 、 可 药用 植物 与 药材 品种 鉴 定提 供 重要 依据 。 统 的 Ｐ Ｄ同工 酶检 测方 法 是先 用 聚丙 烯 酰胺 凝 传 Ｏ 胶 电泳 （Ａ Ｅ 分 离蛋 白质 样 品 ， 用醋 酸联 苯 胺染 色检 测 ＰＧ ） 再 Ｐ Ｄ同工 酶 。 者 建立 了 １ Ｏ 笔 种检 测 Ｐ Ｄ同工 酶 的新 方 法 ， Ｏ 基 本原 理 为 ： 聚丙 烯酰 胺凝 胶 中加入 十二 烷基 磺 酸钠 （Ｄ ） Ｓ Ｓ 分 离样 品 ，Ｄ 使 Ｐ Ｄ同工 酶暂 时变 性 ， ＳＳ Ｏ 电泳 完毕 后 ，ｉ０ Ｔｔ ｌ ｎ Ｘ １０ Ｐ Ｄ同工酶复 性 ， 一 使 Ｏ ０ 最后用 醋 酸联苯 胺染色 检测 Ｐ Ｄ ０ 同工酶 ； 并利用 新建立 的方 法分 析 了 ５ 种菖蒲 属植 物 叶子的 Ｐ Ｄ同工 酶 ， Ｏ 旨在 为 菖蒲 的科 学 分 类 和鉴 定 提供 新 的生化 指标。
Ａ ｔ ｃｉ ｇＭ ｅ ｈｏ ｏｒＡｎａｙｓｓｏｆ ｒ ｘ ｄ ｓ ｓ ｅ ｙ ｅ ｉ Ｄ Ｓ ＡＧ Ｅ Ｄｅｅ ｔｎ ｔ ｄ ｆ ｌ ｉ ｏ ｉ ａ ｅＩ ｏ ｎｚ ｍ ｓＵｓｎｇＳ Ｐｅ
植物过氧化物酶提取及电泳
菜心的花和叶的过氧化物酶的提取、活性测定及同工酶的凝胶电泳分析广州大学生命科学学院洪韬文生物工程1121114200044摘要：本实验分两部分，1：过氧化物酶的提取，:用考马斯亮蓝试剂进行酶液蛋白质浓度的测定，根据标准曲线的方程式，计算出样品的蛋白质含量；2：:通过过氧化物酶活性的测定（愈创木酚氧化比色法），测出的OD值计算出酶活性数值，接着对同工酶的凝胶电泳分析，使它在胶柱上呈现同工酶谱，得出最终实验结果，通过数据记录和拍照记录最终结果。
关键字：过氧化物酶蛋白质OD值同工酶凝胶电泳前言：本实验是在完成基础生物化学实验以后，学生综合运用已经学过的生物化学实验理论和已经掌握的生物化学实验技术进行的一项综合性设计性实验，也是对学生实验动手能力的一次较全面的检验。
POD是一种由单一肽链与卟啉构成的血红素蛋白，脱辅基蛋白分子需与血红素结合才构成全酶。
参与植物POD血红素的合成部位可能象动物一样是在线粒体上。
POD 是一种氧化还原酶，它是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶，POD广泛存在于植物体内，是一种活性较高的一种酶，它与植物的呼吸，光合作用以及生长起着很大的作用。
材料和方法：材料：菜叶，菜花方法：1.植物POD的提取分别称取菜心的花和叶各1~2克，然后剪碎，分别放入研钵，向研钵中加入少许石英砂和3ml KH2PO4，快速研磨，后分别加入离心管中进行离心，离心条件为8500rpm，时间为15分钟。
离心完毕后取上清液，并定容至10ml（刻度试管），***此液即为POD提取液，取5ml冷冻保存，作为电泳的POD样品。
2.蛋白浓度的测定—考马斯亮蓝法标准曲线的制定制作标准曲线回归方程：Y(含量)=aX(OD595值) + b，得出相关系数R2。
3.样品蛋白浓度的测定根据标准曲线的方程式，计算出样品的蛋白质含量。
4.过氧化物酶活性的测定（愈创木酚氧化比色法）备好酶液，将分光光度计调到470nm，取光径1厘米的比色杯2只，向对照杯加反应混合液2.0 ml，KH2PO4 0.5ml，校零点。