华南师范大学实验报告 (2).doc

华南师范大学实验报告

学生姓名李思颖学号 2００7０00400４

专业综合理科二班年级、班级07 级

课程名称生物化学实验实验项目酚法测定血清蛋白的含量

实验类型□验证□设计□综合实验时间 2０08 年10 月 6 日

实验指导老师陈老师实验评分

一、目的

１、学习分光光度计的原理和使用方法。

２、学习—酚法测定蛋白质含量的原理和方法。

3、进一步掌握比色法或分光光度法，准确测定未知样品。

二、原理

蛋白质浓度从它们的物理化学性质，如折射率,比重，紫外吸收测定而得知，或用化学方法，如定氮，双缩脲反应，—酚法是一般实验室中经常使用的方法。—酚法是双缩脲法的发展,反应的第一步涉及到在碱性溶液中铜一蛋白质复合物的形成,然后这个复合物去还磷钼酸—磷钨酸试剂(氏剂),产生深蓝色（钼蓝和钨蓝混合物)。

优点:—酚法灵敏度高,较双缩脲法灵敏1００倍。

缺点：所测蛋白质样品中若含酚类及柠檬酸均有干扰作用，浓度较低的尿素(约0.5％左右），胍（0。5％左右）,硫酸钠(１％），硝酸钠(1%）,三氯乙酸(0．5％)，乙醇(5％）乙醚（5％）,丙酮(0。5%)等溶液对显色反应影响,这些物质浓度高时必须做校正曲线。含硫酸铵的溶液只须加浓碳酸钠-氢氧化钠溶液即可显色测定.若样品酸度较高，显色后色浅。则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1—2倍。

三、材料、试剂与器具

（一)材料

血清:使用前稀释100%

（二）试剂

1、标准酪蛋白溶液：称取1２5毫克酪蛋白粉末,用0．1Ｎ氢氧化钠溶液溶解，加蒸馏水到250 毫升，则配成500微克／毫升的标准酪蛋白溶液。

２、—酚试剂甲：由下述四种溶液配制而成。

（1)４%碳酸钠溶液

（2）０．2N氢氧化钠溶液

(3)１%硫酸铜（4·5H2Ｏ）溶液

(４）２%酒石酸钾钠溶液，在使用前，将（1)和（2)等体积混合成碳酸钠—氢氧化钠溶液.将(３)与（４)等体积混合配成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后将这两种溶液按50:１的比例混合，即为-酚试剂甲。该试剂只能用一天,过期失效。

3．—酚试剂乙:在2升的磨口回流装置内加入钨酸钠（24·2H2Ｏ)1０0克，钼酸钠（24·２H２O）2５克,蒸馏水70０毫升,8５％磷酸50毫升和浓盐酸100毫升，充分沸合后以小火回流10小时，再加入硫酸锂（２4)150克,蒸馏水50毫升及数滴液体溴。然后开口继

续沸腾１5分钟，以驱除过量的溴。冷却后定容到１000毫升，过滤，溶液呈绿色。

用—酚试剂乙滴定标准氢氧化钠溶液（1N左右）以标定-酚试剂乙的浓度。以酚酞为指示剂。当溶液的颜色由红色变为紫红色、紫灰,再突然转变为墨绿时，即为终点。该试剂酸度一般为2N左右,此为贮存液。也可以用氢氧化钠去滴定—酚试剂乙，但终点较不易掌握,此时溶液颜色由浅黄变为浅绿,再变为灰紫为终点.

使用前应予以适当稀释，使其成为1Ｎ的酸，此为—酚试剂乙使用液。

以上两液均应装于棕色瓶内,贮于冰箱中,可以长期保存.

（三)器具

1、试管及试管架

2、吸量管(1,5毫升）

3、可见光分光光度计

四、操作步骤

(一）标准曲线的制作

取１２支试管，分别加入０,0。2， 0.4, 0.6， 0.８，１。0毫升标准酪蛋白溶液（５０0微克/毫升）用水补足到1。0毫升，以上每种浓度各做一份重复，即平行做两份，按顺序向各管加入3毫升—酚试剂甲,混匀，室温下放置10分钟,再依次向各管加入0．3毫升—酚试剂乙，立即摇匀，在室温下放置３０分钟，然后于50０处比色。看两个平行管的光密度值是否接近，取其平均值,以光密度(0）为纵坐标，以酪蛋白溶液浓度为横坐标，绘制酪蛋白的标准曲线。

此次实验时室温是:２８℃

（２）第二组试管

（4）酪蛋白的标准曲线

现象分析：

两组试管分别加入3酚试剂甲后，试管1和1’仍显示无色透明，但从试管２至６、试管２’至6’均出现淡紫红色，并随试管序号递增依次加深（每支试管必须与试管1或1'在白色背景下才能看出淡紫红色）。因为酚试剂甲试剂有碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜及酒石酸甲钠组成.蛋白质中的肽键在碱性条件下,与酒石酸钠铜盐溶液起作用,生成紫红色络合物,而各支试管的蛋白质浓度均不大,所以紫红色非常浅。

两组试管分别加入3酚试剂乙后，均呈现蓝色，而且随着试管序号的递增蓝色依次加深，呈现一定的梯度。因为乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中的酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应,其色泽深浅与蛋白质含量呈正比。

（二）血清样品的测定

取2支试管,各加入一定量血清稀释液(应使其蛋白质含量在酪蛋白标准曲线范围之内）本实验取０。4毫升血清稀释液,再加0．6毫升蒸馏水使样品体积达到1毫升。其他操

现象分析:

试管1至３的血清浓度理论上是一致的，试管1和试管２测得的Ａ值一致，不过试管2测得的A值与其它两支管的值相差较大，原因可能是加入2号试管的血清过少或蒸馏水的量过多,导致２号试管血清浓度比1号和３号试管小,最后使A值偏少。因此2号试管的值不采用。

(三）计算

将血清样品的光密度读数在标准曲线上查出相应标准酪蛋白溶液的浓度，再折算成每毫升血清稀释液含蛋白质的微克数.然后乘以稀释倍数,得出每毫升未稀释血清蛋白质的微克数,最后打算成临床化验上通用的单位克％，即１０0毫升血清中含蛋白质的克数.

把血清的平均光密度值0。１54代入标准方程0。0０0０９０.５１6中的ｙ

即可得ｘ值为1１4,再把１14代入以下方程

6

2.5100(/100)10010ml ⨯⨯=⨯标准曲线查得值血清蛋白含量克 则实验的血清蛋白含量为:0.02８5（克/10０）

五、讨论

1、分光光度计的结构

分光光度计是一种靠光栅或棱镜提供单色光的，复杂、精巧的仪器。它不仅能在可见 光区测定有色物质的吸收光谱，而且也能在紫外光区和红外光区测定无色物质的吸收光 谱。分光光度计的种类很多,其原理和结构基本相似，一般都包括以下几个部件： （１）光源 分光光度计上常用的光源有两种，即钨灯和氢灯(或氘灯).在可见光区, 近紫外光区和近红外光区常用钨灯；在紫外光区，多使用氢灯（或氘灯）。

（2)单色器 它是把混合光分解为单一波长光的装置.多用棱镜或光栅作为它的色

散元件。光波通过棱镜时，不同波长的光折射率不同，波长愈短，折射率则愈大，反之,波 长愈长,折射率则愈小，因而能将不同波长的光分开.

（3)吸收池(比色皿、比色池)一般由玻璃、石英和熔凝石英制成，用来盛被测试的 溶液。

(4)检测器 由光电池、光电管、光电倍增管组成.

(５）测量装置 以电流表、波长分度盘和测量读数盘的形式输出测量结果，现代的仪 器常附有自动记录器，可自动描出记录曲线。

2、比色皿的使用和清洗 分光光度计比色皿类型多样，但最常用的是光径1方形杯.由于33０以下的光不能透过玻璃比色皿，紫外光区测量时要用石英比色皿。同组使用的比色皿必须配套，以装有纯溶剂的比色皿，在试验波长下，测定光吸收是否一致而进行挑选、搭配。

比色皿四面仅有两面系光滑透明，具有光学性质，另两面则无，它们常以磨玻璃为材 料,以示区别.比色皿光学表面不能有任何污损,否则会引起光吸收的增加。

比色皿中所盛溶液不能太少,否则光路不能透过待测溶液;但也不能太多,否则溶液

易洒出，从而污损或腐蚀仪器，一般所盛液体约占全部容积的2／3。每次使用后，应立即倒空或以吸液泵吸干，然后用水冲洗比色杯３－4次。比色皿的外表面应以高质量的柔软擦镜纸擦干净,不能使用易磨损比色皿的普通纱布。

3、加入—酚试剂时的注意事项

—酚法所用的试剂是由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起显色反应，试剂乙(磷钼酸和磷钨酸混合液)在碱性条件下极不稳定,易被铜-蛋白质复合物还原成钼蓝和钨蓝。因此，在进行测定时加—酚试剂要特别小心,因为—酚试剂乙仅在酸性条件下稳定，但上还原反应只是在１０的条件下发生，故当—酚试剂乙加到碱性的铜—蛋白质溶液中时,必须立即混匀。以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，（还原反应即能发

生）能有效地被２+—蛋白质结合物所还原.

4、其它侧蛋白质浓度的方法

总氮量的测定、双缩脲法、紫外线法、染色法。

六、小结

1、在对两组试管分别加进酚试剂甲后只是每支拿起来直接观看,所以没有看到颜色，当老师提醒后,在白色背景依次拿2至6号试管与1号试管对照才发现2至６号试管是带有淡淡