RNAi技术及其应用131页PPT
RNAi 技术原理精品课件(二)
RNAi 技术原理精品课件(二)
- RNAi 技术原理精品课件
1. 什么是RNAi技术？
RNAi技术是指利用RNA干扰分子介导的基因沉默来实现基因功能研究
和治疗的一种技术。
RNA干扰分子主要是通过靶向RNA降解的方式来实现RNAi效应。
2. RNAi技术的原理
RNAi技术的原理是利用RNA干扰分子靶向RNA的特点，将RNA干扰分
子导入细胞内，与靶向RNA结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)，
然后通过RISC降解靶向RNA，从而实现基因沉默。
3. RNAi技术的应用
RNAi技术在基因功能研究和治疗方面有着广泛的应用。
在基因功能研
究方面，RNAi技术可以用于筛选基因、验证基因功能等。
在治疗方面，RNAi技术可以用于治疗一些遗传性疾病、肿瘤等。
4. RNAi技术的优点
RNAi技术具有高效、选择性、可靠性等优点。
相比其他基因沉默技术，RNAi技术更加高效，能够实现基因沉默的同时不影响其他基因的表达。
5. RNAi技术的局限性
RNAi技术的局限性主要表现在靶向RNA的选择和RNA干扰分子的导入等方面。
目前，RNAi技术在临床应用中还存在一些挑战，需要进一步完善。
6. RNAi技术的发展趋势
随着RNAi技术的不断发展，越来越多的研究者开始关注RNAi技术在基因编辑、基因治疗等方面的应用。
未来，RNAi技术有望成为一种重要的基因治疗手段，为人类健康事业做出更大的贡献。
《RNAi技术原理》课件
RNAi技术在基因功能研究中的应用
基因功能研究
RNAi技术可以帮助科学家研究基因的功能和调控机制，揭示细胞过程和生物系统的运作。
RNAi筛选技术
利用RNAi技术，可以进行高通量筛选，快速鉴定和验证潜在治疗靶点，加速药物发现的进 程。
药物治疗副作用减轻
利用RNAi技术可以精确地抑制药 物治疗中的副作用基因，提高治 疗效果，减轻患者的不良反应。
RNAi技术的局限性和未来的发展方向
1 off-target效应问题
RNAi技术存在着非特异性的副作用，需要进一步解决off-target效应问题，提高其精确性 和可靠性。
2 载体选择和优化
选择合适的载体并优化传递效率是RNAi技术在应用中需要关注的重要问题，以提升治疗 效果。
3 RNAi技术与CRISPR技术联合应用的前景
RNAi技术与CRISPR技术的联合应用有望进一步拓展其应用范围，为基因疾病治疗和基 因编辑提供更多可能性。
RNAi技术在药物靶点发现中的应用
通过RNAi技术，可以筛选和验证抑制剂对特定基因的影响，为药物研发提供新的靶点。
RNAi技术在生物治疗中的应用
癌症治疗
借助RNAi技术，可以靶向抑制肿 瘤相关基因，实现个体化的癌症 治疗，为患者提供更精确的治疗 方案。
病毒感染治疗
RNAi技术可用于抑制病毒复制和 感染，为病毒性疾病的治疗提供 新的思路和方法。
《RNAi技术原理》PPT 课件
欢迎来到《RNAi技术原理》PPT课件。这是一门关于RNA干扰技术的课程， 通过基因沉默的原理，实现基因功能研究和生物治疗。让我们开始探索吧！
《RNAi技术及其应用》课件
发展前景
RNAi技术的进一步发展将促 进基础生物学和应用系统生 物学等领域的快速发展。
结论
1 巨大潜力的技术
RNAi技术具有广阔的应用前景，对生物医学、基因工程、农业和工业等领域都具有重要 意义。
2 推动生物学发展
RNAi技术的发展将推动基础生物学和应用系统生物学的快速进步，为未来的研究提供强 大工具。
2 缺点
RNAi技术在操作过程中存在一定的技术门槛，且由于siRNA的不稳定性，其应用仍面临 一定挑战。
RNAi技术的未来发展
技术发展趋势
RNAi技术将进一步完善，新 的技术和工具的发展将推动 其在基因研究和疾病治疗领 域的应用。
局限性和突破口
克服RNAi技术的局限性，如 siRNA的降解和靶向性，将 是未来研究的重点和突破口。
RNAi的历史和发展
RNAi于20世纪末被发现， 随后广泛应用于基因功能 研究及药物研发领域，并 获得了诺贝尔奖的认可。
RNAi的原理及其作用
通过介导RNA降解或抑制 转录过程，RNAi技术可以 有效地实现基因的特定沉 默，从而控制目标基因的 表达。
RNAi技术的应用
基因功能研究
RNAi技术被广泛运用于研究基 因的功能和调控机制，帮助科 学家揭示生物体内复杂的基因 网络。
《RNAi技术及其应用》 PPT课件
欢迎来到《RNAi技术及其应用》PPT课件，今天我将向大家介绍RNAi技术的 原理、应用以及未来发展。让我们一起探索这项有着广阔应用前景的技术。
RNAi技术简介
什么是RNAi？
RNA干扰(RNA interference)是一种基因沉 默的现象，通过退化目标 基因的RNA分子，从而抑 制特定基因的表达。
RNAi技术专题讲座PPT
或是将短发夹结构RNA(shRNAs)的DNA表达载体转入 细胞，表达产生shRNA，经过Dicer切割后得到 siRNA(线路3，黄色)
最后siRNAs和其他元件组合成为RNA诱导的沉默复合 物RISCs，在siRNA指引下识别对应的mRNA序列并降解 mRNA，从而使特定基因表达沉默
达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的 dsRNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量） 就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的 方式进行的；
❖④RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限， 在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至 整个有机体以及可遗传等特点；
❖⑤dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也 在细胞内被Dicer酶切割为21 bp左右的siRNA，并 由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的 dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰， 而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡 ；
RNAi技术机制路线图
siRNA诱导的基因沉默
病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随 机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行 转录时，常产生一些dsRNA。 宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应， 作用机制 其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具 有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp）， 即siRNA。 siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链 和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包 括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导 的沉默复合物（RNA-induced silencing complex， RISC)。
RNAi技术
RNAi技术1. 引言RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）技术是一种基因沉默技术，通过利用小分子RNA分子调节基因的表达，从而实现对目标基因沉默的目的。
RNAi技术的出现，彻底改变了分子生物学的研究方法，为研究基因功能以及治疗基因疾病提供了新的手段和途径。
2. RNAi技术的原理RNAi技术基于RNA干扰生物过程中产生的一种自我保护机制，即小分子RNA分子干扰RNA的翻译过程。
在这个过程中，RNAi分子通过与RNA互补配对，形成RNA-RNA复合物，这种复合物在RNA酶的作用下被剪切成更小的RNA分子。
这些小RNA分子可以继续识别新的RNA，并在细胞中导致基因沉默（图1）。
图1 RNAi技术的原理示意图3. RNAi技术的应用3.1 RNAi技术在基因功能研究中的应用RNAi技术被广泛应用于分子生物学和细胞生物学的研究中。
通过设计和构建与目标RNA互补的RNAi分子，可以实现对该基因的瞬时或持续沉默。
这种方法可以用来研究基因在生物学过程中的功能以及相互作用，同时也可以用来筛选或验证药物靶标。
3.2 RNAi技术在疾病治疗中的应用由于RNAi技术可以实现对单一基因的沉默，因此它成为治疗基因疾病的一种有效手段。
通过将RNAi分子直接引入到体内，可以实现对特定疾病相关基因的沉默，从而治疗疾病（图2）。
图2 RNAi技术在疾病治疗中的应用示意图4. RNAi技术的优缺点4.1 优点（1）靶向性好：RNAi技术可以实现对特定基因的沉默，从而精确地调控基因表达。
（2）效率高：RNAi技术可以快速地实现基因沉默，因此在基因研究和药物研发中得到了广泛应用。
（3）安全性高：RNAi技术只对特定基因的表达产生影响，不会对细胞或机体整体产生不利影响。
4.2 缺点（1）技术复杂：RNAi技术需要专业知识和技术，因此需要专业技术人员操作。
（2）RNAi分子稳定性低：RNAi分子容易被降解，因此在RNAi技术的应用中需要结合载体和转染技术来增加RNAi分子的稳定性和转染效率。
RNAi 技术原理精品课件(一)
RNAi 技术原理精品课件(一)RNAi技术在生物学研究和生物技术开发中得到了广泛的应用。
RNAi 即RNA干扰技术，是一种利用 RNA分子负向调控基因表达的技术。
RNAi技术原理的精品课件是了解这种技术的好方法。
一、RNAi技术的原理1.RNA分子的作用RNAi技术是利用RNA分子负向调控特定基因表达的技术。
在这种技术中，RNA分子作为介导体，寻找并识别目标基因的RNA分子，并在这些基因抑制的过程中发挥作用。
2. miRNA和siRNAmiRNA和siRNA是RNA分子的两种类型。
miRNA可以抵制特定基因的表达，而siRNA则可以在特定基因的表达中发挥更为强有力的抑制作用。
3. RNAi调控基因表达的具体过程RNAi调控基因表达的过程可以分为三个阶段。
选定目标RNA ➞切割RNA ➞去除RNA具体而言，首先需要确定RNAi技术的目标RNAs，然后在其上加入特定的RNA分子，从而切割RNA并逐渐去除RNA。
这种方式在自然界中一直都存在，但是现代科学家已经能够利用这种方式来控制特定基因的表达。
二、RNAi技术的应用范围1. 解析基因表达RNAi技术在分子生物学的研究上，广泛应用于解析基因表达、研究相关的基因调控机制等方面。
通过在模式生物中应用RNAi技术，科学家们可以从生物中去除同时快速地反应基因，得出其在生物的生长发育中的作用，进而解析基因表达的机制。
2. 治疗遗传病RNAi技术还被应用于治疗人类遗传病。
例如Risdiplam是一种利用RNAi技术开发的药物，可以治疗小儿肌肉萎缩症。
通过利用RNAi技术研究治疗遗传病的原理，研究人员可以找到更多的解决方法，可以帮助医生和患者治疗多种遗传病。
三、RNAi技术的优势1. 解析基因表达更加精细RNAi技术可以帮助研究人员精细地解析基因表达的具体机制，找到对生物生长发育起重要作用的基因，并有助于进行神经生物学等相关研究。
2. 更快地识别目标基因RNAi技术可以帮助研究人员较快地识别目标基因并加以调控，这也为基因遗传规律的研究带来了更大的便利。
RNAi技术及其应用
RNAI技术及其应用提要：RNA干扰(RNA interference ,RNAi) 现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。
将与靶基因的转录产物mRNA 存在同源互补序列的双链RNA(double strand RNA ,dsRNA) 导入细胞后,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失,这一过程属于转录后基因沉默机制( posttranscriptional gene siliencing , PTGS) 范畴。
RNAi 广泛存在于生物界,从低等原核生物,到植物,真菌,无脊椎动物,甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象,只是机制也更为复杂。
RNA干涉(RNAi)是近年发展起来的一种阻抑基因表达的新方法，该技术通过双链RNA的介导，可以特异性地阻断或降低相应基因的表达。
在肿瘤研究中，通过RNAi技术可以选择性地抑制人类肿瘤相关基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的生长。
该技术的应用为癌症的基因治疗提供了新的方法。
癌基因的激活认为是肿瘤发生的根本原因之一，各种癌基因都可以成为肿瘤基因治疗的靶点。
利用基因家族中多个基因具有同一段同源性很高的保守序列这一特性,针对这一区段序列设计相应的siRNA，通过体外合成或构建在体内表达siRNA的载体的方法转入细胞中，可以特异性的封闭这些基因的转录产物而不影响其他基因的表达。
作用机制：RNAi 的作用机制.RNAi 的第一步是,dsRNA（双链RNA）在内切核酸酶(一种具有RNase Ⅲ样活性的核酸酶，称为Dicer.) 作用下加工裂解形成21～25 nt （核苷酸）的由正义和反义序列组成的干扰性小dsRNA ,即siRNA。
果蝇中RNase III 样核酸酶Dicer 含有解旋酶(helicase) 活性以及dsRNA 结合域和PAZ 结构域. 已发现在哺乳动物中也存在Dicer 同类物.近年来研究发现,干扰性小RNA(siRNA) 是RNA 干扰作用(RNAi) 赖以发生的重要中间效应分子. siRNA 是一类特殊双链RNA(dsRNA) 分子,具有特征性结构,即siRNA 的序列与所作用的靶mRNA 序列具有同源性; siRNA 两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基. 此外,每条单链的3′端均有2～3 个突出的非配对的碱基。
《RNAi作用机制》课件
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种通过RNA分子自身调控生命进程的 基因调控技术。
一、RNAi的定义
RNAi是通过RNA分子自身发挥基因调控作用的技术。它通过siRNA或miRNA切 割靶基因mRNA，实现基因表达的抑制。
二、RNAi的发现历程
1
Andrew Fire和Craig C. Mello
癌症治疗
RNAi技术在癌症治疗方面有潜力，为开发新的治疗方法提供了可能性。
心血管疾病治疗
RNAi技术在心血管疾病治疗方面也有广阔的应用前景。
未来发展
RNAi作为一种新的基因治疗方法，具有潜在的应用前景。
五、RNAi的未来发展
RNAi技术在细胞生物学Байду номын сангаас分子医学等领域应用广泛。未来的发展方向包括 RNAi合成技术的改进和治疗效果的提高。
结束语
RNAi技术在基因治疗领域展现出活力与广阔前景，预示着这一技术将不断发 展，走得更稳、更远。
2
他们发现了RNAi现象，为RNA干扰技术的 发展奠定了基础。
发现Dicer酶
Dicer酶的发现揭示了细胞内剪切双链RNA 为siRNA的能力。
三、RNAi的作用机制
RNAi通过siRNA或miRNA切割靶基因mRNA，达到抑制基因表达的目的。miRNA 的合成过程是其中的重要一环。
四、RNAi在基因治疗中的应用
rnai技术及其应用
rnai技术及其应用一、RNai技术简介RNA干扰（RNAi）是一种广泛存在于真核生物中的基因沉默机制。
通过特定的siRNA或miRNA靶向mRNA，使其降解或翻译受到抑制，从而达到基因沉默的效果。
这项技术具有高效、特异性强、操作简单等优点，近年来被广泛应用于生物学研究和临床治疗领域。
二、RNai技术在基础生物学研究中的应用1. 基因功能研究：通过靶向特定基因进行干扰，观察其对细胞或个体的影响，推断该基因在生物体内所扮演的角色。
2. 基因调控网络分析：利用RNAi技术对关键基因进行干扰，进而分析其对整个调控网络的影响，揭示调控网络中各个组成部分之间相互作用的规律。
3. 药物筛选：利用RNAi技术对大量候选药物进行筛选，鉴定出具有治疗潜力的药物，并为新药开发提供理论依据。
三、RNai技术在临床治疗中的应用1. 肿瘤治疗：RNAi技术可以靶向肿瘤细胞中的癌基因进行干扰，抑制其生长和扩散，从而达到治疗肿瘤的目的。
2. 病毒感染治疗：利用RNAi技术靶向病毒基因进行干扰，阻断其复制和传播，从而达到治疗感染性疾病的目的。
3. 遗传性疾病治疗：RNAi技术可以靶向患者体内异常表达或突变的基因进行干扰，纠正其表达水平或功能异常，从而达到治疗遗传性疾病的目的。
四、RNai技术在农业领域中的应用1. 作物抗逆性改良：利用RNAi技术对作物中与逆境响应相关的基因进行干扰，提高其抵抗逆境能力。
2. 生物防治：利用RNAi技术靶向害虫或致病微生物中关键基因进行干扰，实现对害虫或致病微生物的有效控制。
3. 品质改良：利用RNAi技术靶向作物中与品质相关的基因进行干扰，提高其营养价值和经济价值。
五、RNai技术的发展趋势1. 基于CRISPR-Cas9技术的RNAi：将RNAi技术与CRISPR-Cas9技术相结合，可以实现更精准、更高效的基因编辑和调控。
2. 微型RNA（miRNA）在RNAi中的应用：miRNA是一种短链非编码RNA，具有广泛的生物学功能。
RNAi技术
目录⏹⏹原理⏹应用前景RNAiRNAi技术⏹⏹原理RNAi技术的应用前景⏹⏹基因功能分析⏹⏹临床应用⏹⏹⏹治疗病毒感染应蛋白质的翻译。
使用siRNA或dsR-NA治疗肿瘤RNAi技术的展望⏹⏹参考文献⏹ 1 马琳琳，傅松滨，李璞.RNA干涉.因外医学遗传学分册，2003;26（4）∶189～194⏹ 2 Sui G，Soohoo c，Affer el B，et al.A DNA vector-based RNAi technologyto suppress gene expression in mammalian cells.Proc Natl Acad Sci USA，2002;99（8）∶5515～5520⏹ 3 韩蓓，王秀敏，顾学范.双链RNA干涉技术在不同生物中应用的研究进展.遗传，2002;24（2）∶200～202⏹ 4 Bosher JM，Labouesse M.RNA interference:genetic wand and geneticwatchdog.Nat cell Biol，2000;2（2）∶E31～36⏹ 5 Waterhouse PM，Wang MB，Lough T.Gene silencing as an adaptivedefence against virus.Nature，2001;411（14）∶834～842⏹ 6 Fraser AG，Kamath RS，Zipperlen，et al.Functional ge-nomic analysis ofC.elegans chromosome I by systematic RNA interference.Nature，2000;408（6810）∶325～330⏹7 Gonczy P，Echeverri C，Ogema K，et al.Functional genom-ic analysis ofcell division in C.elegans using RNAi of genes onchromosomeⅢ.Nature，2000;408（6810）∶331～336⏹8 Maeda I，Kohara Y，Yamamoto M，et rge-scale anal-ysis of genefunction in Caenorhabditis elegans by high-through-put RNAi.Curr Biol，2001;11（3）∶171～176⏹9 Lindbo JA，Dougherty WG.Untranslatable transcripts of the tobacco etchvirus coat protein gene sequence can interfere with tobacco etch virusreplication in transgenic plants and proto-plasts.Virology，1992;189（2）∶725～733⏹10 Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al.Potent and specific geneticinterference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature，1998;391（6669）∶806～811⏹11 Waterhouse PM，Graham MW，Wang MB.Virus resis-tance and genesilencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA.Proc Natl Acad Sci USA，1998;95（23）∶13959～13964⏹12 Montgomery MK，Fire A.Double-stranded RNA as a me-diator insequence-specific genetic silencing and co-suppression.Trends Genet，1998;14（7）∶255～258⏹13 Hamilton AJ，Baulcombe DC.A species of small antisense RNA inposttranscriptional gene silencing in plants.Science，1999;286（5441）∶950～952⏹14 Hammond SM，Bernstein E，Beach D，et al.An RNA-di-rected nucleasemediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells.Nature，2000;404（6775）∶293～296⏹15 Tavernarakis N，Wang SL，Dorovkov M，et al.Heritable and induciblegenetic interference by dsRNA.Nat Genet，2000;24（2）∶180～183张明，邵宁生.RNA阻抑和基因沉默.军事医学科学院院刊，2002;26（1）∶61～65⏹16 Heinonen JE，Smith CI，Nore BF.Silencing of Bruton's tyrosine kinase（Btk）using short interfering RNA duplexes（siRNA）.FEBS Letters，2002;527（1～3）∶274～278⏹17 Lee NS，Dohjima T，Bauer G，et al.Expression of small interfering RNAstargeted against HIV rev transcripts in human cells.Nat Biotechnol，2002;20（5）∶500～505⏹18 Coburn GA，Cullen BR.Potent and specific inhibition of humanimmunodeficiency virus type I replication by RNA inter-ference.J Virol，2002;76（18）∶9225～9231⏹19 Lin SL，Chuong CM，Ying SY.A novel mRNA-cDNA in-terferencephenomenon for silencing bcl-2expression in human LNCap cells.BiochemBiophys Res Commun，2001;281（3）∶639。
RNAi技术及其应用 PPT课件
包含两种主要的组成成分，即决定干扰特异性的 小RNA和发挥抑制作用的Argonaute蛋白。
根据RISC复合物中Argonaute蛋白的天然活性以及 小RNA与
其靶标mRNA之间互补程度的不同，RISC复合物 与靶标mRNA结合后会发挥几种不同的作用，它 可以控制mRNA的稳定性和蛋白质合成、维持基
值得一提的是，这是第一
项使用受体介导递送方式的siRNA临床试验，该 产品被连接有转铁蛋白的环糊精颗粒包裹。这样， 药物就只会被细胞表面表达有转铁蛋白受体的细
胞摄取，而转铁蛋白受体在肿瘤
细胞表面表达量就非常高。
Acuity制药公司与Merck公司旗下的 SirnaTherapeutics公司合作进行的临床药物试验成
内源性siRNA（esiRNA）。 不过，这些小RNA子都有一个共同的特征，那就 是它们都能与Argonaute蛋白相结合，从而发挥它
们的靶向作用。
简述
小RNA分子的形成过程以及RNA沉默的机制 a、能够形成dsRNA结构或者发夹结构的天然转录 产物是形成小RNA分子的前体物质。这些双链结
构的RNA分子经由疗技术，却已经以一种 前所未有的速度迈进了临床试验阶段。下面，我
们将介绍几种已经进入临床试验阶段的人体疾病 RNAi疗法。 第一个被
siRNA治疗指南批准获得临床研究新药 （investigationalnewdrug，IND）资格，并且进入
了临床试验的就是Bevasiranib，它是美国Ac
为两大类：
一是小干扰RNA（siRNA），它是细胞为了应对病
毒感染或者其它人工导入分子而剪切外源性长 dsRNA前体而生成；二是miRNA，它由细胞运用
其自身基因组编码的茎
环结构加工而来。借助高通量测序技术，人们发 现了好几种内源性小RNA，包括最近发现的PIWI 相互作用RNA（PIWI-interactingRNA,piRNA）和
RNAi技术的原理及应用
RNAi技术的原理及应用原理RNAi（RNA interference）技术是一种通过靶向RNA的降解来抑制基因表达的方法。
这种技术基于细胞内的一个自然免疫系统，该系统可以识别和降解异质RNA分子。
RNAi技术可以用于研究基因功能，发现新的药物靶标，并为基因治疗提供了一种有力工具。
RNAi技术的原理可以概括为以下几个步骤：1.siRNA合成：RNAi技术使用小干扰RNA（siRNA）来诱导RNA降解，siRNA在细胞内的一种酶切后生成双链RNA。
2.RISC复合物的形成：双链RNA结合到RNA诱导沉默复合物（RISC）蛋白上，形成siRNA-RISC复合物。
3.靶向RNA的降解：siRNA-RISC复合物通过辨识靶向RNA的互补序列，导致靶向RNA的降解。
应用RNAi技术在许多领域都有广泛的应用。
下面列举了一些主要的应用领域：功能基因组学研究RNAi技术为功能基因组学研究提供了一种有效的方法。
通过利用RNAi技术沉默特定基因的表达，研究人员可以了解该基因对细胞功能和生物过程的影响。
这种方法可以帮助我们理解基因调控网络以及各个基因在细胞和生物体中的作用。
药物研发RNAi技术为药物研发提供了新的途径。
通过使用siRNA来沉默特定基因的表达，研究人员可以发现新的药物靶标，并研发相应的药物。
这种方法具有高度的特异性和选择性，可以减少非特异性的药物作用，提高疗效。
基因治疗RNAi技术在基因治疗中也有潜在的应用。
通过利用siRNA来抑制异常基因的表达，可以治疗某些遗传疾病。
例如，通过沉默表达异常的突变基因，可以减少与遗传性疾病相关的症状，并提高患者的生活质量。
农业改良RNAi技术在农业领域也有重要应用。
通过利用RNAi技术来靶向沉默特定害虫的基因，可以开发出新型的农药和抗虫作物。
这种方法可以减少农药的使用，降低对环境的污染，提高农作物的产量和质量。
病毒治疗RNAi技术还可以被应用于病毒治疗。
通过利用siRNA来沉默病毒基因的表达，可以抑制病毒的复制和传播。
RNAi技术及其在植物中的应用
什么是RNAi？
RNA干扰〔RNAi〕是由双链RNA〔dsRNA〕诱导的转录后基因沉默〔PTGS〕，是真核生物中一种进化上高度保守的生物学机制。在RNAi途径中，dsRNA或发夹结构RNA〔hpRNA〕被Dicer酶加工成一个21-23 nt的小RNA双链体〔siRNA〕。siRNA的一条链被纳入RNA诱导的沉默复合物〔RISC〕中，另一条链保存并引导RISC切割与之序列互补的mRNA〔图1〕。
将体外合成的siRNA转入细胞中，发挥作用假设干时间后裂解细胞，提取细胞RNA或蛋白，用qRT-PCR或Western Blotting方法检测目的基因干扰效率，验证合成的siRNA是否有效，筛选有效siRNA进行后续研究。
3. siRNA的标记
为了更好的检测siRNA的转染效率及对siRNA进行定位，可将合成的siRNA进行标记：
〔3〕G/C含量在30%~52%之间其基因沉默效果较好。
〔4〕siRNA序列中防止连续的单一碱基及反向重复序列。
〔5〕将设计好的siRNA序列在数据库中进行比对，保证siRNA的序列特异性。
2. siRNA的合成和验证
siRNA的合成方法主要包括化学合成法、体外转录法、酶消化法、体内转录法。
〔1〕化学合成法：以枋苷酸单体为原料，利用化学方法合成两条互补的RNA单链，然后退火形成双链RNA。
参考文献：
[1]Qigao Guo, Qing Liu, Neil A. Smith, Guolu Liang,Ming-Bo Wang.RNASilencing in Plants: Mechanisms,Technologies and Applications inHorticultural Crops[J].Current Genomics, 2016, 17(6), 476-482.
rnai技术的原理和应用
RNAi技术的原理和应用一、RNAi技术的原理RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种在生物体内通过特异性降解靶标RNA来抑制基因表达的机制。
RNAi技术利用这种机制，成为研究基因功能、疾病治疗和农作物改良等领域的重要工具。
1. siRNA与miRNARNAi技术主要包含两种类型的RNA：小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA) 和微小RNA (microRNA, miRNA)。
siRNA由外源RNA合成，与目标基因的mRNA序列互补，引导RNA诱导的RNA降解复合体（RISC）将目标mRNA降解。
miRNA则是内源性产生的RNA分子，通过RISC复合体靶向调控某些基因的表达。
2. RNA干扰的机制RNA干扰的关键步骤包括：转录、加工和效应。
在转录过程中，DNA被转录成为RNA前体（pre-mRNA），其中含有外显子和内含子。
RNA加工过程中，RNA干扰的主要分子Dicer将pre-mRNA切割成为短的双链RNA分子（siRNA和miRNA）。
在效应阶段，双链RNA分子导入RISC复合体，其中一个链被剪切并去除，另一个链则被完整保留，它将与目标mRNA互补，导致目标mRNA的降解或抑制翻译。
二、RNAi技术的应用RNAi技术在基因功能研究、药物开发和农作物改良等领域具有广泛应用。
1. 基因功能研究通过使用RNAi技术，可以靶向抑制特定基因的表达，从而研究该基因在生物体内的功能。
通过观察目标基因沉默后的表型变化，可以了解该基因在生物体内的作用。
2. 疾病治疗RNAi技术在疾病治疗方面具有潜力。
通过靶向特定的疾病相关基因，可以抑制目标基因的表达，进而抑制疾病的发展。
例如，将siRNA引入乳腺癌细胞中，可以有效降低乳腺癌相关基因的表达，抑制癌细胞的生长。
3. 药物开发RNAi技术在药物开发中可以用于筛选和验证药物靶点。
通过使用siRNA库，可以快速筛选出对特定疾病相关基因表达具有抑制作用的siRNA序列，从而为药物研发提供候选目标。
RNAi简介演示
转染方法的选择与优化
细胞类型的选择
01
选择适合目标细胞的转染方法。
转染试剂的选择
02
根据细胞类型和实验条件选择适合的转染试剂。
转染条件的优化
03
通过实验摸索，找到最佳的转染条件，如转染浓度、转染时间
等。
qPCR检测基因表达水平
01
02
03
04
总RNA的提取
从转染后的细胞中提取总 RNA。
cDNA的合成
使用复合转染试剂
尝试使用复合转染试剂，通过多种方式的联合作用，提高转染效率 。
基因敲降不完全问题
基因敲降不彻底
RNAi实验中有时会出现基因敲降不彻底的情况，影响实验结果的 可靠性。
筛选合适的siRNA
针对不同的基因，尝试使用不同的siRNA进行敲降，筛选出最有效 的siRNA。
联合使用多种方法
除了使用siRNA进行敲降外，可以尝试联合使用其他RNAi方法， 如shRNA、piRNA等，提高基因敲降的效果。
医学领域
疾病治疗
RNAi技术可用于开发新型药物， 通过沉默致病变异基因或增强表 达有益基因来治疗遗传性疾病、
癌症、病毒感染等。
药物研发
RNAi技术可用于筛选药物作用靶 点，研究药物对特定基因表达的影 响，加速新药研发进程。
体外诊断
RNAi技术可用于检测生物样本中的 特定基因表达水平，为疾病诊断提 供依据，如实时荧光定量PCR等。
转染siRNA
选择适合的转染试剂，将筛选出 的有效siRNA转染到目标细胞中
。
细胞培养
在适宜的条件下培养转染后的细 胞，观察细胞的生长和变化情况
。
检测基因表达水平
1 2
RNA干扰技术和应用
siRNA表达载体 siRNA表达载体
究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续 ——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续 抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。 抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。 病毒载体也可用于siRNA表达 表达， 病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以 直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究， 直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免 由于质粒转染效率低而带来的种种不便, 由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染 效果更加稳定。 效果更加稳定。 持较长时间的基因沉默。 持较长时间的基因沉默。
瞬时表达载体
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特点： 特点：
等报告基因监测转染效率； 可以使用GFP，RFP等报告基因监测转染效率 可以使用GFP，RFP等报告基因监测转染效率； 可以使用抗生素筛选转染和非转染细胞； 可以使用抗生素筛选转染和非转染细胞； 一次制备，可以重复使用； 一次制备，可以重复使用； 实验在DNA水平操作 水平操作， 环境要求相对宽松； 实验在DNA水平操作，对RNAse free 环境要求相对宽松； Vector based shRNA可以通过简单的PCR方法转接到病毒载体上； shRNA可以通过简单的 可以通过简单的PCR方法转接到病毒载体上 方法转接到病毒载体上； 实验在手时间比较长：长链DNA合成中往往会引入错误碱基 合成中往往会引入错误碱基； 实验在手时间比较长：长链DNA合成中往往会引入错误碱基；合成的 单链由于自身可以形成发夹结构，双链退火要求的条件比较苛刻； 单链由于自身可以形成发夹结构，双链退火要求的条件比较苛刻；发 卡结构影响测序结果，导致即便克隆进载体也得不到正确的测序结果。 卡结构影响测序结果，导致即便克隆进载体也得不到正确的测序结果。
RNAi技术的功能及应用
专题讲座中国社区医师 2006年第20期(综合版) (第8卷总第149期)7 RNAi 技术的功能及应用姜海艳1 关伟军2130021长春中医药大学附属医院检验科1130117中国人民解放军63980部队卫生队2摘 要 RNA 干扰(RNA interference,RNAi )是近年来研究生物体基因表达、调控与功能的一项崭新技术,它利用了由小干扰RNA (s mall interfering RNA,si RNA )引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默(silen 2cing )现象,其本质是si RNA 与对应的mR 2NA 特异结合、降解,从而阻止mRNA 的翻译。
我们讨论了RNA i 的发展过程及分子机制和相关的基因,详细地介绍了RNAi 的功能及应用,为人们更多地了解并使用RNAi 技术起引导作用.关键词 RNA 干涉(RNA i ) s RNA mi R 2NA si RNARNAi 技术简介几十年来,RNA 被认为仅仅是从DNA 获取遗传信息,并将信息传递给蛋白质。
但最近研究发现,小RNA (s RNA )发挥着基因调控的作用。
小RNA 能关闭基因的表达,或改变基因表达的水平。
在发育过程中通过关闭或开放基因的表达,小RNA 可能指导着细胞的定向分化。
RNAi 的功能抗病毒功能:RNAi 现象是近年来发现的一种新的调控基因表达的重要方式,但是研究发现,RNAi 是一种非常保守的方式。
所有的生物在长期的进化过程中都面临着病毒等外来生物的入侵,生物体如何使自己的基因组免受外来核酸的入侵呢?研究表明,RNA i 机制在真核细胞中起着相当于人类免疫系统的作用,充当基因的保护者。
生物体能够将外来的细菌、病毒等的核酸的RNA 降解成ds RNA,将外源RNA 特异地降解。
基因调控:在RNA i 发现以前,人们认为基因研究中最重要的对象是DNA 和蛋白质,而RNA 只起到传送DNA 信息的作用,甚至错误认为很多短的RNA 是一些无用的物质。
RNA干扰技术基本原理与应用ppt
RdRp（RNA dependent RNA polymerase）
使异常的RNA转变为dsRNA 参与细胞内dsRNA和siRNA的扩增 siRNA与靶mRNA 的结合可激活RdRp， 形成大量的dsRNA
RNAi的主要过程
效应阶段 RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC） 的形成 RISC的激活：ATP依赖的解双链过程 在siRNA反义链的指导下(靶序列的识别）， RISC特异性切 割、降解靶mRNA，导致基 因表达失活
RNAi的发现和发展历程
1984 年,Jonathan 研究小鼠L 细胞时发现 反义mRNA 会干扰同源基因的表达，机制 不清 1990年 Jorgensen等 矮牵牛颜色加深实 验 “共抑制(co-suppresion)”
RNAi的发现和发展历程
1995年 Su Guo 和Ken Emphues 反义RNA阻断秀丽小杆线虫par-1基因的表达 实 验 首次发现 RNA干扰现象 1998年 Andrew Fire和Craig Mello 发现单链RNA抑制作用较弱，而纯化的dsRNA 可高效、特异地抑制基因的表达 Nature1998； 391: 806-11 正式提出RNA干扰的概念
RNA干扰技术基本原理 与应用
什么是RNA干扰
RNA干扰(RNA interference，RNAi),又称
转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)，是指将特异性 同源双链RNA(dsRNA)导入到细胞内，使 目的基因的不表达或表达水平下降.
/Stu/shilin/rnai.html /sirna.pl /rnai/ /rnaidesigner/ :9331/RNAi/html/rnai. html
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是ssRNA内形成的茎环结构）在Dicer酶的作用 下降解成小RNA；小RNA的双链解开，其中一条 链被优先装载入RNA诱导沉默复合物（RISC）
中；装载了小RNA
的RISC复合物就会在细胞内积极地“搜索”转 录组，探寻潜在的RNA靶分子。被装载入RISC 复合物当中的向导链（guidestrand）--ssRNA随
司（即以前的SR制药公司）合作，主要生
产靶定RTP801基因（又名DDIT4基因，该基因 与黄斑变性疾病的进展有关）这种缺氧诱导基因 的siRNA产品RTP801i-14。RTP801i-14已经被
授权
给英国的Prizer制药公司，进行I/IIA期临床试验。 Quark制药公司也已经获得了IND资格可以进行 另一项临床前试验，他们目前正在为这项实验招
座子的同时还能大量扩增pi
RNA分子，这个过程被称作进一步处理过程，或 者叫ping-pong扩增环路反应，这种反应在包括 小鼠和斑马鱼在内的多个物种体内都广泛存在，
非常保守。在这步反应当中
，PIWI蛋白的剪切活性会不断剪切转座子转录产 物（即piRNA的前体物质）形成piRNA的5端， 但是piRNA的3端是由什么蛋白质负责生成的，
和
内源性siRNA（esiRNA）。 不过，这些小RNA子都有一个共同的特征，那就 是它们都能与Argonaute蛋白相结合，从而发挥
它们的靶向作用。
简述
小RNA分子的形成过程以及RNA沉默的机制 a、能够形成dsRNA结构或者发夹结构的天然转 录产物是形成小RNA分子的前体物质。这些双链
结构的RNA分子经由Dr
现在几乎每天都会有文章对各种小RNA与机体发 育之间关系的进展进行报道。而精明的生物技术 公司也正在以惊人的速度积极地将RNAi的相关知
识运用于药物筛选研究。借助现
今先进的测序技术，人们鉴定出了多种新型小 RNA，而随后，它们的强大功能将会继续吸引我 们研究下去，相信研究结果一定会让我们感到惊
喜。 双链RNA能够以序列特异性
我们现在还不清楚。
siRNA作为一种新兴的治疗技术，却已经以一种 前所未有的速度迈进了临床试验阶段。下面，我 们将介绍几种已经进入临床试验阶段的人体疾病
RNAi疗法。 第一个被
siRNA治疗指南批准获得临床研究新药 （investigationalnewdrug，IND）资格，并且进 入了临床试验的就是Bevasiranib，它是美国Ac
后引导RI
SC复合物当中的核酸内切酶（有时被称作“切 割机”，现在人们知道它是Argonaute蛋白）反 复剪切拥有向导链同源序列的mRNA靶分子。向
导链就是通过这种方式来发
挥特异性的RNAi作用的；
尽管不同生物体内，参与RNAi途径的蛋白和相关 机制各有不同，但是它们的干扰策略却惊人地一
致。在所有被研究过的物种中，RNAi都
的方式导致基因沉默的机制自发现起就对生物学 的发展产生了巨大影响，它揭示了人们以前未曾 注意到的基因表达调控机制。这种机制被称为
RNA干扰（RNAi）或者RNA沉默
（RNAsilencing）。其核心内容是：一些非编码 小RNA分子（smallnon-codingRNA，20~30nt）
进入细胞后与序列互补的信使RNA靶标配
复合体调控过程中起到“减速器（attenuator）” 的作用。
RNAi机制中最引人注目的亮点就是仅由20~30nt 组成的小dsRNA。它们是由RNaseII
I酶（可以是Dicer单独发挥作用，也可以是 Drosha和Dicer共同发挥作用）剪切长RNA得到 的产物。按照小RNA的来源前体的不同，我们可
因组完整性，或产生一系列
特异性的小RNA。随着高通量测序技术的出现以 及生物信息学的不断进步，科研人员得以对小
RNA的起源及其靶向机制开展更深入的研究。他 们发现，在各个不同的物种当中，R
NAi系统获得了不同程度的改进，包括进化出 “内置式的”分子“刻度尺”，用来控制小RNA 的大小和结构，从而挑选出小dsRNA中最合适的
osha或Dicer等RNaseIII处理之后就能得到小 dsRNA分子。如果这些小dsRNA分子之间的配对
情况非常好，如图中左侧所示，那么就会经由
Argonau
te蛋白的酶切活性进行进一步处理，生成小 ssRNA产物。如果像图中右侧所示的那样，小 dsRNA分子之间的配对情况不是非常好，比如出
现了错配或者有环状凸出，那么它
们就不能被Argonaute蛋白酶切处理，只能经由 一种不依赖酶切活性的方式生成最终的小ssRNA 产物。目前，我们对于究竟是哪种蛋白参与其中
来发挥解链活性还不得而
知。生成的小ssRNA分子随后会与Argonaute蛋 白结合，但究竟是哪一条单链分子（正链或负链） 结合到Argonaute蛋白上则取决于它们的热力学
RNA分子随后同样也是与Argo
naute蛋白相结合，发挥抑制靶基因表达的作用。 c、有一类Argonaute蛋白只存在于生殖细胞当中， 它们被称作PIWI亚科蛋白，它们可以与piRNA结
合，
随后形成的复合物能够沉默转座子。单链前体 RNA分子在未知蛋白的作用下经过初步处理过程 形成piRNA。在生殖细胞内，PIWI蛋白在沉默转
200
6年的生理学或医学诺贝尔奖。诺贝尔委员会成 员GoranHansson在该年的颁奖词中说道：
“RNAi为我们了解生命提供了新视角，并为医学 发展提供了新工具。”不过
，RNAi的故事才刚刚开始，许多悬念有待人们逐 个解开。
细胞内表达的长dsRNA或外源性长dsRNA（可以 是由正链转录产物和负链转录产物配对而成的结
病情进一步加重，明显改善了患者的视力，而且 还没有副作用和不良反应。这些成果让我们对玻 璃体内注射siRNA这种治疗方法充满了信心。但
包含两种主要的组成成分，即决定干扰特异性的 小RNA和发挥抑制作用的Argonaute蛋白。
根据RISC复合物中Argonaute蛋白的天然活性以 及小RNA与
其靶标mRNA之间互补程度的不同，RISC复合物 与靶标mRNA结合后会发挥几种不同的作用，它 可以控制mRNA的稳定性和蛋白质合成、维持基
白能够促进DROSHA
将pri-miR-21转化成pre-miR-21。更确切地说， SMAD蛋白家族成员TGF-β和BMP信号转换因子 与RNA解旋酶p68组成的复合物一起被招募至pr
i-miR-21，促进pre-miRNA形成。另外，不均一 核糖核酸RNPA1蛋白
（heterogeneousnuclearRNPA1，hnRNPA1） 这种著名的
因的表达，有效减少
新生血管数量。 还有两家公司也专注于用siRNA治疗黄斑变性疾
病，他们分别是美国的 Merck’sSirnaTherapeutics公司（主要产品是针
对VEGF
受体VEGFR1蛋白的Sirna-027）和Quark制药公 司。他们和伦敦及柏林的SilenceTherapeutics公
结合之后才
会形成并被剪切的。
RISC复合体的活性同样能够被调控。在拟南芥 中，非编码基因IPS1中含有的一段基序能够与 miR-399序列互补，但是它们之间的互补配对过
程
却被该miRNA分子中酶切位点处的一段错配形成 的环状结构给破坏了。这样，IPS1基因的mRNA 产物不仅没能被miR-399降解，反而还大量“扣
募志愿者。这项
实验的药物靶定TP53基因的siRNA。该药通过抑 制p53蛋白的表达能够阻碍细胞凋亡通路，从而
有望避免手术后出现的急性肾衰竭。
与此同时，美国的Calando
制药公司也开始了新药的临床试验项目。他们实 验的新药是用于治疗实体瘤的靶定核糖核苷酸还
原酶RRM2（该酶参与DNA的合成）亚基的 siRNA。值得一提的是，这是第一
该途径被多潜能因子LIN2
8所抑制。LIN28蛋白可以阻止pri-let-7分子在微 处理器复合物中的剪切过程及后续由Dicer蛋白负 责的pre-let-7前体分子的处理过程。不过，人体
同
时存在另一条路径。转化生长因子β（TGF-β） 和生长因子家族中的骨形成蛋白（BMP）都能促 进miR-21这种促癌分子的生成。这是因为这些蛋
前体mRNA分子剪切调控因子也会帮助DROSHA 发挥作用，有效地生成pre-miR-18，这可能是由 hnRNPA1蛋白能够重新折叠发夹结构，或者直
接与pቤተ መጻሕፍቲ ባይዱi-m
iRNA结合，为DROSHA构建出一个酶切位点而 造成的。这也说明在pri-miRNA分子中，某些发 夹结构可能是在pri-miRNA分子与RNA伴侣蛋白
押了”miR-39
9分子。因此，如果IPS1基因大量表达会使得胞 内“积聚”大量miR-399分子的靶标--PHO2基因 mRNA。这种靶标之间的相似性会给RNA调控网
络带来不可预料
的复杂性。我们预测，最近在人体细胞中发现的 大量mRNA样非编码RNA分子（mRNA-likenoncodingRNA）可能会在小RNA-Argonaute蛋白
小RNA分子还可以通过RNA依赖的RNA聚合酶 （RdRP）来合成。有一些天然转录产物（通常 它们都是异常的转录产物）都是这种依赖RdRP
途径合成的小RNA分子的前
体来源物质。因此，缺乏RdRP活性的物种，比 如哺乳动物和黑腹果蝇等物种体内是不会发现这 种小RNA合成机制的。经过这种途径生成的小
以将其分为两大类：
一是小干扰RNA（siRNA），它是细胞为了应对 病毒感染或者其它人工导入分子而剪切外源性长 dsRNA前体而生成；二是miRNA，它由细胞运用
其自身基因组编码的茎
环结构加工而来。借助高通量测序技术，人们发 现了好几种内源性小RNA，包括最近发现的PIWI 相互作用RNA（PIWI-interactingRNA,piRNA）