琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物

琼脂糖凝胶浓度对电泳结果的影响
总结词
琼脂糖凝胶浓度对DNA分子的迁移速度和分离效果具有重要影响。
详细描述
不同浓度的琼脂糖凝胶对DNA分子的迁移速度和分离效果不同。高浓度的琼脂糖凝胶可以增加DNA分子的阻力，减缓其迁移速度，从而提高分辨率。而低浓度的琼脂糖凝胶则会使DNA分子迁移速度加快，但分辨率降低。因此，应根据DNA分子的大小和数量选择合适的琼脂糖凝胶浓度。
可视化
通过染色剂染色，可以将DNA片段可视化，便于观察和记录结果。
缺点
分辨率有限
琼脂糖凝胶电泳的分辨率有限，对于一些长度相近的DNA片段可能无法区分。
易产生误差
由于操作过程中涉及到人为因素，如加样、凝胶制作等，容易产生误差。
对小片段DNA检测效果不佳
对于小片段的DNA，琼脂糖凝胶电泳的检测效果不佳，可能会漏检。
电泳温度对电泳结果的影响
总结词
电泳温度对DNA分子的运动速度和琼脂糖凝胶的黏度有影响，进而影响电泳结果。
详细描述
在一定范围内，较高的电泳温度可以提高DNA分子的运动速度，从而提高分辨率。但温度过高可能导致凝胶变形和DNA分子变性，影响电泳结果。因此，应根据DNA分子的大小和性质选择适宜的电泳温度。
在电场中，DNA分子会受到正极的吸引，向正极方向移动。
迁移速度与DNA分子大小相关
02
DNA分子越小，迁移速度越快；DNA分子越大，迁移速度越慢。
分离效果
03
通过琼脂糖凝胶的孔径大小和电场强度，可以将不同大小的
DNA分子进行分离。
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的原理
琼脂糖凝胶孔径大小
DNA染料染色
琼脂糖凝胶具有不同孔径大小，可分离不同大小的DNA分子。

琼脂糖凝胶电泳-完整整理

基因组分析
分子诊断
用于分离和鉴定基因组DNA片段，如限制性片段长度多态性分析、基因突变检测等。
用于检测和鉴定基因突变、病原微生物DNA 等，如聚合酶链式反应（PCR）产物电泳、单链构象多态性分析等。
基因克隆
测序
用于分离和纯化目的基模板，如末端测序、全基因组测序等。
达差异。
04 琼脂糖凝胶电泳实验问题与解决
常见问题
条带弥散
由于点样量过多或电压过高，导致条带弥散。
条带过宽
由于凝胶浓度不合适或样品浓度过高，导致条带过宽。
条带拖尾
样品中蛋白质降解或核酸酶污染，导致条带拖尾。
条带不亮
由于染料浓度过低或曝光时间过短，导致条带不亮。
问题分析
条带弥散
可能是由于点样量过多或电压过高，导致DNA在凝胶中扩散。
琼脂糖凝胶电泳-完整整理
目录
CONTENTS
• 琼脂糖凝胶电泳介绍 • 琼脂糖凝胶电泳实验操作 • 琼脂糖凝胶电泳结果分析 • 琼脂糖凝胶电泳实验问题与解决 •凝胶电泳的定义
01
琼脂糖凝胶电泳是指在琼脂糖凝胶中进行的电泳技术，主要用于分离、鉴定和纯化DNA片段。
浓度比较
通过条带亮度，比较不同样品中目标DNA片段的浓度。
纯度评估
根据条带的亮度与背景噪音的比例，评估DNA片段的纯度。
结果应用
基因克隆
01
通过琼脂糖凝胶电泳检测目的基因是否被正确克隆到载体中。
突变分析
02
利用电泳结果判断是否存在基因突变或点突变。
基因表达分析
03
通过比较不同组织或细胞系中目的基因的表达水平，分析其表
01
条带分析

琼脂糖凝胶的特点
（一）优点 1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等大分子物质。 4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定 6.有热可逆性
（三）结构特征
CM 甘油三脂胆固醇蛋白质带电量（Q） pH8.6为例颗粒大小（mm）密度电泳速度形态多多少少大低慢规则不规则 VLDL LDL HDL 少少多多小高快

pH 8.6 > pI ，各种脂蛋白均带负电，电泳时由负极到正极；VLDL为圆形，受阻力小，LDL形态不规则，受阻力大，所以VLDL 跑在前。
2. 按超速离心法分乳糜微粒(chylomicron,CM) ( < 0.96 ) 极低密度脂蛋白 (0.961.006) (very low density lipoprotein, VLDL) 中间密度脂蛋白 (1.0061.019) (intermediate density lipoprotein, IDL) 低密度脂蛋白LDL(1.0191.063) (low density lipoprotein, LDL) 高密度脂蛋白HDL(1.0631.21) (high density lipoprotein, HDL)
脂蛋白
血清脂蛋白(lipoprotein)的组成 ApoA ApoB 蛋白质：即载脂蛋白 ApoC ApoD ApoE
甘油三酯（TG）磷脂（PL）游离胆固醇（FC）胆固醇酯 1. 按电泳法分乳糜微粒（chylomicron,CM） -脂蛋白（-位）前-脂蛋白（2-位）） -脂蛋白（1-位）

琼脂糖凝胶电泳技术

电泳检测技术是指利用带电颗粒在电场中能向异性电极泳动这一现象来分离、纯化或分析检测供试品的一种生物化学技术。

原理：许多生物分子都带有电荷，在电场作用下可发生移动，由于混合物中各组分所带电荷性质、数量以及相对分子质量各不相同，使在同一电场作用下，各组分的泳动方向和速率也各有差异，所以在一定时间内，它们移动距离不同，从而可达到分离鉴定的目的。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，包括电荷效应和分子筛效应。

琼脂糖是由天然的琼脂加工制得，是一种直链杂聚多糖，溶于热水，形成溶胶，冷却后成为孔径范围从50nm到大于200nm的大网孔径凝胶。

由于孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，该电泳技术是目前分离、分析DNA片段的标准方法。

DNA琼脂糖凝胶电泳的原理DNA 分子是两性电解质，在高于其等电点的溶液（pH8.0~pH8.3 DNA分子本身的大小和构型、凝胶浓度决定了DNA分子的迁移速度。

）中，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离，DNA 分子带负电荷，在电场中向正极移动。

DNA分子大小对迁移速率的影响：相对分子质量大，迁移慢；相对分子质量小，迁移快。

DNA分子构型对迁移速率的影响：迁移速度：闭环﹥直链DNA﹥开环DNA。

琼脂糖凝胶浓度的影响：同样大小的线性DNA片段，在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移速度不同，浓度越大，迁移的越慢常用的电泳上样缓冲液含溴酚蓝，有的还含有二甲苯青，这些指示剂可以指示电泳的速度。

溴化乙淀（EB）是核酸的染色剂，能插入DNA分子中形成荧光结合物，EB在紫外线照射下的发射荧光。

荧光的强度与DNA的含量成正比，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置及估计出待测样品的浓度。

EB是强致癌剂。

电泳操作步骤(整个过程要求带一次性手套1、胶槽准备①将凝胶托盘放入制胶盒中;②将加样梳垂直插入到制胶盒的小凹槽内，梳齿底端和凝胶托盘有1mm的间隙;③将制胶盒放在调整好的水平台上。

2、凝胶准备用1×TAE配制1％琼脂糖凝胶。

琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳1.原理琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。

其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。

琼脂糖凝胶具备网络结构，物质分子通过时会受阻力，大分子物质在汹涌时受的阻力小，因此在凝胶电泳中，磁铁颗粒的拆分不仅依赖于天量电荷的性质和数量，而且还依赖于分子大小，这就大大提高了辨别能力。

但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广为应用于核酸的研究中。

蛋白质和核酸会根据ph不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。

电泳缓冲液的ph在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。

常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。

琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的dna片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。

普通琼脂糖凝胶分离dna的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的dna片段。

dna分子在琼脂糖凝胶中泳动时存有电荷效应和分子筛效应。

dna分子在低于等电点的ph溶液中带负电荷，在电场中向负极移动。

由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链dna几乎具备等量的净电荷，因此它们能够以同样的速率向负极方向移动。

2操作方式流程准备干净的配胶板和电泳槽琼脂糖凝胶电泳：水平电泳注意dna酶污染的仪器可能会降解dna，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。

(1)电泳方法1一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大dna链应该使用脉冲凝胶电泳。

注意巨大的dna链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。

(2)凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2%之间，低浓度的用以展开大片段核酸的电泳，高浓度的用以展开大片段分析。

低浓度胶坚硬，小心操作方式和采用质量不好的琼脂糖就是解决办法。

琼脂糖凝胶电泳

凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶
液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室
温
加样：制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有 1 × TAE 或 TBE 工作液的电泳槽中使用。用微量加样器将添加了１× Loading Buffer 的样品分别加入样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部。
基因工程常用研究技术
DNA水平凝胶电泳 DNA horizontal electrophoresis
原理
琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖熔化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性pH 的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。它主要用于分离、鉴定核酸，如 DNA 鉴定，DNA 限制性内切酶图谱制作等，为 DNA 分子及其片段分子量测定和 DNA 分子构象的分析提供了重要手段。
电泳温度
琼脂糖DNA电泳温度视需要而定，对大分子的分离，以低温较好，也可在室温下进行。
在琼脂糖凝胶浓度低于 0.5% 时，由于胶太稀，最好在 4℃进行电泳以增加凝胶硬度。
质粒的电泳图谱
形、开口环状。
g /ml 加入EB，混匀。
倒胶：取有机玻璃内槽，洗净、晾干；将有机玻璃内槽两端封好，置于一水平位置模具上，放好梳子。将冷却至 65℃ 左右的琼脂糖
凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶
液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室
温
EB的作用
EB：即 3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐（Ethidium Bromide）。它能够插入 DNA 分子中的碱基对之间而与 DNA 结合。由于

琼脂糖凝胶电泳

二、实验方法
• 1．50×TAE的稀释：如制备50mL 1×TAE，取 1mL 50×TAE加入 49mL水定容至50mL。
• 2．制备1%的琼脂糖胶液：取0.2g琼脂糖溶于 20mL TAE中，在短时间里加热琼脂糖全部熔化，使溶液冷却至60℃.(加入浓度为10mg/mL的EB 2μL，使EB的终浓度为 1μg/mL)。
• 3．用于RNA电泳的电泳槽用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥后灌满3% 的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用DEPC—SDW冲洗电泳槽，梳子同样处理。
• 4．用胶带封住胶床，放好梳子。
Hale Waihona Puke • 5．将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在3—5mm之间，凝固20—60min。
• 6．在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子，将胶床放在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。
Thanks
农药学
贮存温度 4℃
室温
4℃
4℃ 4℃
• 加样缓冲液可以增大样品密度，以确保DNA均匀进入样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利。
• 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青FF的 2.2倍, 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长 300bp的双链线性DNA相同,而二甲苯青FF在琼脂糖凝胶中移动的速率则与4kb双链线性DNA相同。
• 7．向电泳槽中注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液高于胶面 1cm。
• 8．分别将DNA/RNA样品与加样缓冲液混合,用移液枪将样品加入加样孔。
• 9．正确连接电泳槽和电源，设定稳压为75V，电流一般为 50mA。
• 10．电泳结束后，在紫外观测仪上进行观察。
三、注意事项与实验技巧

琼脂凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳

琼脂凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳1. 什么是琼脂凝胶电泳？大家好，今天我们来聊聊一个科学小话题——琼脂凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳。

听起来有点复杂，其实它就像是科学界的“选美比赛”，不过选的不是小姐姐，而是分子哦！这两个小家伙都是用于分离和分析生物分子的方法，主要在基因和蛋白质的研究中大显身手。

琼脂凝胶电泳是用琼脂凝胶来分离生物大分子，比如DNA、RNA和蛋白质；而琼脂糖凝胶电泳则是用琼脂糖，专门用于DNA的分析。

听起来是不是有点像“同门兄弟”的感觉呢？1.1 琼脂凝胶电泳的工作原理琼脂凝胶电泳的原理其实很简单。

想象一下，一条河流，河水流动，河里的石头和沙子各自沉浮。

琼脂凝胶就像这条河，而DNA分子就像在河里漂浮的小石头。

电流流过时，带电的分子在电场的作用下开始移动，移动的速度和距离就取决于它们的大小和形状。

小分子跑得快，大分子跑得慢，最终在凝胶里形成不同的位置，像极了学校运动会上那场激烈的接力赛。

1.2 琼脂糖凝胶电泳的应用而琼脂糖凝胶电泳主要是针对DNA的。

因为DNA分子比较大，所以我们需要用琼脂糖来制造凝胶。

这个过程可不简单，首先得把琼脂糖溶解，然后倒入模具里，等它凝固。

接着，咱们就可以把样品放进去，通电后就能观察到DNA分子的分离了。

这就像在举行一场大聚会，大家按身高、体重分组，最后排成一条长龙，看看谁的身形最抢眼！2. 准备工作与步骤当然，做电泳可不是随便搞搞就完事的。

咱们得先做好准备工作。

首先要准备好琼脂和琼脂糖，根据实验需求调配浓度，这就像做饭调味一样，浓度太高，分子跑不动；浓度太低，又不够清晰，真是个“难兄难弟”。

然后，得把样品和缓冲液混合，搅拌均匀，这一步就像调色板，颜色调和得越好，最后的效果才越惊艳！2.1 凝胶的制备接下来，咱们需要制作凝胶。

把琼脂和琼脂糖加热至完全溶解，然后迅速倒入模具，待其凝固。

这个过程就像等待美食出炉一样，既期待又有点小紧张。

凝固后，再在凝胶上打个小洞，放入样品，别忘了在样品的旁边加上分子量标准，这样最后才能评比，看看谁最出色。

生化实训琼脂糖凝胶电泳

个核苷酸分子是由一分子含氮的碱基、一分子五碳
糖和一分子磷酸组成的。
原理核酸的两性解离
核酸既含有呈酸性的磷酸基团，又含有呈弱碱
性的碱基，故为两性电解质，可发生两性解离。
其解离状态随溶液的pH而改变。当核酸分子
的酸性解离和碱性解离程度相等，所带的正电荷与
负电荷相等，此时核酸溶液的pH就称为等电点
（isoelectric point, 简称pI）。
DNA属于碱稳定性物质
核酸都带负电，在电场中沿同一方向移动，再利用“分子筛效应”，就可用电泳的方法将不同大小的核酸分离开来。
CONTENTS
Байду номын сангаас
原理步骤
注意事项
步骤
1.电泳缓冲液
常见的核酸电泳缓冲液有：TAE、TBE、TPE等。一般选取TAE，配为50x浓度，用前需稀释为1x。作用： ①缓冲液在电泳过程中的一个作用是维持合适的pH。 ②电泳缓冲液的另一个作用是使溶液具有一定的导电性，以利于核酸分子的迁移。 ③电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，目的是螯合 Mg2+ 等离子，防止电泳时激活DNA酶，此外还可防止镁离子与核酸生成沉淀。
注意：制胶过程中应加入EB（溴化乙锭），是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。溴化乙锭可以嵌入碱基分子中,导致错配，可能具有高致癌性。注意做好防护措施。
步骤
步骤 3.电泳
步骤
（1）点样
样品已制备，加入点样孔中。如有气泡，应轻
轻赶出。（2）电泳确定正负极，接通电源开始电泳。样品中已加入loading buffer，可以指示样品的位置。
0.8+4.5 2
= 2.65

琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种凝胶电泳方法，用于生物化学、分子生物学、遗传学和临床化学，以分离琼脂糖基质中的大分子混合群，例如DNA、RNA 或蛋白质。

琼脂糖是从海藻中提取的天然线性聚合物，当在缓冲液中加热并冷却时，通过氢键形成凝胶基质。

它们是分离中、大型核酸最常用的介质，分离范围广。

琼脂糖凝胶电泳实验常用以DNA 切胶回收，DNA 分离和用于佐证DNA 是否重组、质粒等是否切开。

今天我们就来聊聊琼脂糖凝胶电泳实验的一些小技巧小细节。

第一步：胶液的制备称取0.4g 琼脂糖，置于200ml 锥形瓶中，加入50ml 0.5×TBE 稀释缓冲液，放入微波炉里加热，直到琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为0.8%琼脂糖凝胶液。

总液体量不宜超过锥瓶的50%容量。

否则会溢出来的。

毛博就吃过这个亏。

还要擦洗微波炉。

加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。

加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。

第二步：胶板的制备倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀。

东一块西一块的。

果冻做出来就不好看啦。

速度也不可太快，否则容易出现气泡。

果冻做出来里面都是气泡。

怎么吃呀？待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶。

第三步：加样注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

果冻下面被戳个窟窿，还怎么吃呀？第四步：电泳加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。

控制电压保持在60-80V，电流在40mA 以上。

当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm 时，停止电泳。

第五步：染色未加EB 的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml 的EB 溶液中，室温下染色20-25 分钟。

第六步：观察和拍照在波长为254nm 的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。

DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。

紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。

除这些细节之外，还有一些注意事项：1. 酶切时所加的DNA 溶液体积不能太大，否则DNA 溶液中其他成分会干扰酶反应。

琼脂糖凝胶电泳详解

一、简介琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖凝胶作为支持介质、利用核酸分子在电场中时的电荷效应和琼脂凝胶的分子筛效应，达到分离核酸混合物的一种电泳技术。

1、琼脂糖的分子筛效应1）琼脂糖（Agarose）来源于海洋红藻细胞壁，是一种大分子线性聚合物，基本结构是由D-半乳糖和3,6-anhydro-α-L-半乳糖通过β-1,4糖苷键结合而成的双糖单位在α-1,3糖苷键的连接下形成的一个长链。

琼脂糖具有亲水性，并几乎完全不存在带电基团，对敏感的大分子极少引起变性和吸附，是理想的惰性载体。

常用作电泳、层析等技术中的半固体支持物，用于生物大分子或小分子物质的分离和分析。

琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到40℃左右形成良好的半固体状凝胶。

琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成直径从50nm-200nm不等的孔径结构，孔径的大小由凝胶浓度控制。

琼脂糖凝胶中孔径的大小，影响了通过的核酸分子的大小以及通过的速度。

通常来说，琼脂糖凝胶的浓度越高，孔径越小，能够通过的核酸分子越小，迁移速度也越慢。

DNA片段越小，所需的胶浓度越大；而DNA 片段越长，所需的胶浓度则越小。

选择合适的胶浓度才能更好的分离片段。

2）琼脂的质量评价琼脂糖通常通过其凝胶强度和电内渗情况判断质量好坏。

强度越高，凝胶性能越好。

质量较好的琼脂糖强度通常在1200g/cm2以上，硫酸根含量在0.2%以下，电内渗在0.13以下。

琼脂糖是从琼脂中分离而来的。

琼脂由琼脂糖和琼脂果胶组成的，琼脂果胶是由许多更小的分子组成的异质混合物，和琼脂糖结构相似，但带硫酸根和羧基组分，凝胶能力差。

在琼脂糖制备过程中需要把琼脂果胶尽量去除，否则琼脂糖有可能存在极微量硫酸根和丙酮酸取代电离基团，附着到琼脂糖的多糖基质上，造成电内渗（EEO）。

电内渗会导致缓冲液中产生正电荷反向离子，它们向负极移动，从而造成与DNA反方向迁移的液流，使DNA的分离效果变差。

琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳一、琼脂糖凝胶的特点天然琼脂是一种多糖，主要由琼脂糖（约80%）和琼脂凝集素组成。

琼脂糖是一种中性物质，由半乳糖及其衍生物组成，不带电荷，而琼脂凝胶是一种含有硫酸盐和羧基的强酸性多糖。

因为这些基团是带电的，所以它们在电场的作用下能产生强烈的电渗作用。

此外，硫酸盐能与一些蛋清物质相互作用，影响电泳速度和分离效果。

因此，目前平板电泳常用琼脂糖作为电泳载体，其优点如下。

1.琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品无需预先处理即可电泳。

2.琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98％~99％），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。

3.琼脂糖透明，无紫外线吸收。

电泳过程和结果可直接用紫外灯检测和定量测定。

4.电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。

制成干膜可长期保存。

目前，琼脂糖常用作分离蛋白质和同工酶的电泳载体。

琼脂糖电泳和免疫化学的结合已经发展成为免疫电泳技术，它可以识别其他方法无法识别的复杂系统。

由于超微技术的建立，可以检测到0.1ug蛋白质。

琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如dna鉴定，dna限制性内切核酸酶图谱制作等。

由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。

二、dna的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳分离核酸主要基于它们的相对分子质量和分子构型，并且与凝胶浓度密切相关。

1.核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系①dna分子的大小在凝胶中，dna片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。

但是当dna分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。

此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离dna时，分子大小不宜超过此值。

2.琼脂糖浓度如下表所示。

不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶分离。

琼脂糖凝胶电泳

1、DNA在碱性缓冲液中带什么电荷？电泳时向哪一极移动？ 2、什么是迁移率？影响迁移率的因素有哪些？什么是分辨率？
分辨率与凝胶浓度的关系？ 3、DNA荧光染料的发光原理？
DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。
溴化乙锭(EB)为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。
（一）制胶
1、称取1.5g琼脂糖加入盛有100 ml 0.5TAE电泳缓冲液的250 ml三角瓶中，摇匀，在微波炉上加热至琼脂糖完全溶解。冷却到约60℃后，加入10 l的EB，并摇匀。
2、将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入制胶模具中，直至厚度为4-6 mm，插入适当的梳子，在室温下冷却凝固。
五、实验用具
移液器吸管头若干加样板量筒100 ml1 三角瓶500 ml1
六、试剂
琼脂糖 50TAE电泳缓冲液 6 载样缓冲液（loading buffer）溴化乙锭(EB) DNA分子量标准（DNA marker）：Marker III
七、实验步骤
（一）制胶（1% agarose gel）（二）点样（三）电泳（四）观察
实验三、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是分子克隆的核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA片段。凝胶中DNA的位置可以用低浓度的荧光插入染料染色直接观察。

琼脂糖凝胶电泳

（四）琼脂糖凝胶电泳装臵
琼脂糖凝胶电泳的观察

在琼脂糖凝胶中加入溴化乙锭（ethidium bromide,
EB）或Golden view 。在紫外光下就可观察到明显DNA
的荧光谱带。
（五）琼脂糖凝胶电泳的基本步骤和注意事项 1、制胶 2、上样 3、观察 4、拍照
EB — Carcinogen Ultra Violet— hurt your eyes

In both of these photos, a gel which has completely polymerized is now ready to use. Notice the spaces (called "wells") left by the removal of the comb. This can be seen better in the second photo. Both gels are resting on the glass support. The higher the agarose percentage, the bluer the gel.
The solvent used to dissolve the agarose. Rather than just use water, we use buffered solutions which allow the DNA to run smoothly through the gel. These solutions optimize the pH and ion concentration of the gel and will also bathe the gel as it is subjected to the electric current which actually moves the DNA through the gel.

琼脂糖凝胶电泳

8、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般10～30μl。
9、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。电泳条件：电压1～5v/cm；时间1小时左右。 10、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。
11、电泳结果分析： ①紫外检测仪直接观察电源条带； ②摄影记录； ③凝胶成像分析系统处理。
溴化乙锭用于核酸染色的优点：
⑴染色操作简单，一般在凝胶中加入终浓度0.5μg/ml 的EB即可，在电泳过程中随时可以观察核酸的泳动。也可在电泳结束后，将凝胶浸泡在EB里30分钟即可。 ⑵EB染色不会引起核酸的断裂，其它染料做不到这一点。 ⑶EB染色灵敏度较高，可以检测出10ng的DNA样品。
五、注意事项：
1、凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定，所以电泳前应对DNA片段大小有粗略的估计。 2、用胶带纸封闭胶床两端时，要确保严密，以免灌胶时有胶液漏出。 3、用微波炉熔化琼脂糖时，应控制好时间，以免突然产生气泡，使琼脂糖溢出来。 4、凝胶冷却至60℃左右，立即铺胶，以防凝固。 5、上样前检查样品孔内是否有气泡，并设法排除。 6、上样时，加样器吸头要轻贴样品孔壁，但不要碰坏孔壁，否则电泳条带不整齐。 7、电泳前，确认样品孔位于电场负极。 8、因EB存在，全部操作过程要带防护手套。含EB 的溶液应做净化处理。
琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围
胶浓度（％） 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线性DNA分子大小（kb） 5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.4～6 0.2～4 0.1～3
二、仪器设备及材料
1、电泳装置：包括电泳槽（多采用水平方式）、胶床和梳子三部分组成。 2、稳压电泳仪：电压可变范围0～300～600V，电流可变范围0～250～500mA。 3、紫外线检测仪：可产生254、302、366nm 3个波段紫外线，并配备防护眼镜和5mm厚的黑色有机玻璃防护板。 4、照相机： 5、微波炉： 6、其它：三角烧瓶、量筒、胶带纸、一次性手套等。

琼脂糖凝胶电泳

蛋白：溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红B Aa：茚三酮、靛红核酸：紫外光下观察一般洗脱定量
（一）、纸电泳
以滤纸为支持体的电泳技术操作要点： 1 选择缓冲液对显色剂和紫外光吸收等观察区带的方法无影响 A 分离蛋白质，pI≈ 5，选pH8.6的缓冲液（巴比
妥缓冲液pH8.6、硼酸pH8.6、磷酸pH7.4) B 分离氨基酸：邻苯二甲酸氢钠、磷酸盐—醋酸，
（三）薄膜电泳
支持体：薄膜优点：分辨力较高、简便、快速、区带清晰、易于
定量、便于保存广泛应用于蛋白质和同工酶等的分离分析
操作 1 薄膜的处理与放置 2 点样平衡 3 电泳：E 10-25V/cm，0.5～2h 4 显色
（四）凝胶电泳
支持物：多孔凝胶聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等具有电泳和分子筛的双重作用，分辨力高最常用聚丙烯酰胺凝胶，原因：
聚丙烯酰胺凝胶电泳
可调节凝胶孔径，样品用量少分辨率高，无电渗现象
高浓度凝胶难剥离
（一）、纸电泳
以滤纸为支持体的电泳技术操作要点： 1 选择缓冲液对显色剂和紫外光吸收等观察区带的方法无影响 A 分离蛋白质，pI≈ 5，选pH8.6的缓冲液（巴比妥
缓冲液pH8.6、硼酸pH8.6、磷酸pH7.4) B 分离氨基酸：邻苯二甲酸氢钠、磷酸盐—醋酸，
pH5.9 C 分离核苷酸：巴比妥－醋酸pH2.5，柠檬酸
pH2-3 D 分离糖类：HAC-NaAC, pH3-5
2 滤纸的选择与处理层析用滤纸，纸宽2～3cm/样品组分，长短影响电场
强度。 3 点样点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知样
品）、点一边（已知样品）干法、湿法 4 电泳
电桥水平、加盖、电压稳定、注意时间 5 显色及分析

琼脂糖凝胶电泳

DNA琼脂糖凝胶电泳跑胶即走电泳，是DNA 和protein 最基本的定性定量方法。

一般是琼脂糖胶或page 胶，琼脂糖胶一般是检测DNA的，可以检验一下你到底提到dna没过确定你提dna分子量的大小：page胶一般是检测蛋白特性的，通过page胶里marker的分子量大小来确定你需要的目的蛋白分子量大小，如果有杂带那就可以判断那条带是你需要的目的条带，如果想知道蛋白浓度，还可以在page胶里带上一条定量marker，通过条带粗细，来判断你需要蛋白的浓度。

二者原理一致，小分子量用大浓度的胶，大分子量用小浓度的胶，特别小的DNA 用丙烯酰胺凝胶。

一、基本原理当把一个带净电荷(q)的颗粒放入电场，便有一个电场力(F)作用于其上。

F的大小取决于颗粒静电荷量及其所处的电场强度(E)，它们之间的关系可以表示成：F=E×q。

由于F的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动。

此颗粒在泳动的过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f*v)阻挡。

当这两种力相等时，颗粒则以速度(v)向前泳动：v=F/f,其中f为摩擦系数。

根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的粘度，即f=6πγη, γ为颗粒半径，η为介质粘度。

该公式指球形颗粒所受的阻力。

代入F＝E×q得到: v=E×q/6πγη.从这个公式可以看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒半径和介质粘度成反比。

带电颗粒在电场中泳动的速度常用泳动度(m)或者迁移率以下列公式表示：m＝μ/E=d*l/V*td为带电颗粒泳动的距离(cm)，l为支持物的有效长度(cm)，t为通电时间(s)，V为加在支持物两端的电压。

在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度。

它是胶体颗粒的一个物理常数，可用其鉴定蛋白质、核酸等物质的纯度，还可以用其来研究蛋白质、核酸等物质的一些理化性质。

影响泳动度的因子有颗粒的性质、电场强度、溶液的性质等。