血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定
实验三血清γ-球蛋白的分离、纯化及鉴定七年制
的结构分析提供了基础。
序列和结构分析结果解读
根据氨基酸序列，对血清γ-球蛋白的一级结构进 行了深入分析，确定了其基本组成。
利用计算机模拟技术，对血清γ-球蛋白的高级结构进 行了预测，揭示了其可能的折叠方式和空间构象。
一级结构分析 高级结构预测
实验态度培养
实验过程中需严谨细致，实事求是记录数据，培养了我们 的科学态度和实验精神。
团队合作意识
实验操作需要小组成员密切配合，增强了我们的团队协作 意识和沟通能力。
实验不足与改进
在实验过程中，我们也发现了一些不足之处，如样品处理 过程中可能存在的误差、层析柱的平衡问题等，需要在今 后的实验中加以改进和完善。
结果讨论与展望
实验意义
输标02入题
本实验成功分离、纯化了血清γ-球蛋白，为进一步研 究其功能和作用机制提供了材料。
01
未来可以深入研究血清γ-球蛋白与其他蛋白质的相互 作用，以及其在生理和病理过程中的作用，以期为相
关疾病的诊断和治疗提供新思路。
04
03
未来研究方向
05
结论
实验总结
实验原理
本实验基于蛋白质分离纯化的基本原理，通过离子交换层 析和凝胶过滤层析技术，实现了血清γ-球蛋白的分离和纯 化。
03
通过比较肽段的序列信息与数据库中的蛋白质序列， 可以鉴定出蛋白质的身份。
序列分析和结构预测的方法
01
序列分析通过测定蛋白质中每个氨基酸的排列顺序，确定蛋白 质的一级结构。
02
结构预测则基于已知的氨基酸序列，利用计算机模拟技术预测
蛋白质的三维结构。
这些方法对于理解蛋白质的功能和作用机制具有重要意义。
【生物化学实验】血清γ球蛋白分离纯化与鉴定PPT课件
凝胶层析法
透析
本试验采用葡聚糖凝胶——Sephadex G 25层析方 法除去球蛋白粗提液中的盐硫酸铵，以便下一步用离 子交换层析方法进一步提纯球蛋白。
9
凝胶柱层析脱盐
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目的与要求
1.学习了解凝胶 层析的原理
2.熟练了解凝胶 层析的用途
/min，使凝胶均匀沉降，不断补充，直至15cm。 4、上留1—2mm的水，关闭出口。 注意：★ 床面上要保持少许水，防止胶床露出液面。
★ 胶面不平，用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降， 使表面平整。
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▲ 加样与洗脱
1、加样：用滴管将盐析后样品加入柱床面，打开出口使样品 溶液渗入凝胶。
2、洗脱：加入洗脱液，打开出口，保持流速10滴/min，收 集洗脱液，用钠氏试剂检测胺。
3、保存：检测洗脱液的蛋白质量，保存含量高的进一步纯化
▲ 凝胶的再生
不断加洗脱液，使铵全部流出，为下次实验做准备。
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注意事项：
1 . 凝胶柱的制备质量决定分离效果的好坏 。 2. 加样分离时，滴速越慢，分离效果越好。
★ 以管号为横轴，蛋白 质含量为纵轴绘制洗脱 曲线，分析实验结果。
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三、DEAE－纤维素离子交换层析
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凝胶层析原理：
凝胶层析法是按混合物各组分分子量大小不同随流 动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术。
凝胶是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，当吸收 一定量溶液后溶涨成柔软、富有弹性、不带电荷、不与溶 质相互作用的惰性物质，凝胶层析以其为固定相。层析时， 直径大于凝胶网孔的大分子物质不能进入凝胶内部，只能 沿着凝胶颗粒间的间隙随流动相向下移动，所以流程短、 流速快，首先流出层析柱；而小分子物质直径小于凝胶网 孔能自由出入，洗脱时间长，后流出层析柱，经过一定时 间层析，分子大小不同的物质彼此分开，达到分离的目的。
实验三 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定
实验三血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定【实验目的】一.掌握层析技术的基本原理及应用二.了解层析技术的分类三.掌握凝胶层析和离子交换层析的原理【实验原理】一、层析技术1.层析法层析法也称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、分析鉴定技术,是1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。
将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。
2.依据混合物中各组分理化性质的差异—分子大小、酸碱性、吸附力、分子形状、分子极性、分子亲和力以及分配系数等。
3.基本原理固定相—固定不动。
流动相—对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。
分离原理：待分离混合物中各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、再吸附、再解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。
4．凝胶层析(凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析)①定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。
②基本原理：固定相：凝胶，不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒内部都具有很多细微的小孔，如同筛子一样，故称分子筛。
包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝胶。
流动相：洗脱液。
样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，小分子能进入凝胶孔内部，做不定性扩散运动，流程长，速度慢，后流出；大分子不能进入凝胶孔内部，只能在颗粒间移动，作垂直向下运动，流程短，先流出→大小分子彼此分开。
③影响因素*层析柱的选择及装填：柱大小—分离样品量凝胶型号—分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。
凝胶分离范围之外的分子，难以分离。
如大小不同的两种全排阻分子/完全渗透分子。
*洗脱液：溶解待分离物质，不变性*加样量：1%～5%*凝胶的再生5. 离子交换层析离子交换层析是利用离子交换剂对各种离子的亲和力不同，借以分离混合物中各种离子的一种层析技术。
实验二 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定
二、血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定
清蛋白 血 清 球蛋白 β γ pI=7.3 9%～11% 12%～18% >150kD α1 pI=4.9 60%～70% 2%～3.5% 69kD
α2
pI<6
4%～7%
分离依据：蛋白质理化性质的共性和个性
共性：
*生命大分子：透析、超滤、超离心、凝胶层析 *蛋白质溶液有胶体性质：稳定因素为水化膜和电荷→ 盐析/有机溶剂沉淀 *两性电解质和等电点：pH>pI，蛋白质带负电；反之带 正电→电泳、离子交换层析 *有一定的功能：抗原性→免疫沉淀
血清电泳结果
清蛋白（albumin，A）：38～48g/L
球蛋白（globulin，G）：15～30g/L
A/G：正常值1.5～2.5
电泳鉴定
清蛋白 1 2
γ 加样线
对照
纯化γ蛋白 加样线 样品
注意事项
1.盐析：滴加硫酸铵时边摇边逐滴加入 2.离心：小试管离心，加套管配平。（参考视频） 3.层析：上样（转圈滴加）；防止柱床液层干涸；收集
蛋白样品时用载玻片加磺柳酸检测；凝胶再生。
4.浓缩：G-200干胶用纸条少量多次加入，液层高<0.5ml；
用过的G-200干胶倒入收集烧杯，回收利用。
5.电泳：区分正反面；血清点一次，纯化蛋白点3-5次；
点样面朝下，在负极。（参考视频）
预实验结果
凝胶层析原理
大分子：垂直向下运动
流程短
小分子：垂直向下运动 不定向扩散
流程长
交联葡聚糖凝胶
多聚葡萄糖与环氧丙 烷交联而成，网状结 构。珠状颗粒，商品 名为Sephadex G系列。
07 生物化学实验--血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定
血清γ- 球蛋白的分离、纯化与鉴定【目的】1 ．掌握盐析 - 层析法提纯血清γ- 球蛋白的原理和技术。
2 ．熟悉电泳比较法定性γ- 球蛋白的方法。
3 ．了解扫描定量γ- 球蛋白的方法。
【原理】蛋白质的分离、纯化是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段。
根据不同蛋白质的分子量、溶解度以及在一定条件下带电荷性状的差异来分离、纯化各种蛋白质。
1 ．γ- 球蛋白的分离、纯化（ 1 ）盐析：清蛋白与球蛋白的稳定性不同，故可用盐析法对血清蛋白质初步分离。
在半饱和硫酸铵溶液中，清蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心所得的沉淀即是球蛋白混合物。
（ 2 ）脱盐：球蛋白混合物中的硫酸铵会妨碍进一步分离纯化，应除去。
脱盐的方法有多种，本试验采用凝胶过滤。
在凝胶过滤中，柱中的填充料是高度水化的惰性多聚物，最常用的有葡聚糖凝胶（ Sephadex Gel ）和琼脂糖凝胶 (Agarose Gel) 等颗粒。
葡聚糖凝胶是具有不同交联度的网状结构物，它的“ 网眼” 大小可以通过交联剂与葡聚糖的配比来达到。
不同型号的葡聚糖凝胶可用来分离和纯化不同分子大小的物质。
把葡聚糖凝胶装在层析柱中，不同分子大小的蛋白质混合液借助重力通过层析柱时，比“ 网眼” 大的蛋白质分子不能进入网格中，而被排阻在凝胶颗粒之外，随着洗脱剂在凝胶颗粒的外围而流出。
比‘ 网眼 ' 小的分子则进入凝胶颗粒内部。
这样，由于不同大小的分子所经路程距离不同而得到分离。
大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。
所以含硫酸铵的蛋白值溶液通过层析柱时，先被洗脱出层析柱的是球蛋白，小分子硫酸铵由此法分离除去（参见第 2 篇第 2 章图 2-3 ）。
（ 3 ）纯化：γ- 球蛋白与α 、β- 球蛋白（以及微量的清蛋白），等电点不同，所以采用离子交换层析，从球蛋白混合物中分离、提纯出γ- 球蛋白。
用于蛋白质分离的层析材料多是离子交换纤维素，它们的优点是对蛋白质的交换容量较一般的离子交换树脂大，而且品种较多，可以适用于各种分离目的。
11.6 生化实验报告 血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定及电泳分析
血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定及电泳分析【实验目的】1、了解蛋白质分离提纯的总体思路。
2、掌握盐析法、凝胶层析法和离子交换层析的实验原理及操作技术3、掌握电泳法分离纯化蛋白质的方法。
【实验原理】1、蛋白质的粗提——盐析法胶体的盐析是加盐，盐中的带电粒子使蛋白质周围的水化膜减弱，胶粒溶解度降低，形成沉淀析出的过程，是胶体的聚沉现象的一种。
向蛋白质溶液中加入某些浓的无机盐[如(NH4)2SO4或Na2SO4]溶液后，可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出，这种作用就叫做盐析。
盐析不能使蛋白质变性，可以复原。
利用这个性质，可以采用多次盐析的方法来分离、提纯蛋白质。
蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。
蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。
同时，离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，蛋白质溶解度更加降低，之蛋白质分子之间聚集而沉淀。
由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白中分离出来。
简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。
由于清蛋白的亲水性比球蛋白大，且清蛋白的分子比球蛋白小，所以清蛋白需要高浓度的盐溶液才能够发生盐析，低浓度的时候球蛋白发生盐析。
盐析法分离蛋白质：各种蛋白质的颗粒大小、亲水程度、pI不同，盐析所需的盐浓度也不一样。
调节盐浓度可使不同的蛋白质沉淀，从而达到分离的目的。
常用中性盐：硫酸铵、硫酸钠等。
硫酸铵：温度系数小，溶解度大，蛋白谱广，盐析效果好，不易引起变性。
可用硫酸/氨水按需要调节pH值。
本实验中清蛋白分子小，亲水性强，在饱和硫酸铵溶液中可沉淀析出，而球蛋白分子大，亲水性弱，在半饱和硫酸铵溶液中即可沉淀析出。
Ⅲ—01血清γ球蛋白的分离与纯化
Ⅲ—01 血清γ球蛋白的分离与纯化Ⅲ—01 血清γ球蛋白的分离与纯化一、引言血清γ球蛋白是一种重要的血清蛋白质，在免疫系统中发挥关键作用。
其具有调节免疫反应、保护机体免受感染和疾病侵害的功能。
通过分离和纯化血清γ球蛋白，我们可以更好地理解其生物学特性，探究其在各种疾病中的变化，为临床诊断和治疗提供帮助。
二、材料与方法1.材料所需材料包括：新鲜血清（最好为无血浆白蛋白的血清）、离子交换剂（如DEAE-cellulose）、蛋白质标准（如BSA）、分光光度计、透析袋、高速离心机、冰箱和超纯水系统。
2.方法（1）血清预处理：将新鲜血清放入冰箱冷藏，去除其中的纤维蛋白原等杂质。
（2）离子交换：将预处理过的血清加入离子交换剂DEAE-cellulose中，用缓冲液进行流动洗脱，将γ球蛋白与其他低分子量蛋白质分离。
（3）透析：将离子交换步骤得到的γ球蛋白溶液放入透析袋中，置于超纯水中进行透析，去除离子和盐类杂质。
（4）高速离心：将透析后的γ球蛋白溶液放入高速离心机中，进行高速离心，以进一步去除残留的杂质。
（5）纯度检测：利用分光光度计检测离心后的γ球蛋白溶液的纯度。
若纯度不达标，重复上述步骤进行再次纯化。
三、结果与分析通过上述步骤，我们可以成功地分离并纯化出血清γ球蛋白。
表1显示了纯化后血清γ球蛋白的主要理化性质和生物学特性。
表1：纯化后血清γ球蛋白的主要理化性质和生物学特性等电点、氨基酸序列等理化性质方面与标准品一致，免疫活性和抗原表位完整性检测也呈阳性，说明我们成功地得到了具有生物学活性的血清γ球蛋白。
四、讨论与展望本次实验成功地分离和纯化了血清γ球蛋白，为进一步研究其生物学特性和应用奠定了基础。
但实验仍有改进空间，如尝试使用其他类型的离子交换剂或凝胶过滤方法进行进一步的纯化，以提高蛋白质的纯度和收率。
未来研究可以探索优化实验条件，提高血清γ球蛋白的纯度和产量，以便更好地应用于临床研究和治疗中。
五、结论通过离子交换和透析等步骤，我们成功地分离和纯化了血清γ球蛋白，并验证了其理化性质和生物学活性。
【生物化学实验】血清γ球蛋白分离纯化与鉴定
物理、化学性质的不同而建立的方法，其中有盐析、
离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳、离心等。
在分离纯化时，根据情况选用几种方法，相互配合才
能达到分离纯化一种蛋白质的目的。
血清γ 球蛋白的分离纯化与鉴定
【实验原理】
本实验采用硫酸铵盐析、葡聚糖凝 胶过滤、离子交换层析方法，分离纯化 血清γ-球蛋白。最后用醋酸纤维素薄膜 电泳法鉴定γ-球蛋白的纯度。
使表面平整。
▲ 加样与洗脱
1、加样：用滴管将盐析后样品加入柱床面，打开出口使样品 溶液渗入凝胶。 2、洗脱：加入洗脱液，打开出口，保持流速10滴/min，收 集洗脱液，用钠氏试剂检测胺。 3、保存：检测洗脱液的蛋白质量，保存含量高的进一步纯化
▲ 凝胶的再生
不断加洗脱液，使铵全部流出，为下次实验做准备。
多个正电荷游离碱基的聚合物，所以主要靠静电吸引与
带负电的蛋白质形成离子键，对蛋白质提纯有很大好处
量大的物质则被排阻在交联网状物之外，沿着凝胶颗粒间的孔
隙随溶剂流动，其流程短，移动速度快，先流出层析床。经过 分部收集流出液，分子量不x)
应用最多的凝胶！
交联度 网状结构 网孔径 吸水量 机械强度 耐压力 大
小
致密
疏松
小
大
小
大
大
小
高
低
操作步骤：
▲ Sephadex G-50的准备 ▲ 装柱（15~20cm）
一、盐析法粗分离血清γ -球蛋白
原理
盐析法是根据不同蛋白质在一定浓度的盐溶 液中溶解度度不同，从而分别析出，达到彼此分 离的分离方法。
本实验在半饱和硫酸铵溶液中，清蛋白溶解， 球蛋白将沉淀析出，经离心所得的沉淀即为球蛋 白的粗提液。
血清蛋白、-球蛋白的分离纯化与鉴定
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离纯化与鉴定之答禄夫天创作（一）血清清蛋白、γ-球蛋白的分离与纯化【目的要求】1．了解蛋白质分离提纯的总体思路。
2．掌握盐析法、分子筛层析、离子交换层析等实验原理及操纵技术。
【实验原理】血清中含有清蛋白和各种球蛋白（α-β-γ-球蛋白等），由于它们所带电荷分歧、相对分子质量分歧，在高浓度盐溶液中的溶解度分歧，因此可利用它们在中性盐溶液中溶解度的差别而进行沉淀分离，此法称为盐析法。
本实验应用分歧浓度硫酸铵分段盐析法可将血清中清蛋白、球蛋白初步分离。
在半饱和硫酸铵溶液中，血清清蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心后清蛋白主要在上清液中，沉淀的球蛋白加少量水可使其重新溶解。
用盐析法分离而得的蛋白质含有大量的硫酸铵，会妨碍蛋白质的进一步纯化，因此必须去除，经常使用的有透析法、凝胶过滤法等。
本实验采取凝胶过滤法，该法是利用蛋白质与无机盐类之间相对分子质量的差别除去粗制品中盐类。
脱盐后的蛋白质溶液再经DEAE纤维素层析柱进一步纯化。
DEAE纤维素为阴离子交换剂，在pH 6.5的条件下带有正电荷，能吸附带负电荷的α-球蛋白和β-球蛋白（pl分别为4.9、5.06和5.12），而γ-球蛋白（pl7.3）在此条件下带正电荷，不被吸附故直接从层析柱流出，此时收集的流出液即为纯化的γ-球蛋白。
提高醋酸铵溶液的浓度到0.06 mol/L，DEAE纤维素层析柱上的ß-球蛋白及部分a-球蛋白可被洗脱下来。
将醋酸铵溶液的浓度提高至，则清蛋白被洗脱下来，此时收集的流出液即为较纯的清蛋白。
经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的清蛋白、γ－球蛋白液往往体积较大，样品质量分数较低。
为便于鉴定，常需浓缩。
浓缩的方法很多，本实验选用聚乙二醇透析浓缩的方法。
血清清蛋白、γ-球蛋白分离纯化后，选用醋酸纤维薄膜电泳法鉴定其纯度。
【试剂与器材】1.试剂.（1）饱和硫酸铵溶液：称取固体硫酸铵850g加入1000mL蒸馏水中，在70~80℃下搅拌促熔，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵液。
血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定
蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 不同蛋白质的相对分子质量、溶解度及在一定条件下带电荷的情况均有 所不同。利用这些性质的差别，可分离并纯化各种蛋白质。 血清含有白蛋白及球蛋白，可用硫酸铵分段盐析法初步分离。半饱 和硫酸铵可使球蛋白沉淀，而白蛋白仍溶解在溶液中,经离心后可将二者 分离。 分离得到的球蛋白含有大量硫酸铵,会影响蛋白质的后续纯化，经葡 聚糖凝胶G-25Sephadex G-25 )层析可除去硫酸铵。脱盐后的球蛋白再经 DEAE( 二乙基氨基乙基)纤维素明离子交换层析而被进一步纯化。 由于纯化后蛋白质的体积较大，浓度较低，常需浓缩。本实验选用 聚乙醇2000 浓缩的方法。纯化前后的球蛋白可用电泳方法进行比较鉴定。
02
蛋白质的鉴定
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血清中各种蛋白质的等电点大都低于7.0在pH8.6的缓冲液中，它们 大都以阴离子形式存在，在电场中向正极移动。由于各种蛋白质的pI不 同，在同一pH下带电荷量也有所差异，同时各蛋白质的分子大小与分 子形状也不相同。因此，在同一电场中泳动速度也不同，从而得到分离. 醋酸纤维素薄膜电泳( CAME)一般能将血清蛋白分离为5 条区带， 从正极端起依次为白蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、B-球蛋白及y-球蛋 白。染色时染料与蛋白质特异结合而不与醋酸纤维素膜结合，染色深浅 与蛋白质的量成正比，染色一段时间后将各蛋白区带剪下经脱色、比色 或经透明处理后直接用光密度计扫描，即可计算出血清中各蛋白质组分 的相对百分数。
A=KCL
其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度； K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度
血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定
阳离子交换剂具有带负电荷的酸性基团作 为离子交换基团，能吸附流动相中的阳离 子。
阴离子交换剂具有带正电荷的碱性基团作 为离子交换基团，能吸附流动相中的阴离 子。
0.02M NH4AC
AC-
++
AC-
+
AC- + AC++
AC- AC-
蛋白样品
NH4AC
-
++ -
- +-
- +-
++
- --
AC-
原理: 当高浓度盐存在时，蛋白质往往凝 聚并析出沉淀。该技术为“盐析”。
• 不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀。在 半饱和硫酸铵溶液中，血清球蛋白会沉淀，经 离心后，可与白蛋白分离开。
• 影响因素：PH、温度、蛋白质纯度等。 • 逐渐改变硫酸铵浓度可分段盐析出不同的蛋白。
操作
一、盐析
－－ 白蛋白、γ球蛋白的粗分离
血清白蛋白、γ-球蛋白 的分离、纯化及鉴定
分离纯化的一般程序
选择材料 破碎细胞
提取 （预处理） 分离纯化 （粗分级，细分级） 分析及鉴定
实验目的
通过从血清中分离、纯化、鉴定血 清白蛋白和γ-球蛋白的实验，培养学 生综合应用盐析、离心、色谱、电泳 分光等技术来分离纯化特定蛋白质的 技能。
实验原理
++
AC-
+
AC- + AC- 阴离子交换剂 ++
AC- AC- γ-球蛋白带正电
NH4+
+ +
得到纯化的γ-球蛋白
白蛋白,α、β
球蛋白带负电
-
-
血清清蛋白、γ-球蛋白分离、纯化与纯度鉴定
血清清蛋白、γ-球蛋白分离、纯化与纯度鉴定一、实验目的1.掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法2.掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法3.掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4.掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法5.学习柱层析技术二、实验原理蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。
不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。
利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。
（一）粗提原理-盐析法1.盐析法：在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度，或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。
2.水化膜减弱、消失。
蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。
3.蛋白质表面的电荷大量被中和。
中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。
4.由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。
（二）脱盐原理-凝胶层析1.盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐后才能进一步纯化。
2.凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大小的不同而将其分离的技术。
（三）纯化原理-离子交换层析离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。
（四）纯度鉴定-醋酸纤维素薄膜电泳血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。
它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。
由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。
因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
三、材料与方法：（一）实验材料1.样品：人混合血清2.试剂：葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)层析柱、二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素离子交换层析柱、各不同浓度的pH6.5醋酸铵缓冲溶液、pH8.6巴比妥缓冲溶液、氨基黑10B染色液、20%磺基水杨酸溶液、饱和硫酸铵溶液、1%BaCl2溶液、漂洗液器材：层析柱、电泳仪、电泳槽、离心机、离心管、黑色反应板等（二）实验方法1.实验步骤2.注意事项✓上样时，滴管应沿柱上端内壁加入样品，动作应轻、慢，勿将柱床冲起。
血清球蛋白的分离纯化与鉴定
实验血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定【实验目的】1.熟悉蛋白质分离提纯的技术路线2.掌握盐析、凝胶过滤层析、离子交换层析等实验原理及操作技术。
【实验原理】血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、α_1 -球蛋白、α_2 -球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白室一类结构及功能相似的蛋白质，绝大多数免疫球蛋白属于γ-球蛋白，因此γ-球蛋白的分离纯化在医学研究中非常重要。
蛋白质的分离纯化室研究蛋白质结构及其生物功能的重要手段。
分离提纯γ-球蛋白时，首先利用各种清蛋白在中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离，因为中性盐可使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定因素去除而沉淀。
半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，而33%的饱和硫酸铵溶液只能使γ-球蛋白沉淀，α-球蛋白和β-球蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离，沉淀部分即为含有γ-球蛋白的醋制品。
用盐析法分离而得的γ-球蛋白中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此必须去除。
常用的方法有透析法、凝胶层析（凝胶过滤）法等。
本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异将蛋白质与无机盐分离。
当溶液通过SephadexG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在凝胶柱中会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。
脱盐后的蛋白质溶液可能仍含有其他球蛋白，利用它们等电点的不同，通过DEAE（二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析可进一步分离、纯化出γ-球蛋白。
因为α-球蛋白、β-球蛋白的pI﹤6.0；γ-球蛋白的pI为7.2左右。
因此，在pH6.3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同，经DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合；而带正电的γ-球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合从而直接从层析柱流出。
血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定-lhy-图文
1）
饱和(NH4)2SO4 1ml
弃上清
取1ml血清
静置5min
作1ml标记线
3500r/min 5min
边加边摇！
加PBS溶解沉淀至1ml
2）
饱和(NH4)2SO4 0.5ml
静置5min
弃上清
3500r/min 5min 边加边摇！
加PBS 0.5ml溶解沉淀
2.脱盐
1） 装柱
排气、调整凝胶浓度、装柱
无光泽面点样、量少、一次、迅速
3）上槽 点样面朝下、点样线勿接触滤纸桥,置负极
4）电泳 120V；40min
5）染色 丽春红染色液中浸泡 2min
6）漂洗 依次进行三次漂洗, 至背景无色
蛋白双缩脲法定量 （见P159）
肽键 ＋Cu2+
OH-
紫红色复合物
蛋白质浓度与A540呈正比
试剂
空白管 标准管 测定管1 测定管2
4.64
5.06
5.06
5.12
6.85~7.5
分子量（ 6~9
5~20
30
×104）
含量（% 60~70 2~3.5
4~7
）
电泳缓冲液: pH=8.6 血清蛋白泳动方向？ 各种血清蛋白泳动顺序？~18
电泳操作
1）电泳前准备 2）点样（ 各组点γ-球蛋白液、每个电泳槽点2份血清）
二、结果 1.脱盐检测结果
1）纳氏试剂、双缩脲试剂颜色反应结果（半定量） 2）收集哪些洗脱液用于鉴定
2.电泳鉴定结果
绘出血清和γ-球蛋白液电泳结果
3.双缩脲法定量鉴定结果
计算γ-球蛋白液浓度
三、讨论 根据结果评价分离效果, 分析原因
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
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凝胶层析的基本原理
交联葡聚糖凝胶
其商品名为Sephadex G系列 G—交联度：G后面的阿拉伯数字表示不同的规 格型号，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75， G-100，G-150，和G-200八种，具体含义为凝 胶得水值的10倍或吸水量（g）/10g干胶。 交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔径 越小，吸水性小；交联度越小，孔径越大，吸 水性大。
铅笔标记 ，垂直点样
半干燥 态
+
保持膜不下垂
交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数
凝胶型号 颗粒大小（μm) 溶胀体积(ml/g) 分离范围（Mr） G-10 G-15 G-25 40～120 50～150 50～150 2～3 2.5～3.5 4～6 ＜7×102 ＜1.5×103 1×103 ～5×103
G-50
G-75
40～120
40～120
9～11
12～15
1.5×103 ～ 3×104
3×103 ～ 8×104
G-100
40～120
15～20
4×103 ～ 1×105
长链状葡聚糖分子间以环氧丙烷连接
分段盐析
分段盐析：各种蛋白大小、亲水程度、 pI不同，所需的盐浓度、pH也不一样。 如清蛋白分子小，亲水性强，需高盐浓 度才沉淀，球蛋白分子大，亲水性弱， 较低盐浓度即可沉淀。因此调节盐浓度 及pH可使各种蛋白质分段沉淀。
凝胶层析脱盐
固定相：sephadex G-25 流动相：pH7.4的 0.01M磷酸盐缓冲液 （0.9%NaCl）
浓缩
sephadex G-25吸水，利用高分子 性质。
操作注意事项
1．硫酸铵的滴加，边摇边逐滴加入 2．流洗柱子：3～4个柱长 3．上样：转圈滴加，起跑线一致 4．防止柱上液层干涸(两人合作） 5．洗脱液收集无需分步，用载玻片检 测蛋白。 6．G-25干胶用纸条少量多次加入，液 层高<0.5ml 7. 用过的G-25干胶倒入收集缸，回收 利用。
影响因素
*层析柱的选择及装填： 柱大小—分离样品量 凝胶型号—分辨率：各种分子筛的孔隙大小分 布有一定范围，有最大极限和最小极限。凝胶 分离范围之外的分子，难以分离。如大小不同 的两种全排阻分子/完全渗透分子 *洗脱液：溶解待分离物质，不变性 *加样量：1%～5% *凝胶的再生
蛋白质的分离依据
生命高分子：透析、超滤、超离心、凝胶层析 蛋白质的胶体性质：稳定因素为水化膜和电荷 →盐析/有机溶剂沉淀 两性电解质和等电点：pH> pI，蛋白质带负电； 反之带正电→电泳、离子交换层析 有一定的功能：抗原性→ 免疫沉淀、亲和层析
血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定
清蛋白 血 清 pI=4.9 57%～72%
α1 α2 球蛋白
β γ pI=7.3
2%～5% pI<6 4%～9%
6.5%～12% 2%～20%
实验思路
分段盐析去除杂蛋白 上 午 完 成 下午 完成
先 粗 后 细
凝胶层析脱盐
交联葡聚糖吸水浓缩 醋酸纤维素薄膜电泳鉴定
鉴定：醋酸纤维素薄膜电泳
蛋白质电泳的原理：
COO╱ + H+ Pr ╲ + OHNH2 pH>pI
实验三
血清γ球蛋白的分离纯化 与鉴定
层析技术（Chromatography)
层析法也称色Biblioteka 法，是1903年俄国植物学家 Michael Tswett发现并命名的。将植物色素溶液通过装 有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素 以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。
用色彩（chroma）和 图谱（graphs）组成 色谱一词 （Chromatography)
层析技术（Chromatography)
依据：混合物中各组分的理化性质 差异—吸附力、分子形状、大小、 酸碱性或分子极性、分子亲和力以 及分配系数。
基本原理
固定相—固定不动 流动相—对固定相作单向相对运动，推动 样品中各组分通过固定相向前移动。各组 分理化性质不同，对流动相和固定相具有 不同的作用力，因此在流动相推动样品通 过固定相的过程中，通过不断地吸附、解 吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各组 分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。
鉴定：醋酸纤维素薄膜电泳
清蛋白 α1
α2 球蛋白 β 6.5%～12%
pI=4.9
57%～72% 2%～5%
4%～9%
pI<6
γ
pI=7.3
2%～20%
清蛋白 1 2 加样线
对照
样品
纯化蛋白 加样线
鉴定：醋酸纤维素薄膜电泳
【操作步骤】 1．点样：取经巴比妥缓冲液浸透的2×8cm薄膜，滤纸 吸去表面多余水分，在无光泽面距一端2cm处用铅笔划 一加样线，写上编号。小滤纸片蘸取血清/样品，垂直 压在加样线上，待样品渗入薄膜，无光泽面向下平贴 在电泳槽支架的盐桥上，静臵5～10分钟平衡。点样端 臵阴极，盖上盖子。 2．通电：接通电源，调节电压为40～50V，通电2 ～ 2.5h，关闭电源，停止电泳。 3．染色：薄膜浸入氨基黑B染色液2～5分钟。 4．漂洗：取出薄膜在漂洗液中漂洗4～5次，至无蛋白 区完全脱色为止。取出，用滤纸吸干液体。观察。
分类
①流动相的物理状态：气相和液相 → 气固/液，液固/液 ②操作方式：纸、薄层、柱 ③分离原理：吸附、分配、凝胶、离子 交换、亲和、金属螯合、疏水、反相
凝胶层析(凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层
析、分子排阻层析)
定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱 时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分 离的技术。 基本原理： 固定相：凝胶，惰性三维空间多孔网状结构， 故称分子筛，包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙 烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝胶。 流动相：洗脱液
阳离子
COO╱ + H+ Pr ╲ + OHNH3+ pH=pI
兼性离子
COOH ╱ Pr ╲ NH3+ pH<pI
阴离子
鉴定：醋酸纤维素薄膜电泳
介质：醋酸纤维素薄膜，纤维素的羟基 经乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。溶于 有机溶剂后涂成薄膜，具均一的泡沫状 结构，有强渗透性。
电泳缓冲液：pH8.6的巴比妥缓冲液
常用中性盐：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠 、氯化钠、磷酸钠等。
分段盐析
影响因素 ①温度：温度与溶解度成正比。一般室 温即可,少数温度敏感型蛋白质需4度操 作，而血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在 25度比0度时溶解度低，更易盐析。 ②pH值：大多数蛋白质在pI时溶解度最 低。pH=pI效果更好。 ③蛋白质浓度：浓度高时产生共沉。盐 析前血清加等量生理盐水稀释，控制蛋 白质含量在2.5-3.0%。