第二章___微生物发酵产酶
第二章 微生物发酵产酶
曲霉、欧文氏菌 啤酒酵母、假丝酵母
水勇果于加工开，始果，汁、才果能酒找澄到清，成麻类纤维脱胶
功的路
制造转化糖
凝乳酶
米赫毛霉、大肠杆菌和真菌生产的重组酶 制造乳酪
脂肪酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖异构酶 青霉素酰化酶
曲霉、根霉、酵母等 青霉、曲霉 凝结芽胞杆菌，白色链霉菌 细菌、霉菌、放线菌
加酶洗涤剂，油脂加工，生物化工 食品去氧、除葡萄糖，测定葡萄糖 生产果葡糖浆 制造6-氨基青霉烷酸
第三节 发酵工艺条件及控制
工艺流程
原生质体 固定化原生质体
培养基
保藏细胞 细胞活化 扩大培养
发酵 分离纯化
酶
固定化细胞
预培养 无菌空气
一、细胞活化与扩大培养
1、生产菌种的来源
（1）购买或筛选
向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。 中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）； 中国典型培养物保藏中心（CCTCC，又称武大保藏中心）
一、产酶菌种的要求
1、发酵周期短，产量高； 2、容易培养和管理； 3、产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染； 4、利于酶的分离纯化； 5、安全可靠，无毒性。（非致病菌）。
二、产酶微生物
菌种是发酵生产酶的重要条件。已经在自然界中 发现的酶有数千种，目前投入工业发酵生产的酶约有 50～60种。它们的生产菌种十分广泛，包括细菌、放 线菌、酵母菌、霉菌。
工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源
酶
α-淀粉酶
葡萄糖淀粉酶 中性蛋白酶 碱性蛋白酶
植酸酶
产酶微生物 枯草芽胞杆菌， 地衣芽胞 杆菌， 米曲霉
米曲霉，黑曲霉，米根霉 枯草芽胞杆菌，米曲霉
地衣芽胞杆菌 黑曲霉，毕赤酵母工程菌株
第二章 微生物发酵产酶
基因操纵子调节系统示意图
操纵子
控制区
调节基因 启动基因 操纵基因
信息区
结构基因 DNA
转录
RNA聚合酶 翻译
（ -） （+） 转录
mRNA 翻译
阻遏蛋白
蛋白质
诱导剂
(二) 酶合成调节的类型
1.诱导 (induction)
组成酶：细胞固有的酶类。
诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似 物而临时合成的一类酶。
固定化酶的优点
多次使用 可以连续反应 优点 纯化简单 提高产物质量 应用范围广
固定化原生质体的优点
☻属于胞内产物的胞内酶等分泌到胞外
☻稳定性较好，可以连续或重复使用较长时间
第一节 酶生物合成的基本理论
提取分离法 酶的生产方法 生物合成法
微生物细胞发酵产酶 植物细胞发酵产酶
化学合成法
动物细胞发酵产酶
启动子（promotor) 终止子(terminator)
3 5 ´ ´ DNA
编码链 (coding strand) 有意义链(sense strand)
5´ 3´
反意义链:指导转录作用的一条DNA链 有意义链:无转录功能的一条DNA链.
5’ 3’
有意义链
TC GAG TAC AG C T CATG C GAGUAC 5’ 3’
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
A、乳糖操纵子的结构
调节 基因 R
启 动 操纵 子 基因
P O LacZ
乳糖结构基因
LacY Laca
mRNA
基
阻遏蛋白 （有活性）
因
关
闭
B、乳糖酶的诱导
调节 基因
R mRNA
启 动 操纵 子 基因 P O
酶工程期末复习题
第一章绪论问题：试述木瓜蛋白酶的生产方法？答：木瓜蛋白酶可以采用提取分离法、基因工程菌发酵法、植物细胞培养法等多种方法进行生产。
(1)提取分离法：从木瓜的果皮中获得木瓜乳汁，通过各种分离纯化技术获得木瓜蛋白酶。
(2)发酵法：通过DNA重组技术将木瓜蛋白酶的基因克隆到大肠杆菌等微生物中，获得基因工程菌，在通过基因工程菌发酵获得木瓜蛋白酶。
(3)植物细胞培养法：通过愈伤组织诱导获得木瓜细胞，在通过植物细胞培养获得木瓜蛋白酶。
第二章微生物发酵产酶1、解释酶的发酵生产、酶的诱导、酶的反馈阻遏(产物阻遏)、分解代谢物阻遏。
诱导物的种类？答：酶的发酵生产：利用微生物的生命活动获得所需的酶的技术过程；酶的诱导：加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为诱导作用；产物阻遏（反馈阻遏）：指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。
分解代谢物阻遏（营养源阻遏）：是指某些物质经过分解代谢产生的物质阻遏其他酶合成的现象。
诱导物的种类：诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物，有的也是反应产物。
2、微生物产酶模式几种？特点？最理想的合成模式是什么？答：（1）同步合成型特点：a.发酵开始，细胞生长，酶也开始合成，说明不受分解代谢物和终产物阻遏。
b.生长至平衡期后，酶浓度不再增长，说明mRNA很不稳定。
（2）延续合成型特点：a.该类酶一般不受分解代谢产物阻遏和终产物阻遏。
b.该酶对应的mRNA是相当稳定的。
（3）中期合成型特点：a.该类酶的合成受分解代谢物阻遏和终产物阻遏。
b.该酶对应的mRNA不稳定。
（4）滞后合成型特点：a.该类酶受分解代谢物阻遏和终产物阻遏作用的影响，阻遏解除后，酶才大量合成。
b.该酶对应的mRNA稳定性高。
选择：在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期，最理想的合成模式是延续合成型。
3、可以添加什么解除分解代谢物阻遏？表面活性剂的作用？答：（1）一些酶的发酵生产时要控制容易降解物质的量或添加一定量的cAMP，均可减少或解除分解代谢物阻遏作用。
酶工程考试重点
第一章：绪论◆酶：由生物体产生的具有生物催化功能的生物大分子，按照分子中起催化作用的主要组分的不同，自然界中天然存在的酶可以分为蛋白类酶（protein enzyme)和核酸类酶◆酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程◆锁与钥匙学说：底物结构必须与酶活性部位的结构非常互补，就像锁与钥匙一样，这样才能紧密结合，形成酶-底物复合物。
这个学说可以解释酶的绝对专一性，但是不能解释酶的相对专一性。
◆诱导契合理论：酶分子活性中心的结构并不与底物分子的结构互补,但活性中心有一定的柔性，当底物分子与酶分子相遇时可以诱导酶蛋白的构象发生相应的变化，使活性中心的各个结合基团与催化基团达到对底物结构正确的空间排布与定向，从而使酶与底物互补结合，产生酶-底物复合物，并使底物发生化学反应◆中间产物学说：酶首先与底物结合成酶-底物复合物，然后转变成酶-过渡态中间物复合物，然后，生成酶-产物复合物，最后从酶分子上释放产物，从而大大降低反应的活化能（分子由基态转变为过渡态即活化态所需的能量）。
◆Km 值是当酶反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度◆竞争性抑制：抑制剂竞争性与酶的活性中心结合，从而阻止底物与酶的结合。
这是最常见的一种可逆抑制作用。
随着底物浓度增加，酶的抑制作用减弱。
Vm 不变，Km 增大◆非竞争性抑制：底物和抑制剂可以同时与酶结合，抑制剂结合于活性中心以外的部位，两者没有竞争作用，但影响产物的释放，Vm 降低，Km 不变◆反竞争性抑制Vm 降低，Km 减小◆酶活力：酶催化底物发生化学反应的能力。
测定酶活力，实际上就是测定酶促反应进行的速度。
酶促反应速度越快，酶活力就越大；反之，速度越慢，酶活力就越小。
◆酶的比活力：每毫克酶蛋白（酶制剂）所含的酶活力单位数称为酶的比活力，用U／mg 蛋白表示。
酶的比活力是酶制剂的一个纯度指标。
对同一种酶来说，比活力愈高，表明酶纯度愈高。
◆酶的生产方法：.提取分离法；生物合成法；化学合成法第二章：微生物发酵产酶结构基因、操纵基因与启动基因一起组成操纵子，分为诱导型与阻遏型。
酶工程课后问答题
酶⼯程课后问答题第⼀章绪论1.什么叫酶⼯程？酶⼯程的主要任务是什么？答：（1）酶的⽣产与应⽤技术过程称为酶⼯程。
（2）酶⼯程的主要任务是经过预先设计，通过⼈⼯操作，获得⼈们所需的酶，并通过各种⽅法使酶充分发挥其催化功能。
2.常⽤酶的活⼒单位及其定义是什么？答：常⽤酶的活⼒单位：IU和卡特（kat）IU：表⽰每分钟催化1umol的底物转化为产物的酶量为⼀个酶活⼒单位。
卡特（kat）:表⽰每1s催化1mol底物转化为产物的酶量定义为 1卡特3.液体酶的酶活⼒测定⼀般要经历哪些步骤？举例说明。
答：㈠液体酶的酶活⼒测定⼀般哟啊经过四个步骤：①根据酶催化的专⼀性，选择适宜的底物，并配制成⼀定浓度的底物溶液。
②根据酶的动⼒学性质，确定催化反应的温度、PH值、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。
③在⼀定的条件下，将⼀定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。
④反应到⼀定的时间，取出适量的反应液，运⽤各种⽣化检测技术，测定产物的⽣成量或底物的减少量。
㈡举例说明：如测定蛋⽩酶的活⼒时，选择蛋⽩作为底物，并配制成⼀定浓度的溶液；根据蛋⽩酶的动⼒学性质，确定溶液的温度为28℃，PH值为8.5；将底物蛋⽩液蛋⽩酶混合均匀，取出适量的反应液，测出产物的⽣成量或底物的减少量。
4、酶的⽣产⽅法有⼏种？各有何优缺点？答：酶的⽣产⽅法有三种。
㈠提取分离法：采⽤各种提取、分离、纯化技术从动物和植物的组织、器官、细胞或微⽣物中将酶提取出来，再进⾏分离纯化的技术过程。
优点：设备较简单，操作⽅便。
缺点：受⽣物资源、地理环境、⽓候条件影响，或者使⼯艺路线变得繁杂。
㈡⽣物合成法：利⽤微⽣物细胞、植物细胞或动物细胞的⽣命活动⽽获得⼈们所需酶的技术过程。
优点：⽣产周期短，酶产率较⾼，不受⽣物资源、地理环境和⽓候条件影响。
缺点：对发酵设备和⼯艺条件要求⾼㈢化学合成法：采⽤化学技术合成⼈们所需酶的技术。
优点：对认识和阐明⽣物体的⾏为和规律、设计和合成⾼效率具有重要理论意义。
02第二章 微生物发酵产酶 第三章 动植物细胞培养产酶
Amylase from Bacillus Protease from Bacillus Phosphatase from Bacillus Glucoamylase from Aspergillus …… Plant cell culture Animal cell culture
Few examples
30
进 位
成肽 转 位
31
合成终止
32
高效率的蛋白 质合成体系
33
蛋白质的折叠
蛋白质的空间结构如何形成？ 功能与结构如何统一？ 体外、体内的结构如何变化？
蛋白质分子设计及蛋白质工程的需要 越来越多的基因工程产物需要复性复活, 要求蛋白质折叠 的理论及技术的指导。基因工程重组蛋白类产物必须要形 成正确的折叠才能表现出功能和活性。
19
蛋白质合成的几个要素-遗传密码，nucleotide triplet codon
mRNA分子中,每三个相邻的核苷酸组成的三联体 代表某种氨基酸或其它信息，称为密码子或三联 密码。 四种核苷酸编成三联体可形成43个即64个密码子。 其中： 一个起始密码: AUG
三个终止密码: UAA
可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) （一种变构蛋白），通过与效应物 (effector) （包括诱导物和辅阻遏物）的特异 结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因 的结合力。 调节基因常位于调控区的上游。
38
启动基因（promotor gene）（启动子）：
有两个位点： （1）RNA聚合酶的结合位点 （2）cAMP-CAP的结合位点。 CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。 只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA 聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才 能开始。 P S DNA O R
酶工程微生物发酵产酶
2、控制阻遏物浓度 微生物酶的生产受到代谢末端产物的阻遏和分解代谢物阻遏的调节。为避免分解代谢物的阻遏作用，可采用难于利用的碳源，或采用分次添加碳源的方法使培养基中的碳源保持在不致于引起分解代谢物阻遏的浓度。
3、添加表面活性剂 在发酵生产中，非离子型的表面活性剂常被用作产酶促进剂，但它的作用机理尚未搞清；可能是由于它的作用改变了细胞的通透性，使更多的酶从细胞内透过细胞膜泄漏出来，从而打破了胞内酶合成的反馈平衡，提高了酶的产量。此外，有些表面活性剂对酶分子有一定的稳定作用，可以提高酶的活力，例如在霉菌的发酵生产中添加 1%的吐温可使纤维素酶的产量提高几倍到几十倍。
第三节 发酵工艺条件及其控制
保藏细胞 ↓ 细胞活化 ↓ 原生质体←细胞扩大培养→固定化细胞 ↓ ↓ ↓ 固定化原生质体 →发酵 预培养 ↓ 培养基 分离纯化 无菌空气 ↓ 酶
六、提高酶产量的措施 1、添加诱导物 对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加诱导物能使酶的产量显著增加。一般可分为三类： ①酶的作用底物，例如乳糖诱导ß-半乳糖苷酶的生成，青霉素是青霉素酚化酶的诱导物。 ②酶的反应产物，例如纤维素二糖可诱导纤维素酶的产生。 ③酶的底物类似物，例如异丙基-ß-D-硫代半乳糖苷（IPTG）对ß-半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍。其中使用最广泛的诱导物是不参与代谢的底物类似物。
5、高产菌株的选育 目前，优良菌种的获得一般有三条途径：一是从自然界分离筛选；二是用物理或化学方法处理、诱变；三是用基因重组或细胞融合技术。
5、常用的产酶微生物
（1）细菌 大肠杆菌：应用最广泛的产酶菌因为其遗传背景清楚而广泛应用于遗传工程改造微生物的宿主，被改造成表达优良性状的“工程菌”。大肠杆菌可生产多种酶，如，谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、β-半乳糖苷酶、限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶等。 枯草杆菌：用途很广，可用于生产α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、碱性磷酸酶等。 （2）放线菌 链霉菌：； ②作为酶活性基的组成部分或维持酶的活性； ③调节渗透压、pH值、氧化还原电位等； ④作为自养菌的能源。 当盐浓度太高时，对微生物生长有抑制作用，而在较低浓度时却能刺激生长。 在微生物的发酵生产中，应特别注意有些金属离子是酶的组成成分，如钙离子是淀粉酶的成分之一，也是芽孢形成所必需的。
酶工程习题集LLQ
第一章绪论【内容提要】1.重点介绍酶和酶工程的研究简史和发展概况；2.简要回顾酶催化特点、影响酶活性的因素、测定酶活力方法以及酶反应动力学。
【习题】一、名词解释酶工程；转换数；催化周期；比活力；酶活力；酶活国际单位；酶反应动力学异构酶变构酶核酶抗体酶竞争性抑制反竞争性抑制非竞争性抑制酶结合效率酶活力回收率固定化酶的相对酶活力二、填空1．酶是具有功能的生物大分子。
2．酶催化作用的专一性包括和。
3．影响酶催化作用的因素有、、、、、。
4．按照酶分子中起催化作用的主要组分不同可分为和。
5．分子内催化的R酶可分为和。
6．分子间催化的R酶可分为、、、、、。
7．固定化酶的活力测定方法主要有、和。
8．固定化酶的比活力一般用所具有的酶活力单位数来表示。
9．酶的生产方法主要有、和。
三、判断1．核酸类酶的作用底物均为核酸2．核酸类酶仅能作用于其他分子3．核酸类酶可以以DNA为底物4．酶的化学本质是蛋白质五、简答题1. 简述酶的研究简史。
2. 简述酶工程的发展概况。
3. 简要回答酶的催化特点。
4. 简要回答影响酶催化作用的因素。
5. 简要回答米氏方程的意义。
6. 简述酶工程的研究内容及主要任务。
答案：酶的生产与应用的技术过程称为酶工程，其主要内容包括酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定化酶的应用。
7. 举例说明酶活力的测定在酶的研究、生产和应用过程中的重要性。
酶活力是指在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度（一般测初速度）。
酶促反应速度是指单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。
单位：浓度/单位时间（2分）酶的活力单位（U）国际单位（IU单位）：在最适反应条件下，每分钟催化1umol底物转化为产物所需的酶量，称一个国际单位（IU），1 IU = 1umol /min国际单位（Katal, Kat单位）：在在最适反应条件下，每秒钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量，称Kat单位。
1 Kat=60 X 106 IU酶活力的测定方法：分光光度法；荧光法；同位素法；电化学法。
微生物发酵产酶
抗体酶 （abzyme）
是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。
抗体酶制备的理论依据： 1948年， Pauling提出的过渡态理论； 1975年，Kohler和 Milstein发明的单克隆抗体制备技术； 1986年，Lerner和Schultz 分别获得具有催化活性的抗体酶。此 后，不少抗体酶被制备出来。
本章小结
1. 不是所有的微生物都能用于发酵产酶；
2. 微生物生长有4个时期，微生物培养产酶有4种方式，可根据 蛋白质生物合成理论、操纵子理论调节控制；
3. 影响微生物生长的环境因素有：培养基的组成、pH、温度、 溶解氧，精心调节，效益增加；
4. 固定化微生物发酵产酶是在传统方式上的一种新尝试，优点 很多。
一、酶生物合成的模式 二、细胞生长动力学 三、产酶动力学
酶生物合成的模式
细胞生长过程（4个阶段）： 调整期、生长期、平衡期、衰退期。
酶生物合成模式（4种）： P60图2－9 ➢ 同步合成型 ➢ 延续合成型 ➢ 中期合成型 ➢ 滞后合成型 结论：最理想的合成模式是延续合成型。
第五节 固定化微生物细胞发酵产酶 第六节 固定化微生物原生质体发酵产酶
P53
调节pH值的必要性: 培养基的pH值与细胞的生长、繁殖以及 发酵产酶关系密切。
pH值变化的原因：
细胞的生长和代谢产物的积累；
细胞特性；
培养基的组成成分；
P54
发酵工艺条件。
调节pH值常用的的方法：
改变培养基的组分或其比例； 使用缓冲液； 通过流加适宜的酸、碱溶液到培养 基中。
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产生一种阻遏 决定酶的合成
蛋白，由多个 是否开始，有
亚基组成。 两个位点：一
酶工程--酶的微生物发酵生产 ppt课件
酶发酵生产的一般工艺流程图
保藏菌种
试管斜面培养（活化）
摇瓶扩大培养
种子罐培养 培养基 发酵罐
分离纯化 酶
无菌空气
二、酶生产菌种 （一）产酶菌种的要求
（1）产酶量高； （2）繁殖快，发酵周期短；
（3）产酶稳定性好，不易退化，不易被感染；
（4）能够利用廉价原料，容易培养和管理； （5）安全性可靠，非致病菌。
液体培养基，经灭菌、冷却后，接入产酶细胞，在一定条件 下发酵。
2、固体培养发酵
培养基以麸皮、米糠等为主要原料，经灭菌后，接入产酶菌 株，在一定条件下发酵。
3、固定化细胞发酵（70年代后期发展）
将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。
4、固定化原生质体发酵（80年代中期发展）
原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞。
酶合成的基因调控类型：诱导和阻遏
1、酶合成的诱导作用
加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为 诱导作用。 诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物。 例：乳糖诱导ß-半乳糖苷酶的合成 淀粉诱导a-淀粉酶的合成
2、酶合成的阻遏 （1）终产物阻遏
指酶催化反应的产物或代谢途 径的末端产物使该酶的生物合成受 到阻遏的现象。
二、应用微生物来开发酶的优点 1、微生物种类多，酶种丰富； 2、微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶； 3、微生物培养基来源广泛，价格便宜； 4、可采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程； 5、可利用以基因工程为主的近代分子生物学技术选 育菌种，增加酶的产率和开发新酶种。
三、酶发酵生产的类型 1、液体深层发酵：
第二节 酶生物合成的基本理论
一、酶生物合成的过程
DNA
转录
RNA
酶工程 1~10章题目及答案
第一章绪论试题精选一、名词解释1、酶2、酶工程3、核酸类酶4、蛋白类酶5、酶的生产6、酶的改性7、酶的应用8、酶的专一性9、酶的转换数二、填空题1、根据分子中起催化作用的主要组分的不同，酶可以分为_蛋白类酶_和核酸类酶_两大类。
2、核酸类酶分子中起催化作用的主要组分是_核糖核酸，蛋白类酶分子中起催化作用的主要组分是_蛋白质_。
3、进行分子内催化作用的核酸类酶可以分为_自我剪切酶_，_自我剪接酶_。
4、酶活力是_酶量_的量度指标，酶的比活力是_酶纯度_的量度指标，酶的转换数的主要组分是_酶催化效率_的度量指标。
5、非竞争性抑制的特点是最大反应速度Vm_减小_，米氏常数Km__不变_。
三、选择题1、酶工程是（C）的技术过程。
A、利用酶的催化作用将底物转化为产物B、通过发酵生产和分离纯化获得所需酶C、酶的生产与应用D、酶在工业上大规模应用2、核酸类酶是（D）。
A、催化RNA进行水解反应的一类酶B、催化RNA进行剪接反应的一类酶C、由RNA组成的一类酶D、分子中起催化作用的主要组分为RNA的一类酶3、RNA剪切酶是（B）。
A、催化其他RNA分子进行反应的酶B、催化其他RNA分子进行剪切反应的R酶C、催化本身RNA分子进行剪切反应的R酶D、催化本身RNA分子进行剪接反应的R酶4、酶的改性是指通过各种方法（A）的技术过程。
A、改进酶的催化特性B、改变酶的催化特性C、提高酶的催化效率D、提高酶的稳定性5、酶的转换数是指（C）。
A、酶催化底物转化成产物的数量B、每个酶分子催化底物转化为产物的分子数C、每个酶分子每分钟催化底物转化为产物的分子数D、每摩尔酶催化底物转化为产物的摩尔数四、判断题（V）1、相同的酶在不同的pH条件下进行测定时，酶活力不同。
（V）2、竞争性抑制的特点是最大反应速度Vm不变，米氏常数Km 增大。
（X）3、催化两个化合物缩成一个化合物的酶称为合成酶。
（X ）4、RNA剪切酶是催化RNA分子进行剪切反应的核酸类酶。
《酶工程》课件-微生物发酵产酶
05
微生物发酵产酶存在问题与挑战
产量问题
微生物发酵产酶产量低
由于微生物发酵过程中受到多种因素 的影响，如营养物质的供应、发酵条 件、微生物菌种等，导致酶的产量较 低。
发酵周期长
微生物发酵产酶通常需要较长的发酵 周期，这增加了生产成本和时间成本。
稳定性问题
酶稳定性差
许多酶在发酵过程中容易受到温度、pH值、金属离子等因素的影响，导致酶的稳定性降低。
04
微生物发酵产酶应用实例
工业应用
洗涤剂制造
微生物发酵产生的酶可用于制造 洗涤剂，如蛋白酶用于去除蛋白 质污渍，淀粉酶用于去除淀粉污
渍。
纺织工业
利用微生物发酵产生的酶处理纺织 品，可以改善其质地、手感和外观， 如纤维素酶用于棉织物的生物抛光。
造纸工业
通过微生物发酵产酶技术，可以改 进造纸工艺，提高纸张质量和降低 环境污染，如木聚糖酶用于纸浆漂 白。
过程优化与控制
通过人工智能技术，对微生物发酵产酶过程进行建模和优化，提高 目标酶的产量和质量。
个性化定制酶
结合人工智能和基因工程技术，实现个性化定制酶的合成，满足不 同领域的需求。
THANKS
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《酶工程》课件-微生物发酵 产酶
• 微生物发酵产酶概述 • 微生物发酵产酶原理与过程 • 微生物发酵产酶技术与方法
• 微生物发酵产酶应用实例 • 微生物发酵产酶存在问题与挑战 • 未来发展趋势与展望
01
微生物发酵产酶概述
酶工程简介
酶工程定义
酶工程是生物工程的重要组成部分，是利用酶或者微生物细胞、动植物细胞、 细胞器等具有的生物催化功能，借助工程手段来生产有用物质、设计改造酶或 者生产细胞、器官乃至整个生物体的一门科学技术。
酶工程_02-微生物发酵产酶
一般是酶催化反应的产物或
B. 有阻遏物 … R P O S1 S2 …
代谢途径的末端产物
阻遏物 +
阻遏物
阻遏蛋白 O基因
Enzyme Engineering
酶生物合成的模式（重点）
微生物细胞生长曲线（四阶段）
延迟期（调整期） 生长期（对数生长期） 平衡期 衰退期
酶是蛋白质 ——
微生物发酵产酶
如何获得蛋白？—— 蛋白生物合成
从基因到蛋白质：遗传信息的传递 ——
复制
中心法则
Active Enzyme
DNA
转录 逆转录
RNA
翻译 ？
Protein
折叠
要生物合成一个酶，首先应知道这个酶对应的基因 生成的多肽链必须经过正确的加工修饰，并正确折叠，
才能生成有活性的酶
微生物发酵产酶
Cell amount
酶的生物合成模式（四类）
—— 根据酶产生与细胞生长的关系
同步合成型 延续合成型 中期合成型 滞后合成型
0
A
B Time
C
D
Enzyme Engineering
酶生物合成的模式
酶生物合成的四种模式
酶生物合成的调节
微生物发酵产酶
—— 转录水平
调节模式 1：分解代谢物阻遏作用
某些物质（容易利用的碳源）经过分解代谢产生的物质阻遏了某
些诱导酶生物合成的现象
连锁效应
实质 —— 解决 ——
cAMP 通过启动基因调控酶的合成 添加 cAMP，控制易用碳源的用量
Enzyme Engineering
操纵子 ——
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密码与反密码的碱基配对
给位 (P位) 大亚基
5’
蛋 苏
UGU AUG ACA GUU
受位 (A位)
小亚基
3’
不同细胞核糖体的组成
原核生物 核蛋 白体 S rRNA 蛋白 质 70S 小亚基 30S 大亚基 50S 核蛋 白体 80S 真核生物 小亚基 40S 大亚基 60S
16SrRNA rpS 21种
(二) 酶合成调节的类型
1.诱导 (induction)
组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似
物而临时合成的一类酶。
2.阻遏 (repression)
分解代谢物阻遏(catabolite repression) 反馈阻遏(feedback repression)
（三）酶合成的调节机制 1. 酶合成的诱导 加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。 酶合成诱导的现象： 已知分解利用乳糖的酶有： -半乳糖苷酶； 透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。 实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无 上述三种酶合成； （2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种 酶合成； 表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。
mRNA
小亚基
AUG ACA 5’ 3’
蛋氨酰tRNA
给位 受位
GTP
蛋
大亚基
UAC AUG ACA 5’ 3’GDP+Pi
蛋
UAC AUG ACA 5’ 3’
肽链合成的起始阶段
肽链合成的延伸阶段
1.进位:氨基酰-tRNA进入受位; 2.转肽:形成肽键,在转肽酶作用下,给位与
受位结合;
3.移位:核蛋白体向3’端移动一个密码子的
3
3
RNA链的延伸图解
模板链（反义链） 有义链 复链 解链
3´
RNA-DNA杂交螺旋
新生RNA 聚合酶的移动方向 5´
延长部位
启动子：在DNA分子上，RNA聚合酶识别和结合的 核苷酸序列，即转录作用起始的部位。 终止子：DNA上的一段核苷酸序列，给RNA聚合酶 提供终止转录的信号，也称终止序列。 操纵子：转录的功能单位。 （调控系统和结构基因的综合）。
一序列为链的切断和poly(A)化提供了某些终
止信号。
（二）蛋白质的生物合成--翻译(translation)
定义 以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖 体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合 成多肽链的过程。
酪
5’
酪氨酰- tRNA
5’
AUG GUU UAC ACA
反密码
3’ mRNA
1、起始阶段 2、延伸阶段 3、终止阶段
肽链合成的起始阶段
1.mRNA与小亚基结合：形成30S-mRNA-IF3复合物
2.AUG与蛋氨酰-tRNA结合：
30S-mRNA-IF3
fMet-tRNA-IF2-GTP
IF1
30S起始复合物
fMet-tRNA正好位于mRNA的起始密码子上（AUG）。
3.大小亚基结合
（2）转录启动区：
P1
rDNA
P2
tDNA
P3
mDNA
DNA
RNApoLI
RNApoLIII
RNApoLII mRNA
rRNA
tRNA
aa
3′
5′
mRNA N protein
（3）转录终止子： 对真核生物转录的终止子信号和终止过程了解 甚少。但在高等真核生物的细胞中，mRNA在靠
近3′端区有一段非常保守的序列 AAUAAA，这
代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上
进行的。
意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物
合成的原料和能量。
（一）基因调控理论
Jacob and Monod的操纵子学说（operon theory）
操纵子——基因表达的协同单位
结构基因（编码蛋白质, structural gene, S）
操纵子
控制部位
操纵基因（operator gene, O）
β' α
σ
核心酶（core enzyme）
σ
α α
β' α β
β
RNA合成过程
起始 双链DNA 局部解开 磷酸二酯 键形成
启动子（ RNA聚合酶 promotor)
终止子 (terminator)
55
离开
延长阶段 5 解链区到达 基因终点 5 终止阶段 5 RNA 3 5 3
第二章
微生物发酵产酶
重点： 微生物细胞中酶生物合成的调节，酶生物
合成的模式，酶发酵生产的工艺条件及其
控制，提高酶产率的措施，固定化微生物
发酵产酶。
微生物发酵产酶
是指在人工控制的条件下，有目的地利用微 生物培养来生产所需的酶，其技术包括培养基 和发酵方式的选择，以及发酵条件的控制管理 等方面的内容。
固定化酶的优缺点 多次使用 可以连续反应 纯化简单 提高产物质量 应用范围广
优点
固定化原生质体的优点 属于胞内产物的胞内酶等分泌到胞外
稳定性较好，可以连续或重复使用较长时间
第一节 酶生物合成的基本理论
提取分离法 酶的生产方法 生物合成法 微生物细胞发酵产酶 植物细胞发酵产酶
化学合成法
动物细胞发酵产酶
大分子而释放到细胞外的。
2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用 的酶，这些酶在细胞内常与颗粒体结合并有 着一定的分布。 如线粒体上分布着三羧酸循环酶系和氧化 磷酸化酶系，而蛋白质合成的酶系则分布在 内质网的核糖体上。
酶的发酵生产方式
①固体培养发酵:把菌种接入固体培养基中,
保温数天,用水或缓冲液浸泡培养基,将酶抽
蛋白质的合成过程
（大肠杆菌）
氨基酸的活化 肽链合成的起始 肽链的延伸 肽链合成的终止与释放
氨基酸的活化与转运
反应式：
AA
+ tRNA
+ ATP
氨酰-tRNA合成酶
氨酰-tRNA+AMP+PPi
对于E.coli而言，肽链合成时的第一 个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMet）。
在核糖体上合成多肽（三阶段）
提,测定酶活力,这种方法主要适用于霉菌.
适合于传统发酵工艺及乡镇企业用来生产比较 简单的产品。
②液体深层发酵:采用液体培养基,臵于生物
反应器中，经过灭菌、冷却后，接种产酶细 胞，在一定条件下，进行发酵，生产得到所 需的酶.
适合于大规模工业化生产。
液体深层发酵优点 ①液体悬浮状态是很多微生物的最适生长条件 ②在液体中菌体、营养物、产物易于扩散，便于控制 ③液体输送方便，易于机械化操作 ④占地面积小，生产效率高，易进行自动化控制
启动子（promotor gene, P）
调节基因(regulator gene)：
可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) ，
通过与效应物(effector) （包括诱导物或辅阻遏物）
的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基
因的结合力。
调节基因常位于调控区的上游。
基因操纵子调节系统示意图
ORF
转录中止区 T AA 、 TG A 、 T AG
结构基因的组成
（4）转录终止子和终止因子 转录终止子：一个基因或一个操纵子3′端，提供转录停止信号 的DNA核苷酸序列。 终止因子：协助mRNA聚合酶识别终止信号的辅助因子的蛋白。
A. -independent
真核生物基因组成
（1）基因区：
一、酶的生物合成
遗传信息传递的中心法则
复制
DNA
转录 逆转录 RNA 复制 翻译 蛋白质
（一）RNA的生物合成--转录(transcription)
定义
以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在
RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分
子的过程。
转录模板
模板链（template strand） 反意义链(antisense strand)
反意义链
RNA聚合酶
3’
RNA 5’
PPi GTP
UTP ATP UTP CTP
RNA在DNA模板上的生物合成
RNA的转录过程(三步)
1.起始 2.延长 3.终止
原核生物的RNA聚合酶(DDRP) E. coli的RNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体 （ 2 ）
起始因子
全酶（holoenzyme）
CRP-cAMP 复合物
CRP+cAMP
cAMP-CRP复合物的作用示意图
操纵基因（Operater gene）:
位于启动基因和结构基因之间的一段碱 基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构 蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。
结构基因（Structural gene）:
决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自 的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA， 再翻译为蛋白质。
5S-rRNA 23S-rRNA rpL 36种
18SrRNA rpS 33种
28S-rRNA 5S-rRNA 5.8S-rRNA rpL 49种
核 蛋 白 体 的 组 成
大肠杆菌核糖体三维结构模型
小亚基貌似一个动物胚胎，由头部、基部和平台组成，平 台与头部之间有一个裂隙；大亚基很像一个沙发，有一个柄、 一个中央凸出部和一个脊； 二者组装成核糖体时，小亚基头部与大亚基凸出部之间形 成一个隧道，在蛋白质合成中mRNA很可能从这里通过。
⑤产品易于提取和精制等
③固定化微生物细胞发酵和固定化微生物原生质体发酵 前者是20世纪70年代后期，在固定化酶的基础上发展起