实验四.福林—酚试剂法测定血清总蛋白
蛋白质的定量测定—福林-酚试剂法
蛋白质的定量测定—福林-酚试剂法一、实验目的：1、学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。
2、掌握分光光度法制作标准曲线，准确测定未知样品的蛋白质含量。
3、掌握分光光度计的使用方法。
二、实验原理：Folin-酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。
甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。
蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用,生成蛋白-Cu2+紫红色络合物。
乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸,硫酸,溴等组成。
此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈深蓝色反应，在一定条件下，深蓝色强度与蛋白质浓度成正比。
三、实验步骤：取洁净干试管7支，按下表操作：30分钟后，以空白管对照，于660nm处比色，读取吸光度值。
四、结果与分析：1.吸光度A660值表2.绘制标准曲线以纵座标为吸光度，横座标为蛋白质浓度，绘制标准曲线，如下图：由图可知直线方程为y=5.6741x，待测管吸光度值为0.105，即y=0.105时，x=0.105/5.6741=0.0185g/L样品蛋白浓度（g/L）=0.0185×6.5×500=60.13g/L3.标准管法求浓度2号标准管与待测管吸光度相近，代入公式计算：样品蛋白浓度（g/L）=(0.105/0.087)×0.25×(0.4/1.0)×500=60.34g/L五、讨论1.如果只用乙试剂而不用甲试剂，也可以发生颜色反应，只是所要耗费时间较长。
2.甲试剂在本实验中起提供碱性环境的作用，其中的Cu2+还起到类似于催化剂作用，使反应更快显色。
3.福林-酚试剂法的主要缺点在于此法对蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量有要求，如果没有酪氨酸和色氨酸的话就无法显色。
4.所用试管一定要干净、干燥，否则即便是微量也会对反应体系造成影响，影响颜色变化，最终影响吸光度的测定。
5.加入试剂乙混匀后静置30min，使氧化还原反应充分反应。
蛋白质浓度测定(folin酚法)
实验目的：
熟悉并掌握福林-酚法测定蛋白质浓度的原理和方法。
实验原理：
蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与Folin-酚试剂起氧 化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比，可 用比色法测定蛋白质浓度。
实验器材：
样品血清（稀释200倍） 标准酪蛋白溶液（200ug/ml） Folin-酚甲液：
白 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 —— —— —— 血清 —— —— —— —— —— —— 0.2 0.2 0.2
水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.8 0.8
Folin 酚甲
5ml，30摄氏度水浴10min
Folin 酚乙
0.5ml，30摄氏度水浴30min
2、 用可见处的吸光度。
3、 以蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 4、 由样品吸光度在标准曲线中找出样品浓度。
实验结果：
试剂 1 2 3 4 5 6 7 8 9
酪蛋 白 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 —— —— ——
血清 —— —— —— —— —— —— 0.2 0.2 0.2
水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.8 0.8
Folin 酚甲
5ml，30摄氏度水浴10min
Folin 酚乙
0.5ml，30摄氏度水浴30min
A640 0 0.131 0.234 0.325 0.407 0.515 0.289 0.296 0.272
A 4%Na2CO3：0.2mol/lNaOH=1:1 B 1%CuSO4:2%酒石酸钾钠=1:1 A:B=50:1 混匀 Folin-酚乙液 可见分光光度计、试管（9支）、移液枪、移液管、烧杯、希尔球。
福林酚法测蛋白质含量 蛋白质含量的测定
福林酚法测蛋白质含量蛋白质含量的测定蛋白质是生命的物质基础，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。
因此，准确测定蛋白质的含量在生物化学、临床医学、食品科学等领域都具有重要的意义。
福林酚法是一种常用的测定蛋白质含量的方法，它具有灵敏度高、准确性好等优点。
接下来，让我们详细了解一下福林酚法测蛋白质含量的原理、操作步骤以及注意事项。
一、福林酚法的原理福林酚法的基本原理是基于蛋白质中的肽键在碱性条件下与铜离子形成络合物，然后此络合物将磷钼酸和磷钨酸还原成蓝色的化合物。
蓝色化合物的颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，通过比色法即可测定蛋白质的含量。
具体来说，首先在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜离子反应生成紫色的络合物。
然后，加入福林酚试剂，福林酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸被络合物中的铜离子还原，生成蓝色的混合物。
蓝色的深浅与蛋白质的量成正比，通过分光光度计在一定波长下测定吸光度，就可以计算出蛋白质的含量。
二、实验材料和仪器1、实验材料标准蛋白质溶液：通常使用牛血清白蛋白（BSA）配制一系列不同浓度的标准溶液。
待测蛋白质样品：需要测定含量的蛋白质溶液。
福林酚试剂：由 A 液和 B 液组成，使用前按一定比例混合。
碱性铜溶液：包括碳酸钠、氢氧化钠和硫酸铜等成分。
2、实验仪器分光光度计：用于测定溶液的吸光度。
移液器：准确移取不同体积的溶液。
容量瓶：用于配制标准溶液和待测样品溶液。
离心管：用于离心样品。
恒温水浴锅：控制反应温度。
三、实验操作步骤1、标准曲线的绘制准备一系列不同浓度的标准蛋白质溶液，例如0、20、40、60、80、100 μg/mL 的 BSA 溶液。
分别取不同浓度的标准蛋白质溶液 1 mL 于试管中，加入 5 mL 碱性铜溶液，摇匀，在室温下放置 10 分钟。
然后加入 05 mL 福林酚试剂，立即摇匀，在 30 60 分钟内，以空白管（即只加试剂但不加蛋白质溶液的试管）为对照，在分光光度计上于 650 nm 波长处测定吸光度。
血中蛋白测定实验报告
一、实验目的1. 掌握血中蛋白测定的原理和方法。
2. 了解血中蛋白测定的临床意义。
3. 熟悉实验操作流程，提高实验技能。
二、实验原理血中蛋白测定是通过对血清中蛋白质含量的测定，了解人体内蛋白质代谢状况和生理功能。
血清中蛋白质主要包括白蛋白、球蛋白和纤维蛋白原等。
本实验采用双缩脲法测定血清白蛋白含量，该方法原理为：血清中蛋白质的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。
此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应。
这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系。
三、实验材料与仪器1. 仪器：分光光度计、7支试管、1毫升刻度吸管3支、移液器、坐标纸。
2. 试剂：6mol/L的NaOH、双缩脲试剂、9g/L的NaCl溶液、蛋白质标准液（10g/L）、待测血清样本。
四、实验步骤1. 准备标准曲线：取7支试管，编号，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL蛋白质标准液，然后加入6mol/L的NaOH溶液1mL，混匀。
再分别加入双缩脲试剂A液1mL，混匀。
最后加入双缩脲试剂B液4mL，混匀。
室温放置10分钟，以0号管为空白，在540nm波长处测定各管的吸光度。
2. 绘制标准曲线：以各管蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
3. 待测血清蛋白含量测定：取7支试管，编号，分别加入0.2mL待测血清样本，按照标准曲线的制作方法进行操作。
室温放置10分钟，以0号管为空白，在540nm波长处测定各管的吸光度。
4. 由标准曲线查出待测血清蛋白含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 待测血清蛋白含量测定：根据标准曲线，查出待测血清蛋白含量。
六、实验结论本实验通过双缩脲法成功测定了待测血清样本中的白蛋白含量，实验结果与理论值基本相符。
实验四福林—酚试剂法测定血清总蛋白
思考题
什么叫标准曲线？
绘制标准曲线有何实用意义？
➢ 实验项目 ➢ 实验原理 ➢ 试剂和器材 ➢ 操作方法（主要步骤） ➢ 结果分析 ➢ 思考题
预习
实验五 酶法测血清葡萄糖
标准管对照法
选一管与待测管吸光度相近的作为标准
管，根据公式计算：
待测血清蛋白含 量=
（g/L）
A待测 ×C标准 × V标准 ×500
A标准
V待测
注： V标准为标准管加入标准蛋白质的体积 V待测为待测管加入的待测血清的体积
实验结果标准管来自待测管管号 OD660nm
1
2
3
4
5
6
7
0 0.121 0.250 0.335 0.440 0.525 0.320
ε：摩尔吸光系数 A：物质的吸光度 l：液层的厚度 c：溶液的浓度
标准曲线法
在分光光度计测定范围内，配制一系列已知不 同浓度的标准溶液，在特定波长条件下分别测出 其吸光度值。以吸光度值为纵坐标，相应的溶液 浓度为横坐标在坐标纸上作出一条吸光度与浓度 成正比，并且通过原点的直线，即标准曲线，也 称C-A曲线
空白 (1)
(2) (3)
(4)
(5)
(6)
待测管 （7）
标准蛋白溶液(250µg/ml) -- 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 —
待测血清 蒸馏水 试剂甲
— — — — — — 1.0
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
--
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
混匀后室温放置20分钟
人血清中蛋白质的正常范围为60-80g/L
标准曲线法比标准管法精确，可消除 各种原因引起的偏离吸收定律而造成的 误差，但是制作比较费时。
福林酚实验
福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度一、目的熟悉并掌握福林（Folin）—酚法测定蛋白质浓度的原理和方法。
二、原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。
蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。
三、实验仪器1.卵清蛋白片2.7220分光光度计3.试管4.移液管四、实验试剂1. Folin-酚试剂A：碱性铜溶液甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中乙液：取CuSO4.5H2O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100ml中。
临用时按甲：乙=50：1混合使用。
2. Folin-酚试剂B：将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml85%磷酸继100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。
冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。
临用时，用1mol/l 的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。
3. 1mg/mL牛血清蛋白液：称取1g牛血清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并稀释至1000ml四、实验步骤1.标准曲线的绘制取7支干燥的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。
0.10.20.30.40.450.5牛血清蛋白液OD500摇匀，在室温下放置30分钟后在500nm下比色0.50.50.50.50.50.50.50.5Folin-酚试剂B摇匀，在室温下放置10分钟0.5（样液）4.00.54.00.44.00.34.00.24.00.14.00.054.04.0(1mg/ml)ml蒸馏水ml Folin-酚试剂A样品7654321管号2.样品测定准确吸取样液0.5ml于干燥的试管中，同样按下表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。
福林酚试剂法测定蛋白质
加入0.1 mL稀释的Folin试剂前计算NaOH浓度。除标注 外，Folin试剂终浓度为3 %，Na2CO3为1.6 %。直到Folin试剂 加入前几秒，所有样品（Cu处理蛋白质）的组成相同（见正 文）。蛋白质终浓度为12 μg/mL。 2.3 消光系数和比例
mol/L 图3 碱浓度对最终色生成的影响
主要做到以下3点：（1）当将Folin试剂加到Cu处理的 蛋白质中时，pH 10左右还原显最大色。（2）在此pH下，试 剂的活性只维持很短时间[16]。因此，即使完全混匀仅延迟
表1 不同方法处理的蛋白质的消光系数
当量消光系数e750（或550）是指在波长750（或550）nm处，1 L中1 mol N的吸光度（A）。采用Miller和Houghton[24]的凯氏 操作测定氮。双缩脲显色通过Weichselbaum[25]试剂。蛋白质的来源：结晶胰蛋白酶，结晶糜蛋白酶和结晶牛血清白蛋白，Armour 公司，芝加哥；细胞色素c，Sigma化学公司，圣路易斯；结晶锌胰岛素，礼来公司，印第安纳波利斯；明胶，Difco试验室有限 公司，底特律；L-酪氨酸，伊斯曼公司，罗切斯特。
大样本或较难处理的沉淀物，需要在1 mol/L碱溶液中 100 ℃加热10 min以上。虽然这样会造成结果低估，但可重 复性强，且可用经相同处理的标准溶液进行测定2（注释2 见正文最后）。 1.4 微量分析
生化实验报告 福林-酚试剂法测定蛋白质的浓度
生化实验报告福林-酚试剂法测定蛋白质的浓度实验目的：利用福林-酚试剂法测定蛋白质的浓度。
实验原理：福林-酚试剂法是一种常用的蛋白质定量方法。
该方法利用在碱性条件下，蛋白质和福林-酚试剂在高温下反应生成可溶性淡红色复合物，其最大吸收峰位于560 nm。
该复合物的吸光度与蛋白质的浓度呈线性关系，可以通过比较不同浓度蛋白质标准溶液的吸光度来测定待测蛋白质的浓度。
实验步骤：1. 准备蛋白质标准溶液：称取不同浓度的蛋白质标准溶液（如1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL等）分别加入福林-酚试剂，使得最终浓度为0.2 mg/mL，并用称重瓶搅拌均匀。
2. 制备待测蛋白质样品：将待测蛋白质样品溶解在适量的缓冲液中，使其浓度在标准曲线的线性范围内。
3. 加入福林-酚试剂：取相同体积的蛋白质标准溶液和待测蛋白质样品分别加入福林-酚试剂，并用试管架将其放入预热至60°C的水浴中反应15分钟。
4. 冷却：将试管从水浴中取出，放置到冰水中冷却至室温。
5. 测定吸光度：使用分光光度计将各个标准溶液和待测样品的吸光度分别置于560 nm处测量。
6. 建立标准曲线：依次将标准溶液的吸光度值绘制于纵轴，浓度值绘制于横轴，得到标准曲线。
7. 测定样品浓度：根据待测样品的吸光度值和标准曲线，确定其蛋白质浓度。
实验注意事项：1. 确保福林-酚试剂无色，否则应更换新的试剂。
2. 需要在60°C的水浴或恒温器中对试剂进行反应，确保反应温度稳定。
3. 温度过高或过低都会影响测定的准确性，应控制好试管在水浴中的时间。
4. 标准曲线的制备需要使用不同浓度的标准溶液，并且至少应包含一组空白对照组。
5. 测定待测样品时，应确保其在线性范围内，并尽量重复测定。
实验结果：根据实验步骤中的吸光度测定值和标准曲线的关系，可以得到样品中蛋白质的浓度。
实验结论：利用福林-酚试剂法可以测定蛋白质的浓度。
该方法简单、快速、灵敏度高，适用于常规蛋白质浓度的测定。
福林酚试剂原理
福林酚试剂原理
福林酚试剂是一种常用的生化试剂，主要用于检测蛋白质中的酚类物质。
其原理是利用福林酚试剂与蛋白质中的酚类物质发生氧化偶联反应，生成一种蓝色化合物，其吸收波长为650nm。
通过比色法测定蓝色化合物的吸光度，可以计算出蛋白质中酚类物质的含量。
福林酚试剂的制备方法比较简单，主要是将福林酚、酒精和硫酸混合后加入适量的水制成试剂。
在使用福林酚试剂时，需要注意控制pH值，避免出现误差。
此外，在测定过程中还需要注意控制氧化反应的时间和温度，以保证测定结果的准确性和可重复性。
福林酚试剂在生物化学研究、医学诊断等领域有着广泛的应用，是一种重要的实验室试剂。
- 1 -。
Folin-酚试剂法测蛋白质含量
实验1-3 蛋白质的定量测定（Folin-酚试剂法）一、实验原理1921年，Folin 首创Folin-酚试剂法，利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应；1951年，Lowry对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。
Folin-酚试剂法主要包括两步：第一步双缩脲反应在碱性溶液中，双缩脲（H2NOC－NH－CONH2）能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物，这个反应叫做双缩脲反应。
由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键, 因此有双缩脲反应。
即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。
第二步 Folin-酚显色反应Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。
由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸( Tyr ) ，故有此显色反应。
即蛋白质- Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。
在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出样品中蛋白质的含量。
另外，可以根据预先绘制的标准曲线求出待测样品中蛋白质的含量。
二、实验材料（一）样品液的制取10g样品加入100mL蒸馏水进行匀浆，离心后取上清液备用（或者振荡浸渍30min滤液备用）（二）试剂1．牛血清白蛋白标准液（1mg/mL）准确称取牛血清白蛋白粉末50.0mg，用0.1mol/L NaOH溶液润湿溶解，加蒸馏水到50mL。
2．碱性硫酸铜溶液(福林酚试剂A)①碱溶液：Na2CO32g 溶于100ml 0.1mol/L NaOH中。
②硫酸铜溶液：CuSO4∙5H2O 0.5g溶于100ml 35mmol/L(1%)酒石酸钾钠中。
使用前将①与②按50:1混合即成碱性硫酸铜溶液（福林酚试剂A）。
生化实验报告 福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度
实验三：福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度一、实验目的1．学会制备无蛋白血滤液。
2．掌握Folin－Wu法测定血糖含量的原理和方法。
3．掌握7200型可见分光光度计的使用方法。
二,实验原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。
蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。
三.实验仪器1．试管2．移液管3．卵清蛋白片4．7220分光光度计四.实验试剂1、碱性硫酸铜溶液A液：无水碳酸钠35g，酒石酸钠13g及碳酸氢钠11g溶于蒸馏水，稀释定容至1000ml.B液：硫酸铜晶体5g，溶于蒸馏水并定容至100ml。
临用时，A液：B液=9：1混合（体积比），混合液于冰箱中保存（4℃）。
2、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）(1)1%葡萄糖母液：称取1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml。
(2)葡萄糖标准液：取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。
3、10%钨酸钠溶液：称取钨酸钠10g，溶于蒸馏水并定容至100毫升。
4、0.33mol/LH2SO4溶液：于53ml蒸馏水中加入1ml的浓硫酸。
五.实验步骤1、无蛋白血滤液的制备：用奥氏吸管吸取全血（已加抗凝剂）1ml,缓缓放入100ml锥形瓶中，加蒸馏水7ml，摇匀，溶血后（血液变为红色透明）加10%钨酸钠1ml，摇匀.。
再加0.33mol/L H2SO41ml，边加边摇，加毕充分摇匀，放置5～15分钟，至沉淀变为暗棕色（如不变色可再加0.33mol/L H2SO41-2滴）。
用干滤纸过滤。
先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液不清需重新过滤。
每毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml全血。
2、血糖的定量测定：取25ml的血糖管3支，编号。
第一支血糖管中加入2ml蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加2ml标准葡萄糖液；用吸管吸取无蛋白血滤液2ml，放入第三支血糖管中。
福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度实验报告完整版
福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度一、原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。
蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。
二、实验仪器分光光度计,试管,移液管,容量瓶，分析天平，烧杯三、实验试剂1.Folin-酚试剂甲：碱性铜溶液甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中乙液：取CuSO4.5H2O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100ml。
临用时按甲：乙=50：1混合使用。
2.Folin-酚试剂乙：将10g钨酸钠、2.5g钼酸钠、70ml蒸馏水、5ml85%磷酸继10ml浓盐酸置于150ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏1小时，再加入硫酸锂15g，蒸馏水5ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。
冷却，稀释至100ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。
临用时，用1mol/l的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。
标准蛋白质溶液：称取1g牛（人）血清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并稀释至1000ml四、实验步骤1.标准曲线的绘制取7支干燥洁净的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。
各管加入1mlFo1in 酚试剂乙后，立即摇匀，放置15分钟后比色，在500nm 处记下各管光密度，以0号管为对照，以吸光度为纵坐标，标准蛋白质溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线2.样品测定准确吸取样液于干燥的试管中，同样按下表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。
室温放置10分钟后，再各加1毫升Fo1in 酚试剂乙，立即摇匀，放置15分钟，在500nm 处测定光密度值。
五、实验结果管号试剂 1 2样液（ml ） 1.0 1.0Folin-酚试剂甲 5.0 5.0（ml ）标准曲线的绘制：蛋白质浓度0.00 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 吸光度0.000 0.079 0.215 0.264 0.346 0.450 0.493则根据y=5.5072x=0.325得x为0.05901，则样液的浓度为0.5901mg/ml.六、实验结果分析及思考1、试说明Folin-酚法的优缺点该方法较双缩脲法反应灵敏，与0.1mg/ml浓度的蛋白质样品亦可得到很好的显色反应，使用很广泛，但花费时间长，其干扰因素较多。
生物化学实验报告(实验四)
天津科技大学生物化学实验报告
专业：班级：
姓名学号组别第组
实验项目同组人
完成
时间
年月日
【实验名称】
《碱性蛋白酶活力的测定（福林-酚试剂法）》
【实验目的】
1、学习测定蛋白酶活力的方法。
2、学习并掌握标准曲线的绘制方法。
【实验原理】
常见酶活性酶活力测定的方法有终点法和动力学方法两类。
本实验使用终点法简便易行，是很多植物酶活力测定的常用方法。
福林—酚试剂是磷钼酸盐与磷钨酸盐的混合物。
它在碱性条件下不稳定，能被酪氨酸中的酚基还原，生成钼蓝、钨蓝的混合物。
酪蛋白在蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与福林—酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用比色法测定。
【材料与设备】
1、仪器设备
分光光度计,恒温水浴锅,冷凝器
2、材料
市售的碱性蛋白酶制剂
3、主要试剂
（1）0.4mo/L碳酸钠
（2）4mo1/L三氯醋酸
（3）2%酪蛋白：2.0g加40mL水，另加5滴浓氨水，沸水浴溶解。
（4）福林—酚试剂
成绩：教师签字：批阅日期：
DL-酪氨酸标准曲线示意图：酶活力计算：
【注意事项】
1、注意水浴时试管内溶液易倾洒
2、比色时做好空白对照
【思考题】
1、0.4mol/L碳酸钠和0.4mol/L三氯醋酸溶液的作用是什么?
2、为什么要把反应条件控制在pH值为11和温度为40℃?
3、稀释的酶溶液是否可以长期使用?为什么?。
福林酚实验
福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度一、目的熟悉并掌握福林（Folin）—酚法测定蛋白质浓度的原理和方法。
二、原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。
蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。
三、实验仪器1.卵清蛋白片2.7220分光光度计3.试管4.移液管四、实验试剂1. Folin-酚试剂A：碱性铜溶液甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中乙液：取CuSO4.5H2O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100ml中。
临用时按甲：乙=50：1混合使用。
2. Folin-酚试剂B：将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml85%磷酸继100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。
冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。
临用时，用1mol/l 的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。
3. 1mg/mL牛血清蛋白液：称取1g牛血清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并稀释至1000ml四、实验步骤1.标准曲线的绘制取7支干燥的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。
0.10.20.30.40.450.5牛血清蛋白液OD500摇匀，在室温下放置30分钟后在500nm下比色0.50.50.50.50.50.50.50.5Folin-酚试剂B摇匀，在室温下放置10分钟0.5（样液）4.00.54.00.44.00.34.00.24.00.14.00.054.04.0(1mg/ml)ml蒸馏水ml Folin-酚试剂A样品7654321管号2.样品测定准确吸取样液0.5ml于干燥的试管中，同样按下表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。
福林(Folin)-酚试剂法测定
将参比样品溶液和被测样 品溶液分别倒入比色皿中， 打开样品室盖，将盛有溶 液的比色皿分别插入比色 皿槽中，盖上样品室盖。 一般情况下，参比样品放 在第二个槽位中。 将0％T校具（黑体）置入 光路中，在T方式下按“0 ％T”键，此时显示器显示 “000.0”
四、实验步骤
1.标准曲线的绘制 取7支干燥的试管，编号，按下表加入试剂，比 色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标 作图。 2.样品测定 准确吸取样液0.5ml于干燥的试管中，同样按下 表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求 出样液的蛋白质浓度。
管号 牛血清蛋白液 (1mg/ml)ml 蒸馏水ml 蒸馏水 Folin-酚试剂 酚试剂A 酚试剂
摇匀，在室温下放置 分钟后在 分钟后在500nm下比色 摇匀，在室温下放置30分钟后在 下比色 OD500
蛋白质含量测定的方法有哪些，各有什么优 缺点？
下次试验：氨基酸纸层析和维生素C 下次试验：氨基酸纸层析和维生素 定量测定-2， ，二氯酚靛酚法。 定量测定 ，6，二氯酚靛酚法。
附：7200型分光光度计的操作程序
比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。因此， 比色皿的清洁程度 ， 直接影响实验结果 。 因此 ， 特 别要将比色皿清洗干净。装样前处理： 别要将比色皿清洗干净 。 装样前处理 ： 自来水反复 冲洗→蒸馏水漂洗2次 → 待装溶液漂洗 2次 。用完后 待装溶液漂洗2 冲洗 → 蒸馏水漂洗2 用自来水和蒸馏水洗净并用檫镜纸檫干放回比色皿 盒中。 盒中。
酚试剂法测定蛋白质含量实验报告
For personal use only in study and research; not forcommercial use生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：第七实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称Folin-酚试剂法测定蛋白质含量实验日期实验地点第七实验室合作者指导老师评分教师签名批改日期格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。
需强调的地方请用蓝颜色标出。
不得出现多行、多页空白现象。
一、实验目的1、掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其实验操作技术。
2、熟悉分光光度计的用法。
3、掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。
二、实验原理1、双缩脲反应：在碱性溶液中，双缩脲能与Cu2+作用,形成紫红色的络合物,而蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键，在与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质-Cu2+复合物。
2、Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，蛋白质-Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。
3、在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。
即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。
三、材料与方法：以流程图示意1、实验材料（1）样品健康人血清（300倍稀释）；正常人血清蛋白质含量：60~80 g/L（2）试剂牛血清白蛋白标准液（200μg/ml）；碱性硫酸铜溶液；Folin-酚试剂2、仪器与器材V-1100分光光度计；恒温水浴箱；试管6支、试管架；加样枪、加样枪架3、实验步骤（1）图示图一：Folin-酚试剂法测定蛋白质含量流程图（2）取6支试管做好标记，再按下表加样：（1为空白对照，2-5作标准，6为待测样品）试剂（ml) 1 2 3 4 5 6牛血清白蛋白标准液样品液（稀释300倍）蒸馏水--1.00.20-0.800.40-0.600.60-0.400.80-0.20-0.500.50碱性硫酸铜 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0表一：反应体系设置（3）加样时顺序加样，在1号试管加入碱性硫酸铜溶液2ml后开始计时，等待1分钟再往下一支试管加入等量的碱性硫酸铜溶液，摇匀。
福林酚_实验报告
1. 理解福林酚法测定蛋白质浓度的原理。
2. 掌握福林酚试剂的配制方法。
3. 学习使用分光光度计进行蛋白质定量分析。
4. 通过实验，提高实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理福林酚法是一种常用的蛋白质定量分析方法。
其原理基于蛋白质中的酪氨酸和色氨酸在碱性条件下与福林酚试剂反应，生成蓝色的复合物。
该复合物的颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，通过比色法可以测定蛋白质的浓度。
三、实验材料1. 标准蛋白质溶液（已知浓度）2. 待测蛋白质溶液3. 福林酚试剂4. 碱性铜试剂5. 0.1mol/L NaOH溶液6. 0.85mol/L H2SO4溶液7. 10% TCA溶液8. 1%牛血清白蛋白溶液9. 7200型可见分光光度计10. 移液器11. 试管12. 烧杯13. 移液管14. 实验记录表格1. 福林酚试剂的配制a. 称取10g钨酸钠、2.5g钼酸钠，加入70ml蒸馏水。
b. 加入5ml 85%磷酸和10ml浓盐酸，充分混匀。
c. 将混合溶液转移至150ml磨口圆底烧瓶中，接上磨口冷凝管，回馏1小时。
d. 加入15g硫酸锂和5ml蒸馏水，混匀。
2. 蛋白质样品的处理a. 取0.1ml标准蛋白质溶液，加入1.9ml 0.1mol/L NaOH溶液，混匀。
b. 取0.1ml待测蛋白质溶液，加入1.9ml 0.1mol/L NaOH溶液，混匀。
c. 将混合溶液转移至试管中，加入0.5ml福林酚试剂，混匀。
d. 室温下放置5分钟。
3. 碱性铜试剂的加入a. 取0.5ml碱性铜试剂，加入上述混合溶液中，混匀。
b. 室温下放置10分钟。
4. 比色测定a. 使用7200型可见分光光度计，在660nm波长下，测定样品的吸光度。
b. 以1%牛血清白蛋白溶液为空白对照，进行校正。
5. 结果计算a. 根据标准蛋白质溶液的吸光度，绘制标准曲线。
b. 根据待测蛋白质溶液的吸光度，从标准曲线上查得蛋白质浓度。
五、实验结果与分析1. 标准曲线的绘制：以标准蛋白质溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
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标准曲线法比标准管法精确， 标准曲线法比标准管法精确，可消 除各种原因引起的偏离吸收定律而造成 的误差，但是制作比较费时。 的误差，但是制作比较费时。 临床应用： 临床应用： 可用于成批样品的测定， 可用于成批样品的测定，简便省时
生物化学与分子生物学实验
临床意义： 临床意义：
血清总蛋白含量关系到血液与组织间水分 的分布情况，在机体脱水的情况下， 的分布情况，在机体脱水的情况下，血清总蛋 白质含量升高，而在机体发生水肿时， 白质含量升高，而在机体发生水肿时，血清蛋 白含量下降， 白含量下降，所以测定血清蛋白质含量具有临 床意义。 床意义。
朗伯比尔定律： 朗伯比尔定律： A=εc l
ε：摩尔吸光系数 ： l：液层的厚度 ： A：物质的吸光度 ： c：溶液的浓度 ：
生物化学与分子生物学实验
标准曲线法
在分光光度计测定范围内， 在分光光度计测定范围内，配制一系列已知 不同浓度的标准溶液，在特定波长条件下分别测 不同浓度的标准溶液， 出其吸光度值。 吸光度值为纵坐标 为纵坐标， 出其吸光度值。以吸光度值为纵坐标，相应的溶 液浓度为横坐标在坐标纸上作出一条吸光度与浓 液浓度为横坐标在坐标纸上作出一条吸光度与浓 度成正比，并且通过原点的直线， 标准曲线， 度成正比，并且通过原点的直线，即标准曲线， 也称C 也称C-A曲线
4 0.335
5 0.440
6 0.525
7 0.320
OD660nm
C血清=
V标准 0.320 A待测 0.6 ×500 C标准 ×0.25 × V待测 A标准 1 0.335
= 71.6 g/L
人血清中蛋白质的正常范围为60人血清中蛋白质的正常范围为60-80g/L 60
生物化学与分子生物学实验
空白 (1) 标准蛋白溶液(250µg/ml) 标准蛋白溶液(250µg/ml) 待测血清 蒸馏水 试剂甲 -— 1.0 3.0 (2) (3) 0.2 0.4 — — (4) 0.6 — 0.4 3.0 (5) 0.8 — 0.2 3.0 (6) 1.0 — 0 3.0 待测管 （7 ） — 1.0 -3.0
0.8 0.6 3.0 3.0
生物化学与分子生物学实验
混匀后室温放置20分3mL 在各试管中分别加入试剂乙0.3mL
立即摇匀
30分钟后以空白管 对照测其吸光值 660nm) 分钟后以空白管为 测其吸光值( 30分钟后以空白管为对照测其吸光值(660nm)
生物化学与分子生物学实验
实
验
四
福林—酚试剂法测定血清总蛋白 福林—
生物化学与分子生物学实验
实验目的
学习测定蛋白质浓度的测定方法 学习绘制标准曲线及用标准曲线求 待测物质含量的方法
生物化学与分子生物学实验
实验原理
蛋白质浓度测定 双缩脲法 微量凯氏定氮法 Folin-酚试剂法 Folin紫外吸收法
生物化学与分子生物学实验
生物化学与分子生物学实验
标 准 曲 线
A
A6 A5
＊ ＊ ＊
C2 C3 C C4
X
＊
AX
A4 A3 A2
＊
0
C5
C6
C
CX为根据待测样品的吸光值查标准曲线所得的 蛋白质浓度
生物化学与分子生物学实验
在图上查出待测管的浓度后， 在图上查出待测管的浓度后，按下列公式 进行计算： 进行计算：
待测血清蛋白含量 = g/L） （g/L） 或者 =
C7 ×4.3
1
×500
M7（µg） ×500
1000
生物化学与分子生物学实验
注意事项
作一条标准曲线至少要5 作一条标准曲线至少要5个点 被测物与标准物应在相同条件下测定 标准曲线中标准物浓度有一定的线性范围， 标准曲线中标准物浓度有一定的线性范围， 应使标准曲线范围在被测物质浓度的1/2～ 应使标准曲线范围在被测物质浓度的1/2～2倍 1/2 之间，并使吸光度在0.05～1.0范围为宜 之间，并使吸光度在0.05～1.0范围为宜 0.05
优 缺
点: 操作简便灵敏度高
有蛋白质特异性的影响； 点: 有蛋白质特异性的影响； 受多种因素干扰
生物化学与分子生物学实验
HEPES CHAPS 蔗糖 Tris缓冲液 Tris缓冲液 尿素 胍 硫酸钠 三氯乙酸 乙醇 丙酮 柠檬酸 酚类 干扰物质 EGTA EDTA 硫酸胺 Triton X-100 Xdithiothreitol
Step 1
Step 2
显色反应(蓝色) 在一定条件下，蓝色强度( 显色反应(蓝色)。在一定条件下，蓝色强度(A660) 与蛋白质的量成正比例
生物化学与分子生物学实验
可检测的最低蛋白质量达5 µg/ml， 可检测的最低蛋白质量达5 µg/ml，通常测定 范围是25 25范围是25-250 µg/ml
生物化学与分子生物学实验
计算及绘制标准曲线
标准曲线法 标准管对照法
生物化学与分子生物学实验
当某单色光通过溶液时， 当某单色光通过溶液时，其能量就会被 吸收而减弱， 吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的 浓度有一定的比例关系， 浓度有一定的比例关系，也即符合于比色 原理---朗伯-比耳定律 ---朗伯 原理---朗伯-比耳定律
生物化学与分子生物学实验
思考题
什么叫标准曲线？ 什么叫标准曲线？ 绘制标准曲线有何实用意义？ 绘制标准曲线有何实用意义？
生物化学与分子生物学实验
实验项目 实验原理 试剂和器材 操作方法（主要步骤） 操作方法（主要步骤） 结果分析 思考题
生物化学与分子生物学实验
预 习
实验五 酶法测血清葡萄糖
实验结果
标准管
待测管
生物化学与分子生物学实验
管号
1 0
2 0.121
3 0.250
4 0.335
5 0.440
6 0.525
7 0.320
OD660nm
AX
C血清=
149（µg）×500 M7（µg）
1000
MX
=
74.5（g/L） g/L）
生物化学与分子生物学实验
管号
1 0
2 0.121
3 0.250
生物化学与分子生物学实验
标准管对照法
选一管与待测管吸光度相近的作为标准 根据公式计算： 管，根据公式计算：
×500 待测血清蛋白含量 = ×C标准 × V待测 A标准 g/L） （g/L） 注： V标准为标准管加入标准蛋白质的体积 V待测为待测管加入的待测血清的体积 A待测 V标准
生物化学与分子生物学实验
生物化学与分子生物学实验
实验器材与试剂
大试管、刻度吸量管、 大试管、刻度吸量管、恒温水浴箱 722E型分光光度计 型分光光度计 试剂甲，试剂乙 试剂甲， 标准蛋白溶液（ 标准蛋白溶液（250µg/ml） ） 待测血清（稀释 倍 待测血清（稀释500倍）
生物化学与分子生物学实验
实验步骤
支洁净试管， 取7支洁净试管，按下表加入试剂
双缩脲法测定蛋白质
H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 ＋NH3
双缩脲
双缩脲反应： 双缩脲反应：
在碱性条件下， 在碱性条件下，双 缩脲可与铜离子结合生 成紫红色化合物。 紫红色化合物。
生物化学与分子生物学实验
具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双 肽键 缩脲反应，颜色深浅与其浓度成正比， 缩脲反应，颜色深浅与其浓度成正比，可用比 色法进行测定。 色法进行测定。 本法操作简单，重复性好，干扰物质少。 本法操作简单，重复性好，干扰物质少。 操作简单 但缺点是灵敏度较低 测定蛋白质范围为1 测定蛋白质范围为1-10mg
生物化学与分子生物学实验
微量凯氏定氮法
含氮化合物与浓硫酸共热分解产生氨， 含氮化合物与浓硫酸共热分解产生氨，氨与硫酸 反应生成硫酸铵。硫酸铵在强碱作用下分解生成氨； 反应生成硫酸铵。硫酸铵在强碱作用下分解生成氨； 用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中， 用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标 准酸溶液进行滴定， 准酸溶液进行滴定，所用无机酸的量相当于被测样品 中氨的量，从而可计算样品的含氮量。 中氨的量，从而可计算样品的含氮量。 蛋白质含氮量通常在16 %左右 左右， 蛋白质含氮量通常在16 %左右，将测得的含氮量 乘上6.25 便得到该样品的蛋白质含量。 6.25， 乘上6.25，便得到该样品的蛋白质含量。
生物化学与分子生物学实验
Folin—酚试剂法(Lowry Folin—酚试剂法(Lowry法) (Lowry法
蛋白质中含有酚基的酪氨酸， 蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可使酚试剂中的 磷钨酸— 磷钼酸还原而呈蓝色 磷钨酸— 磷钼酸还原而呈蓝色
碱性条件下蛋 白质与铜作用 生成蛋白质－ 生成蛋白质－ 铜复合物 蛋白质－铜 蛋白质－ 复合物使磷 钨酸—磷钼 钨酸 磷钼 酸还原