乙型肝炎基因分型同耐药位点突变的关系研究

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DNA测序线性反向探针杂交法检测HBV P基因耐药突变比较论文

DNA测序与线性反向探针杂交法检测HBV P基因耐药突变的比较【摘要】目的基于多重pcr和反向线性杂交原理，建立hbv基因分型及耐药突变检测的新方法。

方法对深圳地区的hbv进行基因分型，并对其常见耐药突变位点进行快速检测，了解其流行现状和流行规律。

结果在45份标本中dna序列测定法检测到碱基突变73个，其中与 lam相关突变24份（53.33%），与 adv 相关突变3份（6.66%），与ldt相关突变1份（2.22%），与etv相关突变1份（2.22%）；选取21份血清，其中与线性反向探针杂交检测结果一致的突变为85.71%（18/21），氨基酸位点一致为97.39%（224/230）。

结论检测hbv不同基因型与致病性及药物应答的关系，能够为研究hbv的流行病学规律提供新的方法，为hbv感染的治疗提供用药指导，从而也为hbv的感染控制提供新的诊断工具。

【关键词】慢性乙型肝炎；乙肝病毒；核苷/酸类药物；耐药性突变；dna测序；线性反向探针杂交法【中图分类号】r450【文献标识码】a【文章编号】1004-5511（2012）06-0346-02全世界大约有3.5亿乙型肝为病毒（hbv）携带者，每年约有80万人死于hbv 慢性感染所引发的重型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等相关疾病。

乙型肝炎病毒（hbv）可在慢性持续性感染、机体免疫、压力或抗病毒治疗药物作用过程中发生变异［1］。

近年来，临床上开始广泛采用采用核苷/酸类药物治疗乙型肝炎，核苷/酸类药物方拉米夫定(lam)、阿德福韦酯(adv)、替比夫定(ldt)、恩替卡韦(etv)等简便、副作用少、能迅速抑制hbv复制。

但其耐药性问题也日益突出。

本研究采用基于巢式 pcr 的 hbv p 基因序列测定法检测慢性乙型肝炎患者血清 hbv 基因变异情况，并与线性反向探针杂交法检测结果比较，同时对新发现的若干 hbv dna 耐药突变位点进行分析。

现将实验结果报告如下。

结合基因型耐药突变检测与表型耐药分析探索乙肝病毒耐药的新认识

结合基因型耐药突变检测与表型耐药分析探索乙肝病毒耐药的新认识徐东平;刘妍【摘要】核苷(酸)类似物是临床上治疗慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染最常用的药物,但长期应用可引发病毒耐药,导致治疗失败.基因变异检测及表型耐药分析是发现和鉴定HBV耐药的基本方法,前者主要是应用基因测序或线性反向探针杂交等方法,检出已知的病毒耐药相关突变,后者则是在体外细胞水平确定携带有变异基因的HBV毒株对病毒复制力及核苷(酸)类药物敏感性的影响,是鉴定复杂与特殊HBV耐药变异的基本手段.我们通过技术创新,建立了敏感、特异、经济、高效的HBV基因型检测方法,进而建立了可靠的HBV复制力和表型耐药分析方法,广泛应用于临床样本分析,实现了对HBV耐药的早期发现及对新的非典型HBV耐药相关突变株的鉴定. 我们近期在核苷(酸)类似物耐药和应答不佳的患者中检测到多种特殊和复杂HBV耐药相关突变,并结合临床资料,进一步对代表性变异株进行病毒复制力和表型耐药分析,取得了多项重要发现:①从大样本中检出和鉴定了多种多重耐药HBV 变异株,并发现联合用药可协同抑制多重耐药HBV变异株的体外复制；②HBV rtL229替换可作为补偿变异,恢复拉米夫定耐药变异株rtM204I的病毒复制力；③rtM204Q是一种新的拉米夫定耐药相关突变；④r tAl81C+rtL180M+rtM204V与恩替卡韦耐药相关；⑤同一耐药患者血清HBV虽检出耐药变异,但外周血单个核淋巴细胞(PBMCs)中的HBV cccDNA仍以原始野生株为优势种群,提示PBMCs为体内HBV野生株的“存储库”,参与HBV肝外感染 . 上述发现对深入揭示HBV耐药变异的临床特点和发生机制,辅助临床合理制定并优化抗病毒治疗方案具有重要作用.%This work was supported by the National Twelfth Five-Year Special Grand Project for Infectious Diseases(2012ZX10004S03), the National Natural Science Foundation (81171617), and the Twelfth Five-Year Clinical High-tech Project of Military Hospital (2010gxjs009)rn[Abstract] Nucleoside and nucleotide analogs are most commonly-used agents in the treatment of hepatitis B virus (HBV) infection. However, long-term use of nucleoside/nucleotide analogs may induce HBV drug resistance, thereby leading to treatment failure. The genotyping and phenotyping are two basic methods for detection and identification of HBV drug resistance. Genotyping is used to detect well-known drug-resistant mutations mainly through DNA sequencing and reverse hybridization line probe. Phenotyping is an essential tool to identify "novel" and complex resistant mutations, based on comparison of HBV replication capacity and drug susceptibility between variants and wild-type counterparts. We have developed sensitive, specific, high cost-effectiveness assay for HBV genotypic resistance detection, thus developing reliable assays for analyses of HBV replication capacity and phenotypic resistance. These assays have been widely-applied in clinic, realizing early finding of classical drug-resistant mutations and identification of unusual drug-resistant mutations. In our recent studies, we detected some unusual and complex HBV mutations in the patients with resistance and without good response to nucleos(t)ide analogs. In combination with clinical information and phenotyping of replication capacity and drug susceptibility, we have acquired novel findings as follows, (l) Detected and identified several multidrug-resistant HBV strains by screening of a large number of patients; and multidrug-resistant HBVstrains could be synergistically suppressed by combined use of anti-HBV agents. (2) It was found that HBV rt229 substitutions could be a compensatory mutation to increase replication capacity of lamivudine-resistant rtM204I mutant. (3) rtM204Q,was found as a novel lamivudine-resistance-associated mutation. (4) rtA181C+rtL180M+rtM204V was found to be associated with entecavir resistance. (S) It was found that in the same patient with drug-resistant HBV strains in sera, wild-type HBV strains were predominant in cccDNA of their peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), suggesting that PBMCs might be a storage pool of wild-type HBV associated with extra-hepatic HBV infection mechanism. These findings are important for a better understanding of clinical features and underlying mechanism of HBV drug-resistant mutations, capacitating clinicians to optimize antiviral schedule.【期刊名称】《解放军医学杂志》【年(卷),期】2012(037)006【总页数】4页(P535-538)【关键词】肝炎病毒,乙型;突变;抗药性,病毒;表型【作者】徐东平;刘妍【作者单位】100039北京解放军302医院全军传染病研究所/肝衰竭诊疗与研究中心病毒性肝炎研究室;100039北京解放军302医院全军传染病研究所/肝衰竭诊疗与研究中心病毒性肝炎研究室【正文语种】中文【中图分类】R512.62徐东平，医学博士，研究员，博士生导师。

武汉地区157例乙型肝炎病毒基因分型和耐药性分析

武汉地区157例乙型肝炎病毒基因分型和耐药性分析宋仕玲;桂文甲;周洪清;黄艺芬;尹淑芬;李靖;吴淑坤【期刊名称】《胃肠病学和肝病学杂志》【年(卷),期】2015(024)008【摘要】目的了解武汉市乙型肝炎病毒基因型分布特点和乙型肝炎病毒耐药情况.方法采用基因测序法检测武汉市区157例患者HBV基因型,目标检测基因型为A～H等8个基因型,检测HBV 11个耐药位点:rtL80、rtL169、rtV173、rtL180、rtA181、rtT184、rtA194、rtS202、rtM204、rtN236和rtM250,判断对HBV耐药的核苷类似物.结果武汉市区157例HBV感染者中,检出3种HBV基因型,其中B型占72.61％,C型占26.75％,D型占0.64％.共有68例(43.31％)耐药,其中B 型70.59％,C型29.41％,基因B型和C型的HBV相比,耐药发生差异无统计学意义(x2 =0.379,P＞0.05).对拉米夫定耐药41例,占全部耐药病例的60.29％,其中B型占73.17％,C型占26.83％;204I位点耐药17例,180M+204I位点耐药6例,180M+ 204V位点耐药12例,180M+ 204V/I位点耐药6例.对阿德福韦酯耐药20例,占全部耐药病例的29.41％,基因B型占75.0％,基因C型占25.0％,耐药位点为236T为9例,耐药位点为181T/V为7例,236T和181T/V联合耐药4例.对恩替卡韦耐药5例,占全部耐药病例的7.35％,基因B型3例,基因C型2例.拉米夫定和阿德福韦酯联合耐药2例,占全部耐药病例的2.94％,均为基因C型.替比夫定耐药与其他核苷类似物耐药分析结果重复,共32例,占47.06％,基因B型75.0％,基因C型25.0％.结论武汉市区157例乙型肝炎病毒感染者中男性较多,感染HBV 主要基因型为B型,其次为C型,患者主要表现为拉米夫定、替比夫定和阿德福韦酯耐药.临床应根据患者HBV基因型和耐药情况个体化制定治疗方案.【总页数】4页(P969-972)【作者】宋仕玲;桂文甲;周洪清;黄艺芬;尹淑芬;李靖;吴淑坤【作者单位】武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061【正文语种】中文【中图分类】R512.6+2【相关文献】1.武汉地区丙型肝炎病毒基因分型与慢性丙型肝炎患者肝功能和血液指标分析 [J], 周泉;李艳;童永清;汪明;徐万洲2.武汉地区254例丙型肝炎患者HCV基因分型结果分析 [J], 吴泽刚;李艳;郑红云3.某地区献血人群乙型肝炎病毒携带者基因分型与耐药性变异研究 [J], 肖泽斌;林树波;甘小洪;郑泽旋;李娟;Allen Chan;温国强4.乙型肝炎病毒的基因分型及其多药耐药位点变异与耐药性的相关性研究 [J], 张宝;李世龙;葛保民;秦莉;田珊红;周秀艳;李霞5.武汉地区女性人乳头瘤病毒感染及基因分型分析 [J], 黄景涛;白莉;李艳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

乙型肝炎病毒基因耐药变异的研究现状

ｔｌｏａｄａｅｌｇａｔｕｅｍｙｃｒｉｆｒｔｎＪ．ＪＥｐｉｒｒｉｈａｎｆｒｃｔｏａｄａｉａｃｉ［］ｘａｆｃｃｉｅａｌｎｏ
Ｍｄ２０，０（）２５—３３ｅ，０８２５２：９０．
ｄｖｌｍｅｔｅｏｅｉｇａｄａｏｈｓｌｇＪ］Ｊｅｌｅｅｏｎ，ｒｍｄｌ，ｎｐｔｐｙｉｏｙ［．Ｃｌｐｎｈｏ
ＳＪ．ＭＯＬＫＥＮＴＩＪＤ．ＰｒｏｔｓａｈｔｒｆｎｔｎｌＮｅｉｓｉａｅｅｏｕｃｉａｎｏ［９』ＣＯＮＷＡＹ１
１７ＬＪ２ｊＩＧＩＲ，ＮＲＩＮＯＲＳＲＡ，ｅａ．Ｐｒｓｎｍｄａｓｖｓｕａｔ１ｅｏｔｅｉｔａｃｌｒｉｉｅ
ห้องสมุดไป่ตู้
（稿日期：０１— ３—１编辑：晓文）收２１０１庄
乙型肝炎病毒基因耐药变异的研究现状
廖艳霞▲ 杨光，
广东省佛山市第一人民医院临床医学研究所（２００５８０）乙型病毒性肝炎是全球最常见的感染性疾病之一，全球
ａｌｒｔｉａｅ：ｉｆｅｃｏｃｒｉｏｍｎｆｎｔｎ『Ｊ．ｌｐｏｎｓｓｎｕｎｅｎａｄａｆｒａｄｕｃｏｏｅｌｃｉ］
Ｐｙｉｅ，０７．７（）：２５—１４．ｈｓｌｖ２０８４ｌ８ｏＲ３２
ＷＢＳ．ＷＥＢＥＲＫＴ．Ｃｒｉｃｆｒｓｓａａｌｅｏｉｓａｄａｂｏｉｓａｃｌｆｄａ— ｉｓ［７ＢＵＲＬＥ１Ｉ

乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测.doc

乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测一．检验项目：乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测二．检验目的：在进行抗病毒治疗前和抗病毒治疗中进行乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测，能够：1). 区分中国和其他亚洲国家常见的HBV-B、C、D基因型；2). 检测HBV抗病毒药物5个热点突变位点的6种突变类型；3). 对HBV实行动态监控，辅助确定个性化的临床诊疗方案，进行HBV流行病学研究。

三．临床意义：HBV基因型分为9种（A-I），其分布具有地域性，中国乃至亚洲流行的乙型肝炎病毒几乎都是B、C型，此外还有少量D型，不同的基因型易发生的突变类型不同，与病情转归也密切相关，如基因型C较B更容易引起严重的肝炎或肝癌，对干扰素的应答率A型高于D型，B型高于C型，C型高于D型。

与C型患者相比，B型患者较早出现HBeAg血清学转换，较少进展为慢性肝炎，肝硬化和原发性肝细胞癌。

核苷（酸）类似物，如拉米夫定（Lamivudine，LMV），替比夫定（Telbivudine,LdT），阿德福韦酯（Adefovir,ADV）和恩替卡韦（Enticavir,ETV）等是抗HBV常见药物。

但这些药物都无法彻底清除大多数乙肝病人体内的HBV，患者需要长期维持治疗。

HBV在宿主体内感染以及抗病毒治疗的过程中会发生基因变异，并在宿主体内免疫系统的压力下和在治疗干预过程中进行变异的优势选择，以达到逃逸免疫、对抗药物、实现物种生存的目的，进而发生耐药。

乙肝病人一旦出现耐药突变，其肝功能恶化的比例将显著增高，甚至快速进展至肝衰竭。

四．标本送检要求：4ml黄色帽血清管，空腹采集后立即送检，室温放置不宜超过2小时，如不能立即送检可于4℃保存一周，如需长期保存请放入－20℃冻存，运输过程中请注意保持低温。

五．开单名称：乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测进入本科室“医生工作站”→选择开单病人“姓名”→选择“项目类别”→选择“检验”→选择“乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测”→确定或进入本科室“医生工作站”→选择开单病人“姓名”→选择“项目类别”→选择“检验”→选择“实验室”→选择“乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测”→确定六．收费：570元/例七．送检时间：周一至周日8：00am－12：00am八．送检地点：检验科三楼服务台九．报告时间：抽血后，7个工作日后进入我院计算机检查报告系统，查看检测结果。

乙型肝炎病毒耐药基因及分型检测

乙型肝炎现状如何？乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病，主要存在于肝细胞内，可引起肝细胞炎症、坏死和纤维化。

乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性分布,全球约有3.6亿感染者，每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病.我国属于感染的高发区，现有的慢性HBV感染者约9300万例。

乙型肝炎病毒（HBV)基因分型的临床意义HBV根据DNA差异可分为A、B、C、D、E、F、G、H八种类型，不同型别在流行特征，致病性，对药物治疗反应等方面存在差异，其中，我国以B型和C型为主,感染HBV基因型B的患者发生肝纤维化及肝细胞癌的平均年龄要比感染HBV基因型C的患者的年龄大。

通过分型检测，可判断病毒复制活跃程度及突变发生率情况.研究表明，与HBV—B型相比,C型复制较活跃，不易发生HBeAg血清转换；HBV—B型易产生前C区突变，C型核心启动子区变异发生率更高，与重型肝炎发病机制密切相关，可作为肝癌高危指标之一.同时,HBV-B、C型患者易产生拉米夫定耐药突变，通过分型检测，可指导临床治疗方案制定，有针对性进行临床治疗，更大程度上提高患者的生活质量.乙肝的治疗方式有哪些?HBV感染主要的治疗方法是抗病毒治疗，国内外普遍使用的药物有干扰素和核苷（酸）类。

由于干扰素需要反复注射，且副作用较多,近年来,核苷(酸）类似物（NA)已成为抗HBV感染的主要方法之一，NA因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者,是长期治疗的合理选择.但随着治疗时间的延长,往往会出现病毒耐药株，从而需要监测乙型肝炎病毒耐药基因型，指导临床用药。

乙肝病毒产生耐药的机理是什么?HBV对某种药物的耐药性一般是指由HBV基因组上某些位点的变异导致这种药物对HBV的抑制作用减弱或无作用。

通常分为以下几种：(1）原发性耐药变异：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异,导致变异病毒株对治疗药物的敏感度下降；（2）继发性耐药变异(又称补偿性耐药变异)：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降,在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异,这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感度的进一步下降；（3）基因型耐药:指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV变异；（4)表型耐药：通过体外复制系统证实检测到的HBV变异会降低其对抗病毒药物的敏感度。

乙型肝炎病毒基因型与YMDD变异关系的研究进展(文献综述)

ＹＤＭＤ变异尤为突出，得ＨＶ感染后的临床表现与临并使Ｂ
床过程呈现多样化、复杂化。由于ＨＶ不同分离株间核苷Ｂ酸序列有差异。｛Ｅ前根据ｔＶ核苷酸全序列异质性分为８ｔＢ个基因型，问的基因型与病毒复制、不变异、疾病的预后及治疗药物的选操均有一定的关系。
上升趋势Ｊ。
突变。１８年日学者Ｏａｏ－首先提出了乙型肝炎病９８本ｋｍｔ１ｏ
毒基因分型法，１株不同亚型的ＨＶ基因序列两两比较对８Ｂ后，根据核苷酸序列异源性 ≥８％将ｌ８株不同亚型的ｔＶｔＢ基因序列分为ＡＣ个基因型，ＢＤ４随后Ｎｒｅ证实了这一ｏｄｒ结果，同时还发现了两个新的基因型Ｅ和Ｆ目前，。人类已发现的ＨＶ基因型共８种，分型标准是全基因序列同源Ｂ其性Ｉ９％，Ｓ基因序列同源性９９％，＞２或６以此为标准将乙肝病毒分为Ａ～ｉ８个基因型，｛不同基因型对各种抗病毒药物
同样，欧美国家对ＨＶ基因型及其与ＹＤ相关性的ＢＭＤ研究结果显示存在地区差异。Ｍｏｋｖｔａｏｉｚ等于１９９８年～
异与基因型无关。
主，以Ｂ型为主，南方Ｄ型仅见于少数民族地区，西藏和新如
疆，型偶有发班，Ｅ型和Ｆ型。Ａ无
２ＩＢＭＤ变异及产生机制－ＶＹＤＩ
ＨＶ基因组由ｓＣＰＸ４个开放阅读框组成，ＢＢ、、、ＨＶ变

深圳地区乙肝病毒基因分型与耐药性研究

刘艾芹，唐曙明△，陈卫布，余
（深圳市人民医院
涟
５１８０２０）
摘要：目的了解深圳地区乙肝患者ＨＢＶ基因型分布情况，分析ＨＢＶ基因型、耐药性与ＨＢＶＤＮＡ载量、ＨｂｅＡｇ之间的
Ｒｅｓｕｌｔｓ９０ｃａｓｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｇｅｎｏｔｙｐｅＢｉｎ１５６ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＣＨＢ，ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇｆｏｒ５７．６９．５８ｃａｓｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅＣｇｅｎｏ—
（ＳｈｅｎｚｈｅｎＰｅｏｐｌｅｓＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ５１８０２０，Ｃ＾ｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｌｅａｒｎｔｈｅＨＢＶｇｅｎｏｔｙｐｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｐａｔｉｅｎｔｓｉｎＳｈｅｎｚｈｅｎｒｅｇｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｚｅｔｈｅｒｅｌａ —
者选择适合的治疗方案。
关键词：肝炎病毒，乙型；基因型；抗药性，微生物
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３ — ４１３０．２０１３．１４．００５文献标识码：Ａ文章编号：１６７３－４１３０（２０１３）１４ — １７８７ — ０２

乙型肝炎病毒耐药变异与基因型检测在临床上的应用

摘要：目的建立直接测序法检测ＨＢ区耐药变异情况并分析基因型。探讨ＨＢ基因型与临床病情的关系。方法ＶＰＶ
检测４６例乙肝患者血清样本，用特异的引物对待检标本ＨＢ区进行ＰＲ扩增后作基因序列检测，用Ｃｒｍａ２２采ＶＰＣ利ｈｏｓ．３软件对测序结果进行分析有无突变产生，序结果用软件ｃｕｔｌ１８测ｌｓｘ．１进行基因分型分析。结果可通过一次测序反应完成对ａＨＢＤＮＡＰ区的基因检测及基因型分析。检出ＹＭＤ变异株８例，中ＹＩ例，ＶＤＶ．Ｄ其ＤＤ５ＹＤ３例。在检测的４６例标本中２３例为Ｂ基因型，阳性率为５．；２例为ｃ基因型，阳性率４．；基因型２，００有１其５６Ｄ例阳性率４４。Ｂ基因型ＨＢ感染者中ＨＣ．ＶＣ２例，８７；占．Ｃ基因型ＨＢ感染者中ＨＣＶＣ８例，３．。结论直接测序法分析ＨＢ常见耐药突变位点及基因型准确可占８１Ｖ
ｔｅｅｗｅｅ２ｈｐｔｃｌｌｒｃｒｉｏｈｒｒｅａｏｅｌａａｃｎｍａ（．）ｉｅｏｙｅＢｐｔｎ，ｅａｏｅｌｌｒｃｒｉｏｕ８７ｎｇｎｔｐａｉｓ８ｈｐｔｃｌａａｃｎｍａ（８１）ｉｅｏｙｅＣａｉｎｓｅｕ３．ｎｇｎｔｐｐｔｔ．ｅ

786例慢性乙型肝炎患者恩替卡韦基因型耐药突变及特征分析

基金项目"国家自然科学基金#(#(+")!)$%北京市自然科学基金#+#(!"+!$%北京市教育委员会科技计划重点项目#MW!"#(#""!&"%+$ 作者单位"#"""$'首都医科大学附属北京佑安医院#岳秀娟!李庆!王珊珊!陈德喜!石英$!北京市肝病研究所#王珊珊!陈德喜!石英$ 通信作者"石英!%&'()"/(+,24(!77&;-9<;-7+
表9五个突变位点单点和多点突变情况,例#B$-
突变位点
T#=?-?6@#() T#=?-?6E#+% T#=?-?6K!"! T#=?-?6=!&" T#=?-?6C#$'
单位点突变与其他位点联合 #.0$&($ 突变#.0#!($
总计
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关于乙型肝炎病毒预存耐药变异的认识

表１
药物
Ａ区Ｂ区Ｃ区Ｄ区Ｅ区
２７％［ｘｏ－１３］。近年来ＨＢＶ耐药检测方法进展迅速，包括：测序法（ＰＣＲ产物直接测序和克隆测序），聚合酶链反应一限制性片段长度多态性法（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ），探针杂交法，限制性片段质量多态性法（ＲＦＭＰ）等。一种新的基于聚合酶链反应一双引物寡核苷酸系统（ＯＰＯ）的方法在韩国开展。该方法具有较高灵敏度和特异度，操
预的依从性，应制定详细的饮食计划表，并严格执行‘１５｜。
中７９％ＡＬＴ水平正常ｍＪ。所以笔者认为还需要以更加客观的疗效评价指标如肝活检等为标准的随机对照试验来证实行为疗法是防治ＮＡＦＬＤ及其向ＮＡＳＨ、肝
硬化甚至肝细胞癌进展的有效手段。（本文参考文献见光盘）
（收稿日期：２０１２－０７－３１）
引起了临床医师的高度关注。一、ＨＢＶ预存耐药变异的基础ＨＢＶ为嗜肝ＤＮＡ病毒，研究发现ＨＢＶ病毒颗粒
预存耐药变异是ＨＢＶ与宿主免疫应答相互作用
ＤＯＩ：１０．３８７７／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４－０７８５．２０１２．２０．００８
的结果。未经抗病毒治疗的患者，可能最初感染耐药
ＨＢＶ株【５Ｊ，或者ＨＢＶ慢性感染期间在宿主免疫压力下发生变异ＭＪ。慢性乙型肝炎初治患者仅有少部分患者存在预存耐药变异。在没有抗病毒药物压力的情况下，耐药变异株的复制能力往往不如野毒株，且含量很
组（阿德福韦和替诺福韦）、脱氧鸟苷类似物（恩替卡
四、ＨＢＶ耐药变异株检测的问题首次选择核苷类药物治疗前，最好行基因耐药变异检测，以排除预存耐药变异。由于ＨＢＶ耐药检测方
法不统一，因此预存耐药变异发生率的报道不一致，如全世界ｒｔＭ２０４预存耐药变异的发生率范围为０～
韦），它们均存在不同形式的耐药变异株（表１），其变异的形式与治疗后变异株类似。

乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测标准操作规程

乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测标准操作规程（PCR和DNA反向点杂交）1. 目的：乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测标准操作规章，保证检测结果的准确性。

2. 应用范围：对HBV的基因型和耐药突变基因检测。

3. 职责3.1 文件编写：实验室技术员。

3.2 文件审核：实验室主管。

3.3 文件审批：实验室主任。

3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。

4. 参考文献4.1 亚能生物技术（深圳）有限公司乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测试剂盒剂说明书。

4.2 中山大学达安基因股份有限公司DA7600核酸序列检测系统用户手册。

5. 内容5.1 检测方法：PCR和DNA反向点杂交5.2 实验原理：设计特异的PCR引物扩增获得HBV目的基因片段，该片段包含了所要检测的基因型和耐药基因突变位点。

通过PCR产物与设计的探针进行特异性杂交，根据膜条特定位置显色（蓝色）与否来判断HBV的基因型和耐药突变类型。

5.3 性能参数3 copies /ml 。

5.3.1 灵敏度：检测下限为 1.0 ×105.3.2 稳定性：产品有效期为6个月，在有效期内产品性能稳定5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。

5.4.1 标本类型：血清或血浆。

5.4.2 标本保存：制备好的血清或血浆室温放置不超过2小时，2～8℃保存不超过48h，-18 ℃以下保存不超过半年，应避免反复冻融。

5.4.3 运送条件：冰壶或泡沫箱加冰袋密封，在途时不宜超过48h。

5.5 设备和试剂5.5.1 设备：DA 7600 荧光定量PCR仪、低速离心机、生物安全柜、高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/ 干式恒温器、冰箱（4℃、-20 ℃）、移动/ 固定紫外灯、三孔电热恒温水浴箱、振荡恒温水浴箱。

5.5.2 试剂：5.5.2.1 试剂品牌亚能生物技术（深圳）有限公司乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测试剂盒。

5.5.2.2 试剂批准文号：国食药监械（准）字2011第3401179号。

利用基因芯片技术研究乙肝病毒耐药机制

毒耐药机制。方法采用基因芯片技术和传统的ＰＲ核酸扩增技术，接受了拉米呋啶治疗的２９例乙肝患者进行Ｃ对３
基因分型以及拉米夫定治疗中Ｙ —ＤＭＤ基因变异即乙肝病毒耐药性进行检测。结果所有ＨＶＤＡ阳性者中，ＢＮＢ基
表１拉米夫定服用时间和ＹＤ变异的关系ＭＤ
因型１Ｏ例，Ｃ基因型１２例，／３ＢＣ混合型２例；米夫定治疗小于３个月、拉３个月一ｌａ以及１ａ以上的ＹＤ突变率分ＭＤ
别为３７％，５５％和４．％。结论基因芯片技术能很好地用于乙肝的诊断分型，能检测到ＹＤ变异情况，．７１．６０６并ＭＤ
２１基因分型所有ＨＶＤＡ阳性者中，．ＢＮＢ基因型１Ｏ例，Ｃ
基因型１２例，／３ＢＣ混合型２例；２２拉米夫定服用时间和ＹＤ变异的关系拉米夫定治．ＭＤ疗小于３个月、个月～１３ａ以及１ａ以上的ＹＤ突变率分ＭＤ别为３７％，５５％和４．％。见表１．７１．６０６。
提取ＤＡ模板，取ＨＢＮ保守序列为引物行ＰＲ扩Ｎ选ＶＤＡＣ增。余操作严格按照说明书进行。１４统计学处理对所得数据采用ＳＳ６０统计软件进．ＰＳ１．行处理，因素计数资料采用ｚ检验，量资料采用ｔ验，单计检Ｐ＜．５为具有者采用乙肝病毒基因芯片对２９例乙肝患者中ＨＶ笔３ＢＤＡ阳性的１８例标本的血清型、因型分型以及病毒耐药Ｎ３基

门诊乙肝患者和经拉米夫定治疗后乙肝患者基因分型和HBV P区耐药突变检测分析

１１一般资料．
０７山西医科大学第一临床医学院收治的１２例乙１
型肝炎患者，中男性标本５其０例，性标本６女２例，年龄１８—６７岁，位年龄３．中８２岁。诊断标准按２０００年病毒性肝炎防治方案ｊ。１２例标本按照是１否经过拉米夫定治疗分为２组，组为门诊乙肝患者一５５例，另一组为经过拉米夫定治疗住院患者５。７例
治疗后乙肝患者基因分型和ＨＶＰ区耐药突变检Ｂ测分析，旨在探讨门诊乙肝患者和经拉米夫定治疗后乙肝患者基因分型和ＨＶＰ区耐药突变差异，Ｂ为
沉淀所在位置，其挑离管底，吹洗５次；漩涡将并用振荡器振荡１将沉淀充分打散；０Ｃ条件下温５ｓ１０ｏ育１ｎ放人台式离心机，１０ｇ离心力条０ｍｉ；在１００×
摘要：目的探讨门诊乙肝患者和经拉米夫定治疗后乙型肝炎患者ＨＶＰ区耐药突变区别。方法Ｂ采用荧光定量ＰＲＣ
结合ＤＡ测序技术对患者进行ＨＢＮＶ分型和ＨＶＰ区耐药突变点进行检测分析。结果门诊乙肝患者５Ｂ５例和经拉米夫定治疗后乙肝患者５７例在ＨＶ基因型上并没有显著差异，中门诊乙肝患者主要存在拉米夫定（Ｂ其６例，０９）阿德福韦酯１．％、（３例，．％）５４耐药突变株，没有替比夫定和恩替卡韦突变，而经拉米夫定治疗后乙肝患者ＨＶＰ区主要存在拉米夫定位点，Ｂ

乙型肝炎患者HBV基因型与核苷(酸)类似物耐药变异的关系

（２１８，９５ｆｅｏｐ４．％ｆｅｏｙｅＣ，ｅｐｃｖｌ，ｈｃｉｎｔｈｗｄｓｎｆａｔ６／２）４．％ｏｇｎｔｅＢ，２９ｏｇｎｔｐｒｓｅｔｅｙｗｉｄｄｏｓｏｅｉｉｃｎｒｙｒｉｈｇｉ
ｖｕｉｓ（ＨＶ）ｄｕ・ｓｔｃｍｔｎｎｔｇｎｔｅｕｎｕｌｏｔｄｎｌｇｅｈｒｐ．ｒＢｒｇｒｉａｅｕａｔａｄｉｅｏｐｓｄｒｇｎｃｅｓ（）ｉｅａａｏｕｓｔｅａｙｅｓｎｓｓｙｉ
ＭｅｈｄＨＢｅｏｙｅ，ａｖｄｎ，ａｅｏｉｄｐｖｘｌｎｎｅａｉｒｓｓａｃｔｔｗｒｅｅｍｉｅｔｏｓＶｇｎｔｐｓｌｍｉｕｉｅｄｆｖｒቤተ መጻሕፍቲ ባይዱｉｉｏｉａｄｅｔｅｖｒｅｉｔｎｅｍｕａｓｅｅｄｔｒｎｄｎ
Ｃｒｅｐｎｉｇａｔｏ：ｉｇｉｌ＠ｈｔｉｃｎｏｒｓｏｄｎｕｈｒｙｎｘｉａｕｏｍａｌｏ．
【ｓｒｃ】０ｂｅｆｅｈｉｆｈｓｔｙｉｔｉｖｓｙａｅｒｌｉｓｉｂｔｅｎｈｐｔｉＢＡｂｔａｔｊｅｖＴｅａｍｏｉｓｄｅｔｇｔｔｅｔｎｈｅｅｅａｔｉｔｕｓｏｎｉｅｈａｏｐｗｉｓ
ｏｙｅＡ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈｒｏｅｅｔｄ．Ｔｈｔｄｅｎｔｔｄｔａｅｔｔｌｔｔｎｒｔａ８４ｔｐｗｅｅｎｔｄｔｃｅｅｓｕｙｄｍｏｓｒｅｈｔａａｉａｅｗｓ４．％ａｈｔｏｍｕｏ

乙型肝炎病毒基因型与耐药病毒株的相关性研究

张书楠余文辉，大桥。张春雷冯玉丽贺劲松。周小梅李伟雄陈雪红林卓玲，周，，，，，，，
（东省深圳市中医院：．验科；．家级肝病重点专科５８３）广１检２国１０３
摘要：的研究乙型肝炎病毒（Ｖ）因型与耐药病毒株产生的相关性。方法征集３０例接受拉米夫定治疗１年以目ＨＢ基４上的慢性乙型肝炎（ＨＢ患者为研究对象。采集血样经离心分离血浆，行ＨＢＤＣ）进ＶＮＡ定量检测，进行基因测序和基因分型。再结果基因测序和基因型分析结果为：型１Ａ６例（．）Ｂ型ｌ２例（２９）Ｃ型１８例（３５）Ｄ型４４７，１３．，４４．，４例（２９）ＢＣ１．，／
ｇｎｔｐ６（２１）ｉｅｏｙｅＣ，（８２）ｉｅｏｙｅＤａｄ４２．）ｉｘｄｇｎｔｐＣ．ｎｌｓｎＴｈｒｑｅ — ｅｏｙｅＢ，４４．ｎｇｎｔｐ８１．ｎｇｎｔｐｎ（００ｎｍｉｅｅｏｙｅＢ／Ｃｏｃｕｉｕｅｆｅｕｎ
取１０Ｌ血清与蛋白酶Ｋ混合后，０
耐药的相关性尚未完全明晰。本课题旨在通过揭示ＨＢ基Ｖ因型与ＬＡＭ耐药的关系，临床优化ＣＨＢ治疗方案，明为阐
裂解缓冲液１０℃ 孵育１ｉ，过酚／仿抽提，醇沉淀，００ｒｎ通ａ氯乙

乙型肝炎病毒耐药突变基因的检测与分析

乙型肝炎病毒耐药突变基因的检测与分析姜清明【摘要】目的检测该院2013年-2015年乙型肝炎患者基因分布及病毒耐药基因突变情况及相关性和临床意义.方法采用荧光定量和基因芯片技术检测240例乙型肝炎患者乙肝病毒(HBV)基因型和对拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定药物突变基因型.结果 240例乙型肝炎患者中,HBV基因型包括:B型61.3％(147/240)、C型25.0％(60/240)、B和C混合型5.4％ (13/240)、其他型8.3％(20/240),未检出D型.182例未出现耐药,拉米夫定耐药突变44例,阿德福韦出现耐药突变者7例,恩替卡韦出现耐药突变者6例,替比夫定出现耐药突变者为1例.M204V以及M204I是两种常见的拉米夫定耐药突变情况,在阿德福韦耐药突变中以N236T±A181位碱基替换相对常见;T184位碱基替换是恩替卡韦耐药突变的典型代表;M204I是替比夫定耐药突变的主要表现.部分从来没有采用核苷酸等药物治疗者也有可能被检测出耐药突变情况.44例出现拉米夫定耐药的基因型中,180M 及其混合突变型占86.4％(38/44),C型HBV基因突变占61.4％(27/44),且主要为180M耐药突变型(24/27).结论检测乙型肝炎病毒耐药突变基因,可以帮助医学工作者确定患者是否存在耐药性,从而选择恰当的抗病毒方法对其进行治疗.【期刊名称】《中国医学工程》【年(卷),期】2017(025)002【总页数】3页(P84-86)【关键词】肝炎病毒;乙型;耐药;突变基因【作者】姜清明【作者单位】广东省粤北第二人民医院检验科,广东韶关512231【正文语种】中文【中图分类】R512.62乙型肝炎简称乙肝，作为全球性关注的公共卫生问题，严重威胁到人类健康，据报道，慢性乙型肝炎病毒携带者全球多达3.6亿人，在中国，乙肝病毒携带者占三分之一。

乙型肝炎可成为肝硬化、肝癌和肝衰竭的诱因，严重者甚至可引发死亡。

基因芯片技术在乙型肝炎病毒分型和耐药突变检测中的应用

３．（２／２）５７１４３５．Ｔｈｅｕｔｐｓｗｅｅｆｕｄ，ｉｉｈｇｎｔｐｓ６．ｒｅｓｂｙｅｒｏｎｎｗｈｃｅｏｙｅＢｗａ３８
（２／５，ｇｎ — ２２３２）ｅｏ
ｔｐｓ３．（１／５）ｎｅｏｙｅＤｗａ．ｙｅＣｗａ３０１３２，ａｄｇｎｔｐｓ０３５
［ｓｒｃ］ＯｂｅｔｖＴｏｒｐｄｙｄｔｃｈｅｏｙｅｆＨＢａｄｄｕ —ｅｉｔｎｅｍｕａｉｎｉＡｂｔａｔｊｃｉｅａｉｌｅｅｔｔｅｇｎｐｐｓｏＶｎｒｇｒｓｓａｃｔｔｎｏ
ｃｉｉａｓｍｐｅｙｍｅｎｆｇｎｈｐｄｔｃｉｎｓｓｅＭｅｈｄ３２ｃｓｓｏｌｉａａｌｓｗｅｅｌｃｌａｌｓｂａｓｏｅｅｃｉｅｅｔｙｔｍ．ｎｏｔｏｓ５ａｅｆｃｉｃｌｓｍｐｅｒｎ
ＰＣＲｎｄｇｅｈｉｅｈｎｉｅｃｎｂｓｄｔｔｃｔＨＢＶｅｔｉｇａｕ — ｅｉｔｎｃｕｔｔｏａｎｅｃｐｔｃｑｕａｅｕｅｏｄｅｅｇｎｏｙｐｎｎｄｄｒｇｒｓｓａｅｍａｉｎ，ａｎｄｉｓｓｃｆｃ，ｓｎｉｉｅａｏｔｉｐｅｉｉｅｓｔｖｎｄｃｎｖｅｅ，ｓｔｂｌｏｒａｌｃｔｏｎｄｆｅｅｔｌｖｌｓｉａｓｎｉｎｔｕｉａｅｆｐｐｉａｉｎｉｉｆｒｎｅｅｓｏｆｈｏｐｔｌ，
３种基因亚型，中Ｂ型２２例，６．；其２占３８ｃ型】５，３．；型１，０３；、合感染ｌ例占３０Ｄ例占．ＢＣ混