microRNA的研究进展(整合版)

3.2 miRNA诱导的基因沉默模式 及其相关机制的形成
miRNA靶向互补mRNAs导致目的mRNA切割降解的过程被称 为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）。 有效的PTGS需要RISC对mRNA转录本的切割。
miRNA可以指导RISC在转录后水平下调基因的表达-mRNA 的降解或翻译抑制。采取何种沉默方式是由mRNA的特性所决定 的。如果mRNA能够与miRNA完全互补，该mRNA就会被RISC 特异地降解；如果mRNA不能与miRNA完全互补，仅在某个位 点与miRNA互补，那么RISC就不会特异地降解mRNA，只是阻 止mRNA作为翻译的模板，使之不能合成蛋白质。
对miRNA来说，发挥对靶基因的调控作用，Dicer和RISC 是必不可少的。因为Dicer是产生miRNA不可或缺的，而RISC 则是miRNA实现功能的载体。
3.1 RNA诱导沉默复合体（RISC）的形成
miRNA 介 导 的 RISC 简 称 miRISC （ miRNA-containing RNA induced silencing complex），也被称作miRNA核糖核蛋白复合体 （ miRNP ） 。 miRISC 复 合 体 除 了 包 括 成 熟 miRNA 外 ， 还 包 含 Dicer蛋白和多种其他相关蛋白。其与RISC结合的原理与siRNA 类似。以dsRNA为例，当双链中两根支链的稳定性相似或相同 时，它们结合进入RISC的概率也相似或相同，因此称为等势结 合。当双链中支链的稳定性相对较弱时，解旋酶会从稳定性弱 的一支解开dsRNA，从而会偏向性地产生一条结合到RISC复合 体上，这类结合称为优势结合，未进入RISC的互补链RNA会很 快降解。
3.2.1 miRNA的翻译起始抑制与 翻译起始后抑制
miRNA对翻译起始抑制的相关机制主要有如下一些观点： 首先，mRNA可通过抑制核糖体的组装来阻断翻译起始，进 而 起 到 对 翻 译 过 程 的 抑 制 作 用 。 miRNA 的 抑 制 作 用 需 要 靶 mRNA具有m7G帽子结构成为支持这一理论的重要依据，由此推 断miRISC可能通过对翻译起始复合物形成抑制而发挥作用。 还有一些观点认为，通过影响靶mRNA脱腺嘌呤反应，导致 其 poly A尾 缩 短 ， 从 而 使 mRNA 与 poly A 结 合 蛋 白 （ poly A binding protein ,PABP）受阻进而影响蛋白质翻译的起始。
3.2.1 miRNA的翻译起始抑制与 翻译起始后抑制
研究还表明，一些被miRNA作用后的mRNA可以与多核糖体 偶联，这些核糖体在翻译中处于非常活跃度状态。此外， miRNA的抑制作用还可能发生在起始之后，这主要是由于其在 翻 译 过 程 的 抑 制 作 用 是 通 过 内 部 核 糖 体 进 入 位 点 （ internal ribosome entry site, IRES），而不是依赖mRNA m7G帽子来发挥 作用。其他作用方式，比如对新生多肽链的翻译同步降解等目 前还没有定论，有待进一步证实。
首先由基因组转录形成长链RNA分子——pri-miRNA
Pri-miRNA经双链RNA核酸酶Drosha酶作用，加工形成70100nt长度的pre-miRNA
Pre-miRNA在Exportin5介导作用下转运出胞核至胞质中进 行下一步加工
Pre-miRNA在胞质中经双链RNA核酸酶Dicer酶作用加工形 成单链成熟miRNA分子
miRNA 对 靶 基 因 的 调 控 ， 正 如 前 所 述 ， pre-miRNA 由 exportin-5输出至胞浆中，然后释放pre-miRNA。pre-miRNA与 Dicer 互 补 结 合 ， 产 生 长 度 为 22nt 的 不 完 全 配 对 的 双 链 RNA （dsRNA）。双链中的一条为成熟的miRNA，另一条则为它 的互补链。最后，双链中成熟的miRNA与RNA诱导的RISC结 合，随后与靶mRNA互补。而互补链没有结合RISC，因此在 体内是趋于降解的。
(5) 基因
micoRNA(miRNA)
是广泛存在于真核生物中的一组短小的、不编码蛋白质的 RNA家族，它们是由19-23个核苷酸组成的单链RNA（3‘端可 有1~2个碱基长度的变化）
microRNA的生物学特征
microRNA 广泛地存在于多种真核生物中，从低等生物到人类都有其存在 的痕迹。其生物学特性主要表现为：高度保守性，时序表达特异性和组织表 达特异性,以及miRNA独有的特征。
Ago家族蛋白为一类分子质量约为100kD的蛋白质，属于进 化保守的家族，包含有PAZ和Piwi两个保守的RNA结合结构域， 是目前唯一一种在所有RNAi和miRNA通路中均可发现的蛋白。 Ago蛋白与miRNA结合使其朝向正确，以便与靶基因mRNA作用 。Ago蛋白可能招募其他蛋白行使翻译抑制功能；一些Ago蛋白 直接切割靶转录本。
在植物中，由于miRNA与潜在的靶基因是完全互补的，使得 植 物 的 miRNA 靶 预 测 相 对 较 容 易 。 但 这 些 预 测 基 因 是 否 就 是 miRNA的靶基因，还需要作进一步验证。
研究表明，microRNA基因是一类高度保守的基因家族，按 其与靶基因的作用模式不同，主要可分为以下三种类型。
性变化和较小程度的空间表达差异。由此，可以推测microRNA 表达 的变化可能在动物发育过程中形成生理差别是其作用。
组织表达特异性
一些microRNA 表达具有细胞和组织特异性，如miR-17～ 20位于Hela细胞同一基因簇内，并在斑马鱼细胞中表达， 但在鼠肾和蛙卵巢细胞中未检测到。这种特异性对 microRNA 的调控功能有重要意义。
3.2 miRNA诱导的基因沉默模式 及其相关机制的形成
在动物中，多数情况下复合物中的单链miRNA与靶mRNA的 3’UTR不完全互补配对，从而阻碍对该mRNA的翻译，并以此来 调控基因表达，但不影响mRNA的稳定性。如线虫中的miRNA lin-4就是以这种方式调控它的两个靶基因—lin-14和lin-28的翻译。 另一种主要的作用方式则与 siRNA诱导的转录后基因沉默的 PTGS相类似，当miRNA与mRNA完全互补配对时，Ago蛋白可 通过对mRNA的切割直接导致其降解，完成基因沉默调控。
3.2.2 miRNA介导的mRNA衰减（降解）
miRNA可诱导与其不完全配对的靶mRNA衰减（降解）。通 过Ago蛋白定位于如P小体（processing bodies, P-bodies）等的 RNA颗粒（RNA granules）中，这些颗粒中包含有mRNA降解的 酶。这也可能是miRNA介导Mrna衰减的一个重要途径。
高度保守性
microRNA的序列结构在各个物种间具有高度的进化保守性，最具有 microRNA 保守性的是let-7，它广泛存在于两侧对称的生物体中，其序列 保守性令人吃惊。科研人员认为，microRNA的保守性具有重要的生物学意 义，提示在不同生物发育过程中，microRNA具有相同的调控机制，同时也 为生物早期进化同源性提供了某种依据。
4.microRNA应用现状
——癌症和发育中的miRNA
3.1 miRNA功能的发现
过去20年，肿瘤遗传学家揭示了许多与肿瘤多步骤发生及进展相关的 基因，这些研究都集中于传统的蛋白质编码基因，包括癌基因、抑癌基 因以及维持基因组稳定的基因。
在发现miRNA之前，人们一直认为基因组上的部分大片段未被翻译成 蛋白质，所谓的“废物碎片”没有功能。
miRNA独有的特征：其5’端第一个碱基对U有强烈的倾 向性，而对G却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏U，一般 来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C
miRNA执行一定的生物学功能：
•对与其互补的mRNA表达水平具有调节作用； 通过两种机制调节靶基因的表达:
(1) 结合到靶mRNA 3′端非翻译区(3′U TRs) ,抑制其翻译; (2)像siRNA 作用一样结合到靶上并降解靶mRNA。 •一些偏大的miRNA (27nt)可能参与了基因组的重组； •参与生物的发育与多种生理、病理过程；
而 近 十 年 来 ， 越 来 越 多 的 证 据 显 示 ， 小 分 子 非 编 码 RNA-microRNA （miRNA或miR），其功能失调与肿瘤发生密切相关，证明了miRNA是 基因表达强有力的调控器。
2.mLeabharlann BaiducroRNA的加工成熟
microRNA的加工成熟
miRNA的生成需要两个步骤：
1)由长的内源性转录本（pri-miRNA)经Drosha酶作用生成70nt左 右的miRNA前体(pre-miRNA)，该过程发生在细胞核
2)将pre-miRNA经Dicer酶作用加工为成熟miRNA，该过程发生在 细胞质中
1）作用时与靶基因完全互补结合，作用方式和功能与siRNA 非常类似，最后切割靶mRNA，常见于植物；
2）作用时与靶基因不完全互补结合，进而阻止翻译而不影 响mRNA的稳定性，这是目前发现最多的作用模式，常见于动物。
3）具有以上两种作用模式，当与靶基因完全互补结合时， 直接靶向切割mRNA，当与靶基因不完全互补结合时，阻止靶基 因的翻译。
MicroRNA的研究进展
1 microRNA生物学特征及功能 2 microRNA的加工成熟 3 microRNA的作用机制 4 microRNA应用现状 5 展望
1.microRNA的生物学特征 及功能
RNA的分类
(1) 信使RNA(mRNA) (2) 转运RNA(tRNA) (3) 核糖体RNA( rRNA) (4) 核酶(ribozyme) 和其它RNA 自我催化分子 组RNA(genome RNA) (6)指导RNA(guide RNA) (7)非编码RNA (8) tmRNA (9) 小胞质RNA( small cytoplasmicRNA ,scRNA) (10) 小核RNA(small nuclear RNA ,snRNA) (11) 核仁小RNA(small nucleolar RNA ,snoRNA) (12) 反义 RNA(antisense RNA) (13)端粒酶RNA (14) 小RNA
3.microRNA的作用机制
miRNA对靶基因的作用机制一直是众多研究人员的关注热点。 最早发现的两个miRNA—lin4和let-7被认为是通过不完全互补结 合到靶基因mRNA 3’UTR，以一种未知的方式抑制蛋白翻译， 进而抑制蛋白合成，阻断mRNA的翻译过程。后来的研究也发现， 多个果蝇miRNA和它们的靶基因mRNA的3’UTR存在部分同源。 但由于有miRNA与其目标靶之间的互补是不完全的。用生物信 息学的方法鉴定miRNA的目标靶位点并非易事。
3.1 RNA诱导沉默复合体（RISC）的形成
RISC是miRNA参与靶基因调控过程中不可或缺的载体。在 miRISC复合体中，Dicer对pre-miRNA的处理与双链螺旋的解旋 是偶联进行的。通常，只有一条链进入miRNA，具体选择双链 中哪一条链取决于碱基热动力学稳定性因素等因素。不进入 RISC的miRNA链被称之为伴随连（passenger），并被冠以星号 （*），具有更低的稳定性，通常情况下被降解掉。但在某些情 况下，两条链均具有活性，成为针对不同靶基因mRNA的功能 miRNA。RISC是具有多轮催化效应的酶。在这一过程中，其核 心组分Ago2发挥重要作用。因此，在组成miRISC的蛋白质中， Ago蛋白家族成员在RISC功能中处于中心地位。
时序表达特异性
在不同组织、不同发育阶段中，microRNA的表达水平有 显著差异。一些microRNA呈时间发育特异性表达， Neilson JR 等研究表明在细胞发育的不同阶段mRNA表达 是动态调控的。Ason B等研究发现，不同物种间许多 microRNA 表现高度保守性，mRNA 表达变化越大，生理 差别越大。物种间的差别最主要是由于microRNA 表达的异时