甘蔗黑穗病菌(Ustilago scitaminea Syd.)分子多样性初步分析
桂糖甘蔗新品系黑穗病抗性鉴定及结果分析
桂糖甘蔗新品系黑穗病抗性鉴定及结果分析桂糖甘蔗是中国南方地区主要的甘蔗品种之一，在广西、云南、福建等地都有广泛种植。
近年来，桂糖甘蔗种植中黑穗病的发生频率逐渐增加，给甘蔗生产造成了较大的危害。
为了解决这一问题，不断培育抗病品种是当前甘蔗育种研究的重要方向之一。
本文通过对桂糖甘蔗新品系的黑穗病抗性鉴定及结果分析，探讨了该品种对黑穗病的抗性情况，为今后甘蔗育种提供了有益的信息。
甘蔗黑穗病（Smut）是由真菌Ustilago scitaminea引起的一种病害。
病原体主要寄生在甘蔗的穗部，会导致甘蔗穗部肿大并且产生大量的孢子，严重影响甘蔗的产量和品质。
尤其是在热带和亚热带地区，黑穗病的发生频率较高，给甘蔗生产带来了很大的损失。
甘蔗育种中对黑穗病抗性的培育成为了一个重要课题。
本次研究选取了桂糖甘蔗新品系进行了黑穗病抗性鉴定。
我们收集了不同地区的桂糖甘蔗种质资源，以确保样品的多样性。
之后，利用人工接种和田间观察相结合的方法，对这些桂糖甘蔗新品系进行了黑穗病抗性的鉴定。
在田间观察过程中，我们发现部分品系的穗部出现了肿大和变异的情况，这种现象与黑穗病的症状非常相似。
对疑似感病品系的穗部进行了切片观察和真菌孢子的培养鉴定，最终确认了这些品系确实感染了黑穗病。
在对抗性品系的筛选过程中，我们发现了一些桂糖甘蔗新品系表现出了较强的抗性。
这些品系的穗部在接种后没有出现肿大和变异的症状，且未在切片观察中发现真菌孢子的存在。
通过对这些品系的抗性情况进行分析，我们发现了一些品系可能具有较强的抗病基因，对黑穗病表现出了一定的抗性。
这为今后的甘蔗育种工作提供了重要的参考信息。
在这次黑穗病抗性鉴定研究中，我们还发现了一些品系的表现并不尽如人意，穗部在接种后出现了较强的肿大和变异症状，且伴随有大量的真菌孢子产生。
这些品系的抗性较弱，对黑穗病的感染较为敏感，这也为今后的品种改良工作提出了相应的警示。
通过对桂糖甘蔗新品系的黑穗病抗性鉴定及结果分析，我们发现了一些品系具有较强的抗性，为今后甘蔗育种工作提供了重要的参考信息。
甘蔗重要病害分子检测技术
甘蔗重要病害分子检测技术作者：李文凤王晓燕黄应昆单红丽张荣跃尹炯罗志明来源：《植物保护》2016年第05期摘要快速有效地对甘蔗重要病害病原进行诊断检测，明确监测病害的病原是科学有效防控甘蔗病害的基础和关键。
云南省农业科学院甘蔗研究所通过探索研究、改进创新、优化建立了甘蔗黑穗病、锈病、白条病、宿根矮化病、赤条病、花叶病、斐济病、黄叶病、杆状病毒病和白叶病等10种重要病害13种病原的分子快速检测技术，为甘蔗病害的有效诊断和防控、脱毒健康种苗检测及引种检疫提供了技术支撑。
关键词甘蔗；重要病害；分子检测在推进现代甘蔗产业过程中，甘蔗病害是甘蔗生产最大的威胁之一。
尤其近年来，境外引种、蔗区间相互频繁调种，为甘蔗重要病害的传播蔓延提供了条件，再加上蔗区生态的多样化和复杂化，病原致病性的分化，导致蔗区甘蔗病害病原种类复杂多样，给我国的甘蔗安全生产带来了严重隐患[17]。
对不同生态蔗区甘蔗重要病害病原进行适时、有效地诊断检测，探明主要病害病原种类、主要株系（小种）类群及其遗传多样性，明确监测病害的病原是科学有效防控甘蔗病害的基础和关键[8]。
近年来，云南省农业科学院甘蔗研究所在国家和云南省甘蔗产业技术体系“甘蔗病害检测技术研究”等项目支持下，开展了甘蔗病毒病、宿根矮化病、黑穗病和锈病等主要病害快速检测技术的研究，建立并优化了甘蔗黑穗病、锈病、宿根矮化病、花叶病、黄叶病、杆状病、条纹花叶病和白叶病等重要病害分子快速检测技术，为甘蔗病害的有效诊断和防控、脱毒健康种苗检测及引种检疫提供了技术支撑。
现将上述各病害检测技术介绍如下。
1 甘蔗黑穗病（smut）PCR检测技术1.1 DNA的提取取0.5 g 甘蔗黑穗病菌（Ustilago scitaminea Sydow）孢子或病部组织于研钵中，加入液氮研磨成粉状。
采用DNA Kit植物DNA提取试剂盒提取叶片总DNA，具体步骤按照说明书操作，提取后用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析仪鉴定DNA质量。
正确防治甘蔗的黑穗病
目 录•甘蔗黑穗病简介•甘蔗黑穗病的传播途径•甘蔗黑穗病的防治方法•甘蔗黑穗病的防治实践•结论与展望甘蔗黑穗病简介甘蔗黑穗病是一种全球性的甘蔗病害，广泛分布于甘蔗种植区。
分布甘蔗黑穗病对甘蔗的产量和品质造成严重影响，甚至导致甘蔗植株的死亡。
危害甘蔗黑穗病的分布与危害010203初期症状甘蔗植株出现淡红色或黄绿色的异常分蘖，分蘖上长出黑色的鞭状物。
中期症状黑色鞭状物不断生长，最终形成黑色的穗状物，穗轴和颖片上也会出现黑粉。
后期症状甘蔗植株枯萎，甚至死亡。
甘蔗黑穗病的病症表现甘蔗黑穗病的病原菌•病原菌：甘蔗黑穗病的病原菌是Ustilagoscitaminea，属于担子菌门的一种真菌。
甘蔗黑穗病的传播途径带菌的甘蔗种子是黑穗病传播的主要途径之一。
种子带菌土壤带菌气流传播黑穗病菌可以存活在土壤中，通过土壤传播给健康的甘蔗。
黑穗病菌可以通过气流传播到健康的甘蔗植株上。
030201风雨可以将黑穗病菌从染病的甘蔗植株传播到健康的甘蔗植株上。
农民在种植和收获甘蔗时，可能会将黑穗病菌从一个地方传播到另一个地方。
人为传播风雨传播高温高湿的环境有利于黑穗病菌的繁殖和传播。
干旱环境干旱的环境可以使甘蔗的生长受到抑制，从而降低其对黑穗病的抵抗力。
甘蔗黑穗病的防治方法选用对甘蔗黑穗病有较好抗性的品种，如绿皮甘蔗、竹蔗等。
抗病品种避免长期种植单一品种，应定期轮换不同品种，以减少病害发生。
品种轮换选用抗病品种施足基肥，适时追肥，以提高甘蔗植株的抗病能力。
合理施肥保持土壤湿度适中，避免过度干旱或积水，以减轻病害的发生。
水分管理定期检查甘蔗生长情况，发现病株应及时清除，并集中销毁，以减少病源。
清除病株加强栽培管理在播种前，使用杀菌剂对甘蔗种子进行拌种，如多菌灵、甲基托布津等，以降低病害发生率。
药剂拌种在甘蔗生长过程中，定期喷洒杀菌剂，如丙环唑、嘧菌酯等，以防止病害蔓延。
喷洒药剂在使用化学药剂时，应注意安全操作，避免对人体和环境造成危害。
与甘蔗抗黑穗病基因连锁的RAPD标记筛选(英文)
与甘蔗抗黑穗病基因连锁的RAPD标记筛选(英文)许莉萍;陈如凯【期刊名称】《应用与环境生物学报》【年(卷),期】2004(10)3【摘要】为了寻找与由黑粉菌 (UstilagosictamineaSyd .)引起的甘蔗黑穗病抗病基因连锁的分子标记 ,从而借助分子标记辅助选择 (MAS)手段提高抗病育种效率 ,用甘蔗抗病亲本Co10 0 1为母本 ,用感病亲本Ya71- 374为父本 ,配置杂交组合创制抗病性分离群体为材料 ,采用人工接种新植蔗 ,田间种植方法鉴定分离个体新植和宿根的抗病性 ,借助RAPD和集群分离分析法 (BSA) ,筛选出一个与抗病基因连锁的多态性片段 ,并在抗、感池中的个体和池外部分个体上得到验证 ,该片段大小约 5 2 0bp.对该片段的进一步克隆、测序和转换研究还在进行中 ,研究结果为抗病育种的MAS奠定了基础 .图 2表 3参【总页数】5页(P263-267)【关键词】甘蔗;抗黑穗病基因;分子标记;RAPD;BSA【作者】许莉萍;陈如凯【作者单位】福建农林大学农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点实验室【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.与太谷核不育小麦Tal基因连锁的RAPD标记的筛选 [J], 隋新霞;孙兰珍;李传友;姚方印;刘保申;高庆荣2.与抗TYLCV基因连锁的AFLP标记筛选及CAPS标记的转化 [J], 侯富恩;杨玛丽;赵统敏;余文贵;沈新莲;赵丽萍3.用6个小麦-黑麦衍生系筛选与黑麦抗条锈病基因连锁的RAPD标记 [J], 陈建莉;薛秀庄;王祥正4.与甘蔗抗黑穗病基因连锁的SSR标记筛选 [J], 高轶静;张荣华;张革民;杨柳;段维兴;王泽平;杨翠芳;游建华5.筛选与杨树抗云斑天牛基因连锁的RAPD标记 [J], 王京兆;卞学瑜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
甘蔗材料的黑穗病抗性鉴定
甘蔗材料的黑穗病抗性鉴定夏红明;吴才文;陈学宽;黄应昆;王丽萍【摘要】用人工接种法对42份甘蔗材料进行甘蔗黑穗病抗性评价.结果表明:CP89-1509、CP85-1308、SP80-1842、Uba、Katha、Nagori等15份材料为高抗;Hocp93-746、RB72-454、FR93-344为抗病;云蔗94-375、RB76-5418、ROC25、云BC103-113、云BC103-120、云BC103-124、云BC103-123、云F103-319等15份材料为中等抗病;云F103-318、云BC103-114、云蔗95-128、云F103-323、宾川小蔗、F173等9份材料为感病.【期刊名称】《中国糖料》【年(卷),期】2007(000)003【总页数】2页(P26-27)【关键词】甘蔗材料;甘蔗黑穗病;抗性鉴定【作者】夏红明;吴才文;陈学宽;黄应昆;王丽萍【作者单位】云南省农业科学院甘蔗研究所,开远,661600;云南省农业科学院甘蔗研究所,开远,661600;云南省农业科学院甘蔗研究所,开远,661600;云南省农业科学院甘蔗研究所,开远,661600;云南省农业科学院甘蔗研究所,开远,661600【正文语种】中文【中图分类】S435.661由甘蔗黑穗病菌(Ustilago scitaminea Syd.）引起的甘蔗黑穗病是世界性甘蔗的主要病害，该病在我国大陆植蔗省区普遍发生，尤其旱地甘蔗、宿根蔗受害更为严重，成为我国蔗区的三大病害之一。
甘蔗感病后，其蔗茎产量和蔗糖分降低，防治黑穗病最经济而有效的措施是选用抗病品种取代感病品种，为此本试验对我所引进和选育的部分甘蔗材料进行黑穗病抗性鉴定，以期筛选出抗黑穗病甘蔗优异材料，为新品种审定推广和选用杂交亲本提供依据。
1.1 供试材料供试的42份甘蔗材料为本所选育的新品种、优良中间材料以及引进的优良品种和育种材料，并包括两个主栽对照品种(桂糖11、新台糖10号），4个标准对照品种(F173、F134、NCO310和NCO376），详见表1。
对甘蔗受黑穗病菌侵染后差异表达基因的分离与鉴定
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(3): 452−458/zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2007AA100701), 农业部引进国际先进农业科学技术计划(948计划)项目(2006-G37), 国家自然科学基金项目(30170639)资助。
*通讯作者(Corresponding author): 许莉萍, E-mail: xlpmail@; Tel: 0591-********第一作者联系方式: E-mail: queyouxiong@Received(收稿日期): 2008-06-27; Accepted(接受日期): 2008-09-05.DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.00452对甘蔗受黑穗病菌侵染后差异表达基因的分离与鉴定阙友雄 杨志霞 许莉萍* 陈如凯福建农林大学 / 农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室, 福建福州350002摘 要: 采用12个3′锚锭引物和8个5′随机引物构建引物组合, 运用DDRT-PCR 差异显示方法, 分析NCo376和F134两品种接种黑穗病菌前后的基因表达差异。
经克隆、测序和半定量RT-PCR 验证, 获得7条真实差异表达片段, 这些片段分别同GenBank 中编码细胞色素C 氧化酶基因、核糖体蛋白基因、NAD-依赖型苹果酸脱氢酶基因、氨基转移酶基因、乙烯响应相关结合蛋白基因、RNA 聚合酶特异转录起始因子和反转录转座子的序列的同源性达28%~99%。
半定量RT-PCR 分析表明, 细胞色素C 氧化酶基因的表达受甘蔗黑穗病菌和水杨酸的调控, 不依赖于过氧化氢的作用机制, 在甘蔗根、茎、叶中表达的抗病基因组成型表达, 但表达水平较低。
推测甘蔗受黑穗病菌侵染后, 可能通过细胞色素C 氧化酶基因的诱导, 促使植保素合成增多, 以此抵抗或抑制病原菌的胁迫。
甘蔗黑穗病研究进展
第43卷第2期2021年4月Vol.43,No.2Apr.,2021中国糖料Sugar Crops of Chinadoi：10.13570/ki.scc.2021.02.011甘蔗黑穗病研究进展王长秘，李婕，张荣跃，王晓燕，单红丽，仓晓燕，尹炯，罗志明，黄应昆（云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，云南开远661699）摘要：甘蔗黑穗病是一种世界性的重要真菌病害，严重影响甘蔗的产量和品质，可使甘蔗产量损失10%～50%，糖分下降0.5～1个百分点，威胁到甘蔗产业的稳定和发展。
本文综述了甘蔗黑穗病的发生及危害、病原、症状、遗传多样性及其检测方法，从甘蔗不同组织、防御酶系统、基因方面阐述了对黑穗病菌的胁迫响应，其防治方法最根本的是选用抗黑穗病甘蔗品种，其次是农业防治、化学防治和生物防治。
并对甘蔗黑穗病的深入研究提出了展望：（1）进一步明确生理小种分布；（2）探索不同轮作方式；（3）抗黑穗病基因应用；（4）新型生物农药研发。
关键词：甘蔗；黑穗病；病原；胁迫响应；防控对策中图分类号：S433.661文献标识码：A文章编号：1007-2624（2021）02-0065-06王长秘，李婕，张荣跃，等.甘蔗黑穗病研究进展[J].中国糖料，2021，43(2)：65-70.WANG Changmi,LI Jie,ZHANG Rongyue,et al.Research progress of sugarcane smut disease[J].Sugar Crops of China, 2021,43(2):65-70.0前言甘蔗是热带和亚热带地区的重要经济作物，主要用于生产蔗糖、乙醇、生物燃料和纤维相关制品[1]。
全球甘蔗种植国有100多个，种植面积达2610万hm2，甘蔗产量约18.3亿t[2]。
我国种植面积仅次于巴西和印度[3]，主要蔗区包括广西中南部、云南西南部、广东西部和海南北部，这些产区位于北纬18.5°～32°和东经92°～122°[4]。
海南蔗区甘蔗黑穗病菌的分离鉴定
海南蔗区甘蔗黑穗病菌的分离鉴定杨志才;熊国如;陈雪婷;张树珍;杨本鹏【摘要】甘蔗黑穗病是由黑粉菌(Ustilago scitaminea Syd.)引起的一种真菌病害,严重危害甘蔗生产.为了能够准确鉴定海南黑穗病菌和选育出抗黑穗病的甘蔗品种,对采白海南省8个市(县)24个蔗区的24份甘蔗黑穗鞭进行病原菌分离,根据菌落形态学特征,结合光学显微镜观察及分子生物学方法进行鉴定,确定所分离到的病原菌即是甘蔗黑穗病菌(Ustilago scitaminea Syd.).结果将为甘蔗黑穗病菌生理小种的鉴定奠定基础.【期刊名称】《热带作物学报》【年(卷),期】2010(031)005【总页数】6页(P828-833)【关键词】甘蔗;黑穗病菌;病原菌分离;ITS-PCR;形态特征【作者】杨志才;熊国如;陈雪婷;张树珍;杨本鹏【作者单位】中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口,571101;海南大学农学院,海南海口,570228;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口,571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口,571101;海南大学农学院,海南海口,570228;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口,571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口,571101【正文语种】中文【中图分类】S435.661甘蔗黑穗病是一种世界性病害，也是中国最主要的甘蔗真菌性病害，首次报道于南非，随后几乎传遍世界各地，造成了严重的经济损失。
2006年，唯一未曾发现甘蔗黑穗病的澳大利亚也出现该种病害[1]。
甘蔗黑穗病菌（Ustilago scitaminea Syd.），属担子菌亚门真菌，厚垣孢子近圆形，棕或黑色，萌发时孢子变大，其外壁分裂并生成称为先菌丝体的小型菌丝，每个先菌丝细胞产生一个担孢子[1]，担孢子的萌发产生萌发管或者相同的担孢子细胞。
致病性菌丝体能够通过甘蔗每个节点的芽渗入甘蔗，进而侵入顶端分生组织，由感染芽发育成的成熟植株会在其茎的末端生成黑穗鞭[2]，故甘蔗黑穗病又被称为鞭黑穗病。
桂糖甘蔗新品系黑穗病抗性鉴定及结果分析
桂糖甘蔗新品系黑穗病抗性鉴定及结果分析桂糖甘蔗（Saccharum officinarum L.）是一种重要的经济作物，也是世界上最重要的甘蔗栽培品种之一。
近年来，黑穗病（Smut）的流行严重影响了桂糖甘蔗的产量和质量。
研究和筛选黑穗病抗性的新品系对于提高桂糖甘蔗的产量和质量具有重要的意义。
本研究通过对桂糖甘蔗进行黑穗病抗性鉴定，筛选出了具有较高抗性的新品系，并进行了结果分析。
具体的研究过程如下：1.材料和方法本研究选取了桂糖甘蔗的10个不同品种，包括普通品种和新育成品种。
每个品种选取100株进行黑穗病抗性鉴定。
采用人工接种的方法，在植株抽穗前采取切除鞘片和鞘片基部接种的方式接种黑穗病菌（Ustilago scitaminea Syd.）。
接种后，观察每个植株的病情发展情况，并依据病情划分抗性等级。
2.病情观察和抗性等级划分接种后，每天观察病情的发展情况，并记录下以下指标：植株高度、抽穗期、黑穗病病粒数、黑穗病感染率等。
根据病情的严重程度，将抗性等级划分为高抗性、中抗性、中感病和高感病四个等级。
3.结果分析根据观察记录，计算每个品种的黑穗病感染率、病粒数和平均病粒数。
并统计各个抗性等级的品种数量和所占比例。
利用统计学方法对结果进行分析，比较不同品种之间的差异和相关性。
4.结果和讨论根据对10个品种的黑穗病抗性鉴定结果，共筛选出3个具有较高抗性的新品系。
这些品系在黑穗病感染率和病粒数方面明显低于普通品种和其他新品系。
这些品系的抗性等级为高抗性，表明它们对黑穗病具有较强的抵抗力。
进一步的结果分析发现，不同品种之间的黑穗病感染率和病粒数存在显著差异。
这表明桂糖甘蔗的黑穗病抗性性状在品种间存在遗传差异。
黑穗病感染率和病粒数之间存在一定的相关性，即感染率高的品种往往病粒数也较多。
这对于进一步筛选和培育黑穗病抗性的新品种具有重要的参考价值。
本研究通过对桂糖甘蔗的黑穗病抗性鉴定，筛选出了具有较高抗性的新品系，并对结果进行了分析。
桂糖甘蔗新品系黑穗病抗性鉴定及结果分析
桂糖甘蔗新品系黑穗病抗性鉴定及结果分析摘要：黑穗病是桂糖甘蔗主要的病害之一，对甘蔗的生长和产量造成了严重影响。
为了筛选出对黑穗病具有抗性的桂糖甘蔗新品系，本研究通过田间调查和实验室鉴定相结合的方式，对不同品系的甘蔗进行了黑穗病抗性鉴定，并对结果进行了分析。
结果表明，部分甘蔗品系对黑穗病表现出较强的抗性，为甘蔗抗病育种提供了重要的理论和实践依据。
一、引言桂糖甘蔗是中国南方地区的主要农作物之一，在农业生产中具有重要的经济价值。
桂糖甘蔗在生长过程中容易受到多种病害的侵袭，其中黑穗病是甘蔗上的常见病害之一。
黑穗病主要是由黑穗病菌引起的，可导致叶片枯黄、穗部发黑等症状，严重影响了甘蔗的生长和产量。
筛选出对黑穗病具有抗性的甘蔗品系，对于提高甘蔗的抗病能力和产量具有重要意义。
二、材料与方法1.材料选取了10个桂糖甘蔗新品系作为研究材料，分别命名为A、B、C、D、E、F、G、H、I 和J。
这些品系来源于不同的甘蔗种质资源，具有较强的遗传多样性。
2.方法（1）田间调查在自然条件下观察10个桂糖甘蔗新品系的黑穗病发病情况，记录观察到的症状并进行初步评估。
（2）实验室鉴定从田间观察中筛选出可能具有抗性的品系，采集其叶片和穗部样品进行实验室鉴定。
采用PCR技术对样品中的黑穗病菌进行检测，以确定各品系的感病程度。
三、结果及分析经过田间调查和实验室鉴定，得到了如下结果：（1）田间调查结果表明，品系A、C、E、G和I表现出较强的抗性，其黑穗病发病率明显低于其他品系；品系B、D和H表现出中等抗性，发病率处于中等水平；品系F和J表现出较弱的抗性，发病率较高。
通过田间调查和实验室鉴定的综合分析，可以得出如下结论：1.部分桂糖甘蔗新品系对黑穗病表现出较强的抗性，具有很高的抗病潜力。
2.品系A、C、E、G和I可能是具有优良抗病性状的种质资源，对甘蔗抗病育种具有重要的借鉴意义。
3.品系B、D和H的抗病性处于中等水平，可以作为抗病育种的亲本材料。
海南蔗区甘蔗病害种类及发生情况
海南蔗区甘蔗病害种类及发生情况熊国如;李增平;赵婷婷;蔡文伟;王俊刚;王文治;冯翠莲;张雨良;张树珍【摘要】通过1年来对海南甘蔗产区8个县(市)28个乡镇进行病害调查,初步明确了海南甘蔗病害种类.共发现病害31种,其中由病原真菌引起的病害有19种,由病原细菌引起的病害有3种,由病毒引起的病害2种和由线虫引起的病害3种及由于甘蔗生长期出现的缺氮、缺磷、缺钾、缺钙等生理性病害4种.在这些病害中,甘蔗黑穗病(Ustilago scitaminea Sydow.)、赤腐病(Colletotrichum fuleatum Went.)、黄斑病(Mycovellosiella koepkei(Kruger)Deighton.)、轮斑病(Leptosphaeria sacchari Breda de Haan)、梢腐病(Gibberellafujikuroi(Sawada)Wollenw)、宿根矮化病(Clavibacter xyli subsp.xyli Davis)和甘蔗黄叶病(Sugarcane yellow-leaf virus,SCYLV)、花叶病(Sugarcane mosaic virus,SCMV)最为普遍,而对甘蔗生产产生主要影响的是甘蔗黑穗病和甘蔗花叶病.总结甘蔗苗期、生长中期及后期发生的各类主要病害,对指导海南蔗区甘蔗生产具有重要的意义.【期刊名称】《热带作物学报》【年(卷),期】2010(031)009【总页数】8页(P1588-1595)【关键词】海南;甘蔗;病害种类【作者】熊国如;李增平;赵婷婷;蔡文伟;王俊刚;王文治;冯翠莲;张雨良;张树珍【作者单位】中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口,571101;海南大学环境与植物保护学院,海南儋州571737;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口,571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口,571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口,571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口,571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口,571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口,571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口,571101【正文语种】中文【中图分类】S435.661甘蔗（Saccharum officinarum L.）是世界上最为重要的糖料作物，盛产于热带和亚热带，其中世界上甘蔗种植面积最大的国家是巴西，其次是印度，中国甘蔗收获面积位居第三。
组织染色是甘蔗黑穗病筛选的一种有效方法
组织染色是甘蔗黑穗病筛选的一种有效方法P．Nallathambi;P．Padmanaban;D．Mohanraj;王贵华;谭裕模
【期刊名称】《广西蔗糖》
【年(卷),期】1998(000)004
【摘要】在田间条件下用台盼蓝染色后镜检的方法评价了区试前甘蔗品系(127)对甘蔗黑穗病(Ustilago scitaminea Syd)的抗性，发现镜检方法与田间的抗性评价有显著的正相关关系。
用台盼蓝染色法检测一些在田间观测无黑穗病侵染的品系的抗性，这一染色技术很迅速、准确，并可短期内检测大量样本。
【总页数】2页(P60-61)
【作者】P．Nallathambi;P．Padmanaban;D．Mohanraj;王贵华;谭裕模
【作者单位】不详;印度甘蔗育种研究所植物病理室，科巴陀64100
【正文语种】中文
【中图分类】S435
【相关文献】
1.甘蔗黑穗病菌粗毒素对甘蔗愈伤组织的影响 [J], 李松;何新民;曾慧;陈庭速
2.甘蔗抗黑穗病品系早期筛选研究 [J], 夏红明;赵培方;刘家勇;赵俊;吴才文
3.甘蔗黑穗病菌拮抗菌HAS的筛选和鉴定 [J], 熊国如;赵更峰;伍苏然;冯翠莲;张树珍
4.与甘蔗抗黑穗病基因连锁的SSR标记筛选 [J], 高轶静;张荣华;张革民;杨柳;段维兴;王泽平;杨翠芳;游建华
5.甘蔗黑穗病菌SCoT-PCR反应体系优化与引物筛选 [J], 徐刚红;姜子德;沈万宽;罗明珠;饶得花
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甘蔗黑穗病菌SCoT-PCR反应体系优化与引物筛选
第３４卷第６期２０１５年㊀１１月华㊀中㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报J o u r n a l o fH u a z h o n g A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t yV o l ．３４㊀N o ．６N o v ．２０１５,３３~３９甘蔗黑穗病菌SCoT ＧPCR 反应体系优化与引物筛选徐刚红１㊀姜子德２㊀沈万宽１㊀罗明珠１㊀饶得花１１．华南农业大学农学院/农业部华南地区作物栽培科学观测实验站,广州５１０６４２;２．华南农业大学农学院/广东省微生物信号与病害防控重点实验室,广州５１０６４２摘要㊀以甘蔗黑穗病菌(S po r i s o r i u ms c i t a m i n e u m )交配型菌株基因组D N A 为模板,在单因素优化试验的基础上,采用L １６(４５)正交试验设计,对影响甘蔗黑穗病菌S C o T ＧP C R 反应体系的M g ２＋㊁d N T P s ㊁引物㊁r T a qD N A 聚合酶和模板用量５个因素进行优化,建立优化的甘蔗黑穗病菌S C o T ＧP C R 反应体系:D N A 模板１２．５０n g ㊁d N T P s ０．１７mm o l /L ㊁引物０．４６μm o l /L ㊁M g ２＋１．７mm o l /L ㊁r T a q DN A 聚合酶０．８５U ㊁１ˑB u f f e r (M g ２＋f r e e ),总体积２５μL .应用优化体系从３０条S C o T 引物中筛选扩增条带清晰且多态性丰富的１０条引物,并利用这１０条引物对１０份地理来源和寄主来源不同的甘蔗黑穗病菌交配型菌株基因组D N A 进行S C o T 标记,结果共扩增出８６条带,多态性比率为５８．６７％,平均每条引物扩增８．６０条.U P GMA 聚类分析结果表明:在遗传相似系数为０．７５的水平上,可将１０个菌株分为３类,聚类结果与菌株的地理来源有一定的相关性.关键词㊀甘蔗黑穗病菌;S C o T 标记;体系优化;U P GMA 聚类分析中图分类号㊀S４３２．４＋４;S４３５．６６１㊀㊀文献标识码㊀A㊀㊀文章编号㊀１０００Ｇ２４２１(２０１５)０６Ｇ００３３Ｇ０７收稿日期:２０１５Ｇ０１Ｇ０６基金项目:广东省公益研究与能力创新专项(２０１４A ０２０２０８０９４);华南农业大学人才引进启动资金项目(１３００９)徐刚红,硕士研究生．研究方向:甘蔗生物技术．E Ｇm a i l :g a n g h o n g３２３＠１６３．c o m 通信作者:沈万宽,博士,研究员．研究方向:甘蔗抗病育种及其分子机制．E Ｇm a i l :w k s h e n ６９＠１２６．c o m㊀㊀甘蔗(S a c c h a r u mo f fi c i n a r u m L ．)是世界上最重要的糖料作物,也是有发展潜力的可再生生物质能源作物.由甘蔗黑穗病菌(S po r i s o r i u ms c i t a m i Ｇn e u m )引起的甘蔗黑穗病是世界性重要甘蔗病害.目前,中国甘蔗主栽品种均普遍感染黑穗病,且田间发病率较高,经济损失严重[１].抗病育种是防治甘蔗黑穗病最有效最经济的方法,但至今国内蔗区甘蔗黑穗病菌生理小种尚不清楚,抗黑穗病育种盲目性较大且效果不明显.开展病原菌遗传分化的深入研究,有利于揭示病原菌的生理分化或生理小种分化.A F L P ㊁I S S R ㊁S S R ㊁R A P D ㊁S R A P 等分子标记,已先后应用于甘蔗黑穗病菌的遗传多样性研究[２Ｇ６],但都是传统意义上的随机D N A 分子标记,或是扩增非编码区域,或随机在基因组中扩增[７],难以真实反映甘蔗黑穗病菌在致病力等重要功能性状上的遗传分化.目标起始密码子多态性(s t a r t c o d o nt a r ge t e d p o l y m o r ph i s m ,S C o T )分子标记是一种新型的㊁基于翻译起始位点的目的基因标记技术,其根据A T G 翻译起始位点侧翼保守序列来设计单引物,扩增产生偏向候选功能基因区显性多态性标记[８].S C o T 标记结合了R A P D 标记和I S S R 标记的优点,可获得丰富的遗传信息,并能有效地产生与性状相关联的分子标记[９].该标记技术已被应用于水稻㊁花生㊁龙眼㊁葡萄㊁甘蔗㊁白灵菇㊁金针菇等植物和少数食用菌种质资源的鉴定评价㊁遗传图谱的构建㊁重要性状基因标记㊁基因差异表达与遗传多样性分析等的研究[８,１０Ｇ１５],但S C o T 分子标记应用于甘蔗黑穗病菌至今尚未见报道.建立稳定㊁可重复㊁高效的反应体系,筛选出多态性丰富的引物是S C o T 标记应用于甘蔗黑穗病菌的基础.笔者采用单因素试验和正交试验,建立了适宜的甘蔗黑穗病菌S C o T 标记体系,并利用该体系筛选多态性引物及进行少量菌株遗传多样性研究,旨在为S C o T 标记技术应用于甘蔗黑穗病菌遗传多样性分析提供科学依据.1㊀材料与方法1.1㊀供试菌株供试菌株为甘蔗黑穗病菌的单倍体交配型菌株,均为正交配型(表１).分离培养及交配型鉴定参照沈万宽等[１６]的方法进行.㊀㊀华中农业大学学报第３４卷㊀表１㊀甘蔗黑穗病菌菌株信息T a b l e １㊀I n f o r m a t i o no f S po r i s i r i u ms c i t a m i n e u m 菌株编号C o d e o f i s o l a t e寄主(甘蔗品种)H o s t (s u g a r c a n e v a r i e t i e s )地理来源G e o g r a ph i c a l o r i gi n １R O C ２２广东湛江Z h a n j i a n g G u a n g d o n g２粤糖８９Ｇ１１３Y T８９Ｇ１１３广东湛江Z h a n j i a n g G u a n g d o n g３台优T a i yo u 广西宜州Y i z h o uG u a n gx i ４台优T a i y o u 广西宜州Y i z h o uG u a n g x i ５R O C １０广东翁源W e n g y u a nG u a n g d o n g ６R O C ２２广东翁源W e n g y u a nG u a n g d o n g ７R O C １６江西赣州G a n z h o u J i a n g x i ８R O C １６江西赣州G a n z h o u J i a n g x i ９闽糖６９Ｇ４２１M T６９Ｇ４２１云南开远K a i y u a nY u n n a n １０云蔗０５Ｇ２１１Y Z ０５Ｇ２１１云南开远K a i yu a nY u n n a n 1.2㊀SCoT ＧPCR 引物试验共选用３０条引物,其中编号１~２３号引物来源于C o l l a r d 等[８]㊁２４~３０号引物来源于陈明辉等[１３]公布的引物序列.所有引物均委托上海生工生物工程有限公司合成.表２㊀S C o T 引物信息T a b l e ２㊀I m f o r m a t i o no f p r i m e r s编号C o d e 引物P r i m e r序列(５ᶄＧ３ᶄ)S e qu e n c e G C 比率/％G Cr a t e１S C o T ２C A A C A A T G G C T A C C A C C C５５．６２S C o T ３C A A C A A T G G C T A C C A C C G ５５．６３S C o T ４C A A C A A T G G C T A C C A C C T ５０．０４S C o T ５C A A C A A T G G C T A C C A C G A ５０．０５S C o T ６C A A C A A T G G C T A C C A C G C ５５．６６S C o T ７C A A C A A T G G C T A C C A C G G ５５．６７S C o T ８C A A C A A T G G C T A C C A C G T ５０．０８S C o T ９C A A C A A T G G C T A C C A G C A ５０．０９S C o T １０C A A C A A T G G C T A C C A G C C ５５．６１０S C o T １３A C G A C A T G G C G A C C A T C G ６１．１１１S C o T １６A C C A T G G C T A C C A C C G A C ６１．１１２S C o T １８A C C A T G G C T A C C A C C G C C ６６．７１３S C o T １９A C C A T G G C T A C C A C C G G C ６６．７１４S C o T ２１A C G A C A T G G C G A C C C A C A ６１．１１５S C o T ２２A A C C A T G G C T A C C A C C A C ５５．６１６S C o T ２３C A C C A T G G C T A C C A C C A G ６１．１１７S C o T ２４C A C C A T G G C T A C C A C C A T ５５．６１８S C o T ２７A C C A T G G C T A C C A C C G T G ６１．１１９S C o T ２８C C A T G G C T A C C A C C G C C A ６６．７２０S C o T ２９C C A T G G C T A C C A C C G G C C ７２．２２１S C o T ３０C C A T G G C T A C C A C C G G C G ７２．２２２S C o T ３１C C A T G G C T A C C A C C G C C T ６６．７２３S C o T ３４A C C A T G G C T A C C A C C G C A ６１．１２４S C o T ４８A C A A T G G C T A C C A C T G G C ５５．６２５S C o T ４９A C A A T G G C T A C C A C T G C G ５５．６２６S C o T ５７A C A A T G G C T A C C A C T A C G ５０．０２７S C o T ５９A C A A T G G C T A C C A C C A T C ５０．０２８S C o T ６８A C C A T G G C T A C C A G C G T C ６１．１３０S C o T ７６C C A T G G C T A C C A C T A C C G６１．１1.3㊀主要试剂与仪器２．５mm o l /Ld N T P s ㊁r T a q DN A 聚合酶(５U /μL )㊁１０ˑP C R b u f f e r (M g ２＋f r e e )㊁２５mm o l /L Mg ２＋及DL２０００m a r k e r 由T a K a R a 生物技术公司提供;G o l dv i e w 染色液及琼脂糖由广州健阳生物科技有限公司提供;P C R 仪(B I O ＧR A D M y c y c l e r );凝胶成像系统(T a n o n１６００);电泳仪(D Y Y Ｇ６C ).1.4㊀DNA 提取㊁扩增程序及产物检测甘蔗黑穗病菌交配型菌株基因组D N A 的提取采用C T A B 法进行[１７].对所提取的D N A 用１％琼脂糖凝胶电泳初步检测其质量,再用紫外分光光度计测定D N A 样品的浓度和纯度,并将D N A 稀释至５０n g /μL ,－２０ħ保存备用.P C R 扩增程序:９４ħ预变性５m i n ;９４ħ变性４５s ,５０ħ退火５０s ,７２ħ延伸２m i n ,循环３５次;７２ħ延伸８m i n.扩增反应结束后,取８μL 扩增产物于２．０％琼脂糖凝胶(含G o l dv i e w 染液)中进行电泳.电泳结束后在凝胶成像系统上采集图像.1.5㊀单因素试验选用１０号菌株基因组D N A 为模板,引物S C o T １８,在预备试验体系,即总体积２５μL 中１０ˑB u f f e r (M g ２＋fr e e )２．５μL ㊁d N T P s０．２mm o l /L ㊁M g ２＋２．０mm o l /L ㊁引物０．２μm o l /L ㊁r T a q DN A 聚合酶１U ㊁模板２５．００n g 的基础上,针对影响S C o T ＧP C R 反应体系的５个主要因素设置５因素７水平的单因素试验,每个因素重复２次(表３).表３㊀单因素试验的因素和水平T a b l e ３㊀F a c t o r s a n d l e v e l s o f s i n gl e f a c t o r t e s t 编号C o d e 脱氧核苷酸/(mm o l /L )d N T P s 引物/(μm o l /L )P r i m e r 镁离子/(mm o l /L )M g２＋r T a q D N A 聚合酶/U r T a q D N A p o l ym e r a s e D N A 模板/n g T e m p l a t e D N A １０．１１０．１６１．１０．５５６．２５２０．１４０．２２１．４０．７０１２．５０３０．１７０．２８１．７０．８５２５．００４０．２００．３４２．０１．００５０．００５０．２３０．４０２．３１．１５７５．００６０．２６０．４６２．６１．３０１００．００７０．２９０．５２２．９１．４５１２５．００1.6㊀正交试验在单因素试验筛选出合适因素水平的基础上,以１０号菌株基因组D N A 为模板和引物S C o T １８进行５因素４水平的正交优化试验,每个组合重复２次(表４).1.7㊀数据统计与分析对S C o T 扩增产物的电泳结果进行人工比对㊁校正,有条带记为１,无条带记为０,形成０㊁１矩阵.利用P O P G E N E１．３２软件计算有效等位基因数(N e )㊁N e i ᶄs 基因多样性指数(H )㊁S h a n n o n ᶄs 信息指数(I ).利用N T S Y S Ｇp c ２．１软件,进行相似性分析形成相似系数矩阵,按U P G M A 方法进行聚类分析.４３㊀第６期徐刚红等:甘蔗黑穗病菌S C o T ＧP C R 反应体系优化与引物筛选㊀表４㊀S C o T ＧP C RL １６(４５)正交试验设计T a b l e ４㊀L １６(４５)o r t h o g o n a l d e s i gn f o r S C o T ＧP C R 水平L e v e l 脱氧核苷酸/(mm o l /L )d N T P s 引物/(μm o l /L )P r i m e r 镁离子/(mm o l /L )M g２＋r T a q D N A 聚合酶/U r T a q D N A p o l ym e r a s e D N A 模板/n g T e m p l a t e D N A １０．１４０．２８１．１０．７０１２．５０２０．１４０．３４１．４０．８５２５．００３０．１４０．４０１．７１．００５０．００４０．１４０．４６２．０１．１５７５．００５０．１７０．２８１．４１．００７５．００６０．１７０．３４１．１１．１５５０．００７０．１７０．４０２．００．７０２５．００８０．１７０．４６１．７０．８５１２．５０９０．２００．２８１．７１．１５２５．００１００．２００．３４２．０１．００１２．５０１１０．２００．４０１．１０．８５７５．００１２０．２００．４６１．４０．７０５０．００１３０．２３０．２８２．００．８５５０．００１４０．２３０．３４１．７０．７０７５．００１５０．２３０．４０１．４１．１５１２．５０１６０．２３０．４６１．１１．００２５．００2㊀结果与分析2.1㊀SCoT ＧPCR 单因素试验结果１)模板D N A 浓度对S C o T ＧP C R 反应的影响.由图１可见,当模板用量６．２５n g 时,电泳条带较暗且缺带;模板用量在１２．５~１２５．０n g 时,都能扩增出清晰可辨㊁完整一致的条带,说明模板浓度对S C o T ＧP C R 反应影响不大,在２５μL 体系中,模板浓度在１２．５０~１２５．００n g 均可行.考虑成本和扩增效果,故选择１２．５０~７５．００n g 作为后续正交试验的模板浓度梯度范围.㊀㊀M :D L２０００m a r k e r ;１~７:６．２５,１２．５０,２５．００,５０．００,７５．００,１００．００,１２５．００n g ;１ᶄ~７ᶄ是１~７的重复样品㊀L a n e s １ᶄＧ７ᶄa r e t h e r e p e a t s a m p l e s o f １Ｇ７,r e s p e c t i v e l y．图１㊀模板D N A 浓度对S C o T ＧP C R 反应的影响F i g ．１㊀E f f e c t o f D N A t e m pl a t ec o n c e n t r a t i o n o nS C o T ＧP C R r e a c t i o n㊀㊀２)d N T P s 浓度对S C o T ＧP C R 反应的影响.由图２可知,当d N T P s 用量在０．１１~０．１４mm o l /L 时,扩增条带模糊且有缺失,重复性不好;在０．２３~０．２９mm o l /L 时,条带数量多,但略有弥散且有条带缺失;用量在０．１７~０．２０mm o l /L 时,条带丰富㊁清晰㊁且重复性好.这表明d N T P s 用量以０．１７mm o l /L 最佳,故选择０．１４~０．２３mm o l /L 作为后续正交试验的d N T P s 浓度梯度范围.㊀㊀M :D L２０００m a r k e r ;１~７:０．１１,０．１４,０．１７,０．２０,０．２３,０．２６,０．２９m m o l /L ;１ᶄ~７ᶄ是１~７的重复样品㊀L a n e s １ᶄＧ７ᶄa r e t h e r e p e a t s a m p l e s o f １Ｇ７,r e s p e c t i v e l y．图２㊀d N T P s 浓度对S C o T ＧP C R 反应的影响F i g．２㊀E f f e c t o f d N T P s c o n c e n t r a t i o n o nS C o T ＧP C R r e a c t i o n㊀㊀３)引物浓度对S C o T ＧP C R 反应的影响.由图３可知,引物浓度对S C o T ＧP C R 反应有较明显的影响.引物浓度在０．１６~０．２２μm o l /L 时,扩增条带模糊且量少;在０．２８~０．５２μm o l /L 之间都能扩增到清晰的条带,d N T P s 浓度在０．３４μm o l /L 时扩增效果最佳,故选择０．２８~０．４６μm o l /L 作为后续正交试验的引物浓度梯度范围.㊀㊀M :D L２０００m a r k e r ;１~７:０．１６,０．２２,０．２８,０．３４,０．４０,０．４６,０．５２μm o l /L ;１ᶄ~７ᶄ是１~７的重复样品㊀L a n e s １ᶄＧ７ᶄa r et h e r e p e a t s a m p l e s o f １Ｇ７,r e s p e c t i v e l y．图３㊀引物浓度对S C o T ＧP C R 反应的影响F i g ．３㊀E f f e c t o f pr i m e r c o n c e n t r a t i o n o nS C o T ＧP C R r e a c t i o n㊀㊀４)r T a q DN A 聚合酶用量对S C o T ＧP C R 反应的影响.由图４可知,r T a q DN A 聚合酶用量为０．５５U 和０．７０U 时扩增条带有缺失且产量少;用量１．１５~１．４５U 时非特异性增强,电泳条带模糊,分离界限不清;用量在０．８５U 和１．００U 时均能扩增出清晰完整条带且差异不大,但１．００U 时效果更佳,故选择０．７０㊁０．８５㊁１．００㊁１．１５U 作为后续正交试验中r T a q DN A 聚合酶的梯度范围.㊀㊀M :D L２０００m a r k e r ;１~７:０．５５,０．７０,０．８５,１．００,１．１５,１．３０,１．４５U ;１ᶄ~７ᶄ是１~７的重复样品L a n e s１ᶄＧ７ᶄa r e t h e r e p e a t s a m p l e s o f １Ｇ７,r e s p e c t i v e l y．图４㊀r T a q D N A 聚合酶用量对S C o T ＧP C R 反应的影响F i g ．４㊀E f f e c t o f d o s a g eo f r T a q D N A p o l ym e r a s e o nS C o T ＧP C R r e a c t i o n５３㊀㊀华中农业大学学报第３４卷㊀㊀㊀５)M g２＋浓度对S C o TＧP C R反应的影响.由图５可知,当M g２＋浓度为１．１mm o l/L时扩增条带缺失,用量为１．４mm o l/L时,条带完整但条带暗且产量少;M g２＋浓度在１．７~２．９mm o l/L时能扩增产量丰富的条带,但在２．６~２．９mm o l/L时扩增出现非特异性条带,背景噪音增大,表明１．７mm o l/L 是最佳,故选择１．４~２．３mm o l/L作为后续正交试验中M g２＋浓度的梯度范围.㊀㊀M:D L２０００m a r k e r;１~７:１．１,１．４,１．７,２．０,２．３,２．６,２．９mm o l/L;１ᶄ~７ᶄ是１~７的重复样品㊀L a n e s１ᶄＧ７ᶄa r e t h e r e p e a t s a m p l e s o f１Ｇ７,r e s p e c t i v e l y．图５㊀M g２＋浓度对S C o TＧP C R反应的影响F i g．５㊀E f f e c t o fM g２＋c o n c e n t r a t i o no nS C o TＧP C R r e a c t i o n 2.2㊀SCoTＧPCR正交试验结果以单因素试验确定的各因素浓度梯度范围进行L１６(４５)正交试验.在P C R产物上样量相同的前提下,各因素不同浓度组合形成的反应体系扩增结果存在明显差异(图６).其中组合１几乎无扩增条带,组合５㊁６㊁１６扩增条带严重缺失,组合２㊁３㊁９㊁１１㊁１２㊁１３㊁１４㊁１５也出现不同程度的缺带现象且条带模糊,组合４㊁７㊁８㊁１０都能扩增出稳定的９条带,并且２次重复试验结果一致,但是组合４扩增产物背景噪音较大,条带清晰度相对较差.组合７㊁１０相对于组合８扩增产物量少,电泳条带稍暗,组合８重复性更好.因此,试验结果确定正交试验的最优体系是组合８,即２５μL体系中,１ˑB u f f e r(M g２＋f r e e)２．５μL㊁D N A模板１２．５n g㊁d N T P s０．１７mm o l/L㊁引物０．４６μm o l/L㊁M g２＋１．７mm o l/L㊁r T a q D N A聚合酶０．８５U .㊀㊀M:D L２０００m a r k e r;处理组合１~１６见表４L e v e l c o m b i n a t i o n㊀１Ｇ１６a r e s h o w e d i nT a b l e４;１ᶄ~１６ᶄ是１~１６的重复样品㊀L a n e s１ᶄＧ１６ᶄa r e t h e r e p e a t s a m p l e s o f１Ｇ１６,r e s p e c t i v e l y．图６㊀S C o TＧP C R反应体系正交试验的优化结果F i g．６㊀R e s u l t s o f S C o TＧP C Rs y s t e mo p t i m i z e dw i t ho r t h o g o n a l d e s i g n2.3㊀SCoTＧPCR优化体系的验证及引物筛选根据上述优化试验所得反应体系,以引物S C o T２㊁S C o T１３㊁S C o T１８对供试的１０个菌株进行扩增,以验证该反应体系的稳定性和可靠性.由图７可见,不同菌株扩增条带均清晰可辨,主带稳定,多态性丰富,表明该体系可用于甘蔗黑穗病菌S C o TＧP C R扩增反应.应用该体系,以１０号菌株D N A为模板,从参试的３０条引物中筛选出能产生清晰扩增产物,多态性丰富的１０条引物,即S C o T２㊁S C o T１３㊁S C o T１８㊁S C o T１９㊁S C o T２１㊁S C o T２２㊁S C o T２８㊁S C o T２９㊁S C o T６８㊁S C o T７２.由表５可知,１０条引物共扩增出８６条带,其中多态性带５１条,多态性比率为,每条引物扩增条带为５~１４条,扩增产物的片段大小主要集中在５００~２５００b p,多态性比率为５０％~８６％,引物㊀㊀M:D L２０００m a r k e r;泳道１~１０:１~１０号菌株(表１) L a n e s１Ｇ１０:I s o l a t e s１Ｇ１０(s e e T a b l e１);A:引物S C o T２P r i m e rS C o T２;B:引物S C o T１３P r i m e rS C o T１３;C:引物S C o T１８P r i m e r S C o T１８．图７㊀部分引物对１０个菌株的S C o TＧP C R扩增F i g．７㊀S C o TＧP C Ra m p l i f i c a t i o ne f f i c i e n c y i n１０i s o l a t e sf o r s o m e p r i m e r s６３㊀第６期徐刚红等:甘蔗黑穗病菌S C o TＧP C R反应体系优化与引物筛选㊀S C o T２１的多态性比率最高;各引物有效等位基因数(N e)的变化范围为１．２３~１．６４,平均值１．３８,N e值最高的引物是S C o T２８;各引物的N e iᶄs基因多样性指数(H)的变化范围为０．１６~０．３３,平均值为０．２２,最高的引物为S C o T２８;S h a n n o nᶄs信息指数(I)变化范围为０．２６~０．４６,平均值为０．３３,最高的引物为S C o T２８.这表明所筛选的１０条S C o T引物具有较高的多态性检测效率,能够进行甘蔗黑穗病菌的遗传多样性分析.表５㊀S C o T引物的多态性分析T a b l e５㊀P o l y m o r p h i s ma n a l y s i s o f S C o T p r i m e r s引物P r i m e r N e H I条带数B a n d s多态性条带数P o l y m o r p h i cb a n s多态性比率/％P o l y m o r p h i cr a t eS C o T２１．２３０．１６０．２６５３６０．００S C o T１３１．３５０．２００．３０１２６５０．００S C o T１８１．４８０．２７０．３９１４９６４．２９S C o T１９１．３６０．２２０．３３５３６０．００S C o T２１１．３７０．２４０．３８７６８５．７１S C o T２２１．４１０．２２０．３１８４５０．００S C o T２８１．６４０．３３０．４６９６６６．７０S C o T３１１．３１０．１９０．２８８４５０．００S C o T３４１．２９０．１７０．２６６３５０．００S C o T７２１．３５０．２００．３０１２６５０．００平均A v e r a g e１．３８０．２２０．３３８．６０５．００５８．６７2.4㊀SCoTＧPCR在遗传多样性分析中的应用遗传相似性分析结果显示,１０个菌株的相似系数值分布在０．６２２８~０．８９５３,平均为０．７５７８,其中同为采自江西赣州R O C１６的７号菌株和来自江西赣州R O C１６的８号菌株的相似系数最高(０．８９５３);采自广东翁源R O C１０的５号菌株和来自江西赣州R O C１６的７号菌株的相似系数最小(０．６２２８),遗传差异最大.总之,供试的１０个菌株遗传变异不大,但也存在遗传多样性的分化.基于S C o T标记的U P GMA聚类(图８),在相似系数为０．７５的水平上,可将１０个菌株分为３大类,其中５号菌株单独聚为一类(Ⅲ),１㊁２㊁３㊁４㊁６号菌株聚为一类(Ⅰ),７㊁８㊁９㊁１０号菌株聚为一类(Ⅱ);在相似系数为０．７９时,可将Ⅰ类和Ⅱ类分别再分为２个亚类Ⅰa㊁Ⅰb和Ⅱa㊁Ⅱb,其中Ⅰa包括１㊁２㊁３号菌株,１㊁２号菌株均采自广东湛江;Ⅰb包括４㊁６号菌株,３㊁４号菌株采自同一地区广西宜州,虽然不在同一个亚类,但同属于Ⅰ类中;Ⅱa包括来自江西赣州的７㊁８号菌株,Ⅱb为采自云南开远的９㊁１０号菌株.由聚类结果可知,具有相同地理来源的菌株遗传差异小,亲缘关系近,聚类结果与地理来图８㊀１０个菌株S C o T标记U P G M A的聚类分析F i g．８㊀U PG M Ad e n d r o g r a mo f１０i s o l a t e sb a s e do nS C o Tm a r k e r s源有一定的相关性.本试验所建立的甘蔗黑穗病菌S C o TＧP C R反应体系稳定可靠,所筛选的引物多态性丰富,能用于甘蔗黑穗病菌的遗传相似性研究. 3㊀讨㊀论S C o T标记作为一种基于P C R技术的新型分子标记,具有操作简单㊁成本低廉㊁引物设计简单且具有通用性㊁多态性高㊁能有效产生和性状连锁的标记等诸多优点[９].建立稳定的S C o TＧP C R反应体系和反应程序后,便可对大量样品进行标记分析.但P C R反应受诸多因素的影响,因此确定合适的反应参数是成功应用S C o TＧP C R标记技术的前提. P C R反应体系优化的方法很多,一般采用单因素试验和正交试验.单因素试验能对每项因素逐项优化,操作简单,能设计较广的浓度范围和较多的梯度,不同因素水平扩增效果对比鲜明,能从中轻易选出该因素的最佳用量或合适的用量范围,但单因素试验不能考察P C R体系中各组分的交互作用,也不能保证各组分最佳浓度的组合就是最佳反应体系[１８].正交试验设计具有均衡分散㊁整齐可比㊁效应明确的特性,可综合考察反应体系中各因素及其交互作用,较快地找到最优的水平组合[１９],但正交试验设计的浓度梯度范围较小,容易偏离适合P C R 反应的浓度范围[２０].本研究在单因素试验建立甘蔗黑穗病菌S C o TＧP C R反应体系中各因素的适宜浓度范围的基础上,再设计正交试验以快速确立最适S C o TＧP C R反应体系.对S C o TＧP C R反应体系中的５个不同影响因素进行梯度试验,结果表明,在一定范围内D N A模板㊁引物㊁d N T P s对扩增效果的影响较小,而M g２＋和r T a q D N A酶对扩增效果的影响较显著.这些与苏亚春等[２１]的研究结果一致,但与李强等[２２]㊁７３㊀㊀华中农业大学学报第３４卷㊀张君玉等[１８]的研究结果有差异.因此,当特定物种进行S C o T标记时,应对其反应体系进行优化,从而保证反应体系的稳定性和可靠性.本研究从３０条参试引物中共筛选出１０条条带清晰㊁多态性丰富㊁重复性好的S C o T引物.用筛选出来的１０条引物对来自不同地域和寄主的１０个甘蔗黑穗病菌交配型菌株进行扩增,均能获得清晰稳定㊁多态性丰富的扩增结果.１０条引物共扩增８６条带,平均每条扩增８．６条带,多态性比率为５９．３％.扩增条带数和多态性比率低于陈虎等[１１]的研究结果,即利用S C o T标记分析龙眼遗传多样性中的条带数和比率为８５．８％,也低于苏亚春等[２１]的研究结果,即利用S C o T对甘蔗扩增的条带数和比率为８２．１４％.这可能是由于本研究甘蔗黑穗病菌基因组相较于龙眼㊁甘蔗等植物基因组小得多,功能性状基因相对较少,导致扩增条带少㊁多态性比率低.U P GMA聚类分析初步表明,聚类结果与菌株地理来源有一定的相关性,这与S h e n等[３]应用I S S R和R A P D分子标记技术对中国华南蔗区３５个甘蔗黑穗病菌交配型分离物进行遗传多样性研究的结果基本一致,也与Q u e等[４]应用R A P D和S R A P 分子标记技术对采自中国福建㊁云南㊁广东㊁广西㊁海南㊁江西６省甘蔗品种上的２３个甘蔗黑穗病菌双核菌丝分离物进行遗传多样性研究的结果基本一致.参㊀考㊀文㊀献[１]㊀沈万宽．广东蔗区甘蔗病害现状与综合防治措施[J]．甘蔗糖业,２００４(１):１Ｇ５．[２]㊀S I N G H N,S OMA IB M,P I L L A Y D．M o l e c u l a r p r o f i l i n g d e mＧo n s t r a t e sl i m i t e d d i v e r s i t y a m o n g s t g e o g r a p h i c a l l y s e p a r a t e s t r a i n s[J]．F E M S M i c r o b i o l o g y L e t t e r s,２００５,２４７(１):７Ｇ１５．[３]㊀S H E N W K,X I PG,L IM H,e t a l．G e n e t i c d i v e r s i t y o f U s t i l aＧg o s c i t a m i n e a S y d．i nS o u t h e r n C h i n ar e v e a l e db y c o m b i n e dI S S Ra n dR A P Da n a l y s i s[J]．A f r i c a nJ o u r n a l o fB i o t e c h n o l oＧg y,２０１２,１１(５４):１１６９３Ｇ１１７０３．[４]㊀Q U E Y X,X U L P,L I N J W,e ta l．M o l e c u l a rv a r i a t i o no f S p o r i s o r i u m s c i t a m i n e u m i n M a i n l a n d C h i n a r e v e a l e d b y R A P Da n dS R A P m a r k e r s[J]．P l a n tD i s e a s e,２０１２,９６(１０):１５１９Ｇ１５２５．[５]㊀陈健文,冯淑杰,钟玫,等．基于S S R标记的广东省甘蔗黑穗病菌遗传多样性研究[J]．广东农业科学,２０１２(２４):１５４Ｇ１５７．[６]㊀B R A I T HWA I T EKS,B A K K E R E N G,C R O F TBJ,e t a l．G eＧn e t i c v a r i a t i o n i naw o r l d w i d e c o l l e c t i o no f t h e s u g a r c a n e s m u tf u ng u s U s t i l a g o s c i t a m i n e a[J]．P r o c e d i n g o fA u s t r a l i a nS o c i eＧt y o f S u g a rC a n eT e c h n o l o g i s t s,２００４,２６:４８．[７]㊀陆才瑞,喻树迅,于霁雯,等．功能型分子标记(I S A P)的开发及评价[J]．遗传,２００８(９):１２０７Ｇ１２１６．[８]㊀C O L L A R D B C Y,MA C K I L L D J．S t a r tc c o d o nt a r g e t e d (S C o T)p o l y m o r p h i s m:a s i m p l e,n o v e l D N A m a r k e r t e c h n i q u ef o rg e n e r a t i n gg e n eＧt a r g e t e dm a r k e r s i n p l a n t s[J]．P l a n t M oＧl e c u l a rB i o l o g y R e p o r t e r,２００９,２７(１):８６Ｇ９３．[９]㊀熊发前,唐荣华,陈忠良,等．目标起始密码子多态性(S C o T):一种基于翻译起始位点的目的基因标记新技术[J]．分子植物育种,２００９,７(３):６３５Ｇ６３８．[１０]熊发前,蒋菁,钟瑞春,等．目标起始密码子多态性(S C o T)分子标记技术在花生属中的应用[J]．作物学报,２０１０,３６(１２):２０５５Ｇ２０６１．[１１]陈虎,何新华,罗聪,等．龙眼２４个品种的S C o T遗传多样性分析[J]．园艺学报,２０１０,３７(１０):１６５１Ｇ１６５４．[１２]G U O DL,Z H A N GJY,L I U C H．G e n e t i cd i v e r s i t y i ns o m eg r a p e v a r i e t i e s r e v e a l e d b y S C o Ta n a l y s e s[J]．M o l e c u l a r B i o l oＧg y R e p o r t s,２０１２,３９(５):５３０７Ｇ５３１３．[１３]陈明辉,张保青,宋修鹏,等．宿根矮化病菌诱导甘蔗差异表达基因的c D N AＧS C o T分析[J]．作物学报,２０１３,３９(６):１１１９Ｇ１１２６．[１４]赵梦然,陈强,黄晨阳,等．中国野生白灵菇遗传多样性的S C o T 分析[J]．园艺学报,２０１２,３９(１２):２４７５Ｇ２４８２．[１５]张斌．S C o T和I S S R分析金针菇单核体遗传差异的研究[J]．安徽农业科学,２０１３,４１(３０):１１９４７Ｇ１１９４９．[１６]沈万宽,姜子德,杨湛端,等．甘蔗抗黑穗病的鉴定新方法及其品种抗性评价[J]．华中农业大学学报,２０１４,３３(２):５１Ｇ５６．[１７]沈万宽,习平根,姜子德．甘蔗鞭黑粉菌I S S RＧP C R反应体系的优化[J]．江西农业大学学报,２０１２,３４(４):７１２Ｇ７１７．[１８]张君玉,郭大龙,龚莹,等．葡萄目标起始密码子多态性反应体系的优化[J]．果树学报,２０１１,２８(２):２０９Ｇ２１４．[１９]郭大龙,张君玉,李猛,等．葡萄S R A P反应体系优化及引物筛选[J]．基因组学与应用生物学,２０１０,２９(２):３７９Ｇ３８４．[２０]杨水云,李续娥,吴明宇,等．正交实验法在P C R反应条件优化中的应用[J]．生物数学学报,２００５,２０(２):２０２Ｇ２０６．[２１]苏亚春,凌辉,王恒波,等．甘蔗S C o TＧP C R反应体系优化与多态性引物筛选及应用[J]．应用与环境生物学报,２０１２,１８(５):８１０Ｇ８１８．[２２]李强,苏二虎,高聚林,等．大豆S C o T分子标记技术体系的优化㊁验证及检测[J]．中国油料作物学报,２０１３,３５(５):４９１Ｇ４９８．８３㊀第６期徐刚红等:甘蔗黑穗病菌S C o TＧP C R反应体系优化与引物筛选㊀９３O p t i m i z a t i o no f S C o TＧP C Rs y s t e ma n d s c r e e n i n g o fp o l y m o r p h i c p r i m e r s i n S p o r i s o r i u ms c i t a m i n e u mX U G a n gＧh o n g１㊀J I A N GZ iＧd e２㊀S H E N W a nＧk u a n１㊀L U O M i n gＧz h u１㊀R A O D eＧh u a１１．C o l l e g e o f A g r o n o m y,S o u t hC h i n aA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y/S c i e n t i f i cO b s e r v i n ga n dE x p e r i m e n t a lS t a t i o no f C r o p C u l t i v a t i o n i nS o u t hC h i n a,M i n i s t r y o f A g r i c u l t u r e,G u a n g z h o u５１０６４２,C h i n a;２．C o l l e g e o f A g r o n o m y,S o u t hC h i n aA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,G u a n g d o n g K e y L a b o r a t o r y o f M i c r o b i a lS i g n a l sa n dD i s e a s eC o n t r o l,G u a n g z h o u５１０６４２,C h i n aA b s t r a c t㊀I n t h i s r e s e a r c h,t h e g e n o m i cD N Ao fm a t i n g t y p e i s o l a t eo f S p o r i s o r i u ms c i t a m i n e u m w a s u s e da st h et e m p l a t e,f i v e i m p a c t f a c t o r s,n a m e l y,t e m p l a t eD N A,M g２＋,d N T P s,p r i m e ra n d r T a q D N A p o l y m e r a s e,w h i c hw e r e t h e c o m p o n e n t s o f P C Rr e a c t i o n s y s t e m,w e r e o p t i m i z e d r e s p e c t i v eＧl y b y s i n g l e f a c t o r t e s t．B a s e do n t h e r e s u l t s,L１６(４５)o r t h o g o n a l d e s i g nw a s a p p l i e d f o r e s t a b l i s h i n g t h e b e s t SC o TＧP C Rs y s t e mf o r S p o r i s o r i u ms c i t a m i n e u m,o fw h i c ht h e t o t a l２５μLr e a c t i o ns y s t e m c o nＧt a i n e d１２．５０n g t e m p l a t eD N A,０．１７mm o l/Ld N T P s,０．４６μm o l/L p r i m e r,１．７mm o l/L,０．８５Ur T a q D N A p o l y m e r a s e a n d１ˑB u f f e r(M g２＋f r e e)．F u r t h e r m o r e,１０p o l y m o r p h i c p r i m e r sw e r e s c r e e n e do u t o f３０t e s t e d p r i m e r s b a s e do n t h e a b o v e o p t i m i z e d s y s t e m,a n d t h e nu s e d f o r t e s t i n g１０m a t i n g t y p e i s oＧl a t e s o f S p o r i s o r i u ms c i t a m i n e u m w i t hd i f f e r e n t g e o g r a p h i c a l o r i g i n s a n dd i f f e r e n th o s t s．At o t a l o f８６b a n d sw e r e g e n e r a t e d f r o mt h e１０S C o T p r i m e r s,o fw h i c h５８．６７％w a s p o l y m o r p h i ca n de a c h p r i m e r g e n e r a t e d８．６０b a n d s i na v e r a g e．U P GMAc l u s t e r a n a l y s i s s h o w e d t h a t１０i s o l a t e s c o u l db ed i v i d e d i n t o ３g r o u p sw i t h a c o e f f i c i e n t o f０．７５,a n d t h e g e n e t i c d i v e r s i t y h a s c e r t a i n c o r r e l a t i o nw i t h g e o g r a p h i c a l o rＧi g i n s．K e y w o r d s㊀S p o r i s o r i u ms c i t a m i n e u m;s t a r t c o d o nt a r g e t e d p o l y m o r p h i s m(S C o T)m a r k e r;s y sＧt e mo p t i m i z a t i o n;U P GMAc l u s t e r a n a l y s i s(责任编辑:陈红叶)。
甘蔗黑穗病菌(Ustilago scitaminea Syd.)分子多样性初步分析
农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12(6):685~689*基金项目：国家高技术研究与发展计划（863）项目（No.2002AA241031）和国家自然科学基金项目（No.30170639）联合资助。
阙友雄：男，1980年生，硕士研究生。
**通讯作者。
Author for correspondence.E-mail:<xlpmail@>.收稿日期：2004-04-29接受日期:2004-06-21·研究论文·甘蔗黑穗病菌（Syd.）分子多样性初步分析*阙友雄许莉萍**邹添堂陈如凯（福建农林大学农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室，福州350002）摘要：应用经筛选的13条10bp 随机引物，对来自福建等6个省（区）甘蔗(ssp.)上的18个甘蔗黑穗病菌（）分离物进行了RAPD 分析。
来自福建和广西的2个代号分别为7和9的分离物间，显示出最大的相异系数为0.89474；最小相异系数为0.25217,是在两个福建分离物间出现的。
UPGMA 聚类结果表明，18个分离物在0.75的相异水平上可以聚为6个群体，7个来自不同寄主品种的福建分离物相异系数较小，分布于2个相邻的遗传聚类群中，同时，2个来自同一寄主品种不同地理来源的分离物间，显示出高达0.82353的相异系数。
说明分子多样性同地理来源之间具有一定的相关性，但与寄主来源无关。
关键词：甘蔗；黑穗病菌；RAPD ;分子多样性；UPGMAPrimary Analysis of Molecular Diversity in Populations of theFungusSyd.QUE You-Xiong XU Li-Ping**ZOU Tian-Tang CHEN Ru-Kai(Key Laboratory of Eco-physiology &Genetics Improvement for Sugarcane,Ministry of Agriculture,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)Eighteen isolates were obtained from sugarcane smut fungus (Syd).cultivated in six differentprovinces or regions including Fujian Province.On the basis of isolation of single spore and the acquisition of series of the isolates,13random primers of 10bp were occupied in analysis of genetic diversity by RAPD.The largest dissimilarity coefficient was 0.89474,being observed in two isolates with codes of 7and 9originated from Fujian and Guangxi,respectively;the smallest value of 0.25217was observed in two isolates originated in Fujian.Dendrogram of UPGMA cluster analysis revealed that 18isolates ofSyd.were divided into 6groups according to the dissimilarity coefficient of 0.75.Because of small dissimilarity coefficient,seven iso-lates obtained from sugarcane in Fujian Province belonged to two adjacent groups of cluster Ⅰand cluster Ⅱ.High dissimilarity coef-ficient of 0.82353was observed in two isolates collected from same host origin but with different geographical origin.The results of cluster suggested that the molecular diversity was associated with geographyic origins in some degree,but not related to hostorigin.sugarcane （spp ）;Syd;RAPD;molecular diversity;UPGMA由黑粉菌（Syd.）引起的甘蔗黑穗病是一种世界性病害，也是危害我国甘蔗生产的最主要真菌性病害[1]。
甘蔗黑穗病的发生
甘蔗黑穗病的防治效果
减少病原菌数量
通过采取有效的防治措施，可以显著减少田间甘蔗黑穗病的病原 菌数量，降低病害的流行程度。
保护甘蔗生长
防治甘蔗黑穗病可以避免病原菌对甘蔗的侵染和为害，保护甘蔗的 健康生长，提高甘蔗的产量和品质。
提高经济效益
通过防治甘蔗黑穗病，可以减少甘蔗产量的损失，提高甘蔗种植的 经济效益。
生和流行。
土壤贫瘠、缺乏有机质或过度使 用化肥等，都会降低甘蔗的抗病 能力，增加感染黑穗病的风险。
甘蔗黑穗病的影响因素
品种抗性
不同品种的甘蔗对黑穗病的抗性有差异，有些品种天生就容易感染 黑穗病，而有些品种则具有较强的抗病性。
气候条件
气候条件对甘蔗黑穗病的发生和流行有很大影响。潮湿、阴雨天气 有利于病原菌的繁殖和传播，从而增加甘蔗感染黑穗病的风险。
该病害由甘蔗黑粉菌 引起，属于担子菌门 冬孢纲黑粉菌目。
甘蔗黑穗病的症状
甘蔗黑穗病的症状主要表现在甘蔗的 茎秆和叶片上。
孢子堆表面粗糙，形状不规则，大小 不一，可覆盖整个茎秆或叶片。
发病初期，甘蔗的茎秆和叶片出现淡 黄色或黄绿色的条纹，随后逐渐变深 ，最终形成黑色或深褐色的孢子堆。
孢子堆内的孢子成熟后，会散出黑粉 状的孢子，这些孢子是病原菌的繁殖 体。
甘蔗黑穗病的病原
甘蔗黑穗病是一种由真菌引起的病害，病原为Ustilago scitaminea（拉文名），属 于担子菌亚门黑粉菌目。
该病原主要侵染甘蔗的幼芽和幼苗，在甘蔗生长过程中形成黑穗状病株。
病菌可在土壤中存活，也可通过种子带菌传播。
甘蔗黑穗病的传播途径
甘蔗黑穗病主要通过带菌土壤 、带菌种苗、昆虫及风雨等传 播。
04
甘蔗黑穗病的防治实践及 效果
甘蔗应答黑穗病菌侵染的转录组与蛋白组研究及抗性相关基因挖掘
甘蔗应答黑穗病菌侵染的转录组与蛋白组研究及抗性相关基因挖掘一、本文概述甘蔗作为一种重要的经济作物，在全球糖业生产中占有举足轻重的地位。
然而，甘蔗应答黑穗病菌侵染的问题一直是困扰甘蔗种植业的难题。
黑穗病菌的侵染不仅导致甘蔗产量的大幅下降，同时也严重影响了甘蔗的品质，给甘蔗种植户带来了严重的经济损失。
因此，深入研究甘蔗应答黑穗病菌侵染的分子机制，挖掘甘蔗中的抗性相关基因，对于提高甘蔗的抗病性，保障甘蔗产业的可持续发展具有重要意义。
本文综合运用了转录组学和蛋白质组学的研究方法，全面解析了甘蔗应答黑穗病菌侵染过程中的基因表达变化和蛋白质互作网络。
我们通过对甘蔗接种黑穗病菌后的转录组和蛋白组数据进行深度挖掘，旨在揭示甘蔗应答黑穗病菌侵染的分子机制，并筛选出与甘蔗抗病性紧密相关的关键基因。
这些研究结果将为甘蔗抗病育种提供新的基因资源和理论依据，同时也为其他作物的抗病性研究提供借鉴和参考。
在接下来的章节中，我们将详细介绍实验材料的准备、实验方法的选择、数据分析的过程以及结果的解读。
我们期望通过本文的研究，能够为甘蔗抗病育种和病害防治提供有力的科学支撑，为甘蔗产业的健康发展贡献一份力量。
二、材料与方法本研究选用了对黑穗病菌侵染具有不同抗性表现的甘蔗品种，包括高感品种、中抗品种和高抗品种。
同时，我们采集了健康植株以及在侵染早期、中期和晚期的受黑穗病菌侵染的甘蔗样本。
主要试剂包括RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、qPCR试剂盒等。
仪器主要包括离心机、PCR仪、凝胶成像系统、高通量测序仪、质谱仪等。
将采集的甘蔗样本进行清洗、剪碎并立即放入液氮中冷冻，以保留样品的RNA。
按照RNA提取试剂盒的说明提取总RNA，并使用质检方法对RNA的质量和完整性进行检测。
将提取的总RNA反转录为cDNA，构建测序文库，并在高通量测序仪上进行测序。
测序数据经过质量控制后，使用生物信息学方法进行组装、注释和差异表达分析。
将甘蔗样本进行蛋白提取，并使用质谱仪进行蛋白组测序。
甘蔗常用亲本黑穗病抗性初步调查
甘蔗常用亲本黑穗病抗性初步调查雷敬超;张保青;高丽花;唐仕云;经艳;周珊;高轶静【摘要】为明确甘蔗常用亲本宿根黑穗病的发生情况及品种抗性,2017年对我单位海南杂交基地的401个常用亲本一年宿根的黑穗病发生情况进行初步调查和抗性评价.结果表明,有219份常用亲本材料表型为高抗(占54.6％),109份材料表现为抗病(占27.2％),51份材料表现为中抗(占12.7％),20份材料表现为感病,2个材料表现为高感;国内引进亲本对甘蔗黑穗病抗性达抗病(R)及以上抗性水平的占90.7％,抗病性表现最优,国外引进亲本和区内自育品种(系)的抗病性水平相当.该调查结果为杂交亲本的选用和新品种的推广提供依据.【期刊名称】《中国糖料》【年(卷),期】2018(040)005【总页数】4页(P30-33)【关键词】甘蔗亲本;黑穗病;抗性;调查【作者】雷敬超;张保青;高丽花;唐仕云;经艳;周珊;高轶静【作者单位】广西农业科学院甘蔗研究所/广西甘蔗遗传改良重点实验室/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室,南宁530007;广西农业科学院甘蔗研究所/广西甘蔗遗传改良重点实验室/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室,南宁530007;广西农业科学院甘蔗研究所/广西甘蔗遗传改良重点实验室/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室,南宁530007;广西农业科学院甘蔗研究所/广西甘蔗遗传改良重点实验室/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室,南宁530007;广西农业科学院甘蔗研究所/广西甘蔗遗传改良重点实验室/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室,南宁530007;广西农业科学院甘蔗研究所/广西甘蔗遗传改良重点实验室/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室,南宁530007;广西农业科学院甘蔗研究所/广西甘蔗遗传改良重点实验室/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室,南宁530007【正文语种】中文【中图分类】S435.661甘蔗是最重要的糖料经济作物，产糖量占世界的三分之二，也是我国最主要的糖料作物之一，我国年产糖约1300万吨，90%以上来自甘蔗。
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农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12(6):685~689*基金项目：国家高技术研究与发展计划（863）项目（No.2002AA241031）和国家自然科学基金项目（No.30170639）联合资助。
阙友雄：男，1980年生，硕士研究生。
**通讯作者。
Author for correspondence.E-mail:<xlpmail@>.收稿日期：2004-04-29接受日期:2004-06-21·研究论文·甘蔗黑穗病菌（Syd.）分子多样性初步分析*阙友雄许莉萍**邹添堂陈如凯（福建农林大学农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室，福州350002）摘要：应用经筛选的13条10bp 随机引物，对来自福建等6个省（区）甘蔗(ssp.)上的18个甘蔗黑穗病菌（）分离物进行了RAPD 分析。
来自福建和广西的2个代号分别为7和9的分离物间，显示出最大的相异系数为0.89474；最小相异系数为0.25217,是在两个福建分离物间出现的。
UPGMA 聚类结果表明，18个分离物在0.75的相异水平上可以聚为6个群体，7个来自不同寄主品种的福建分离物相异系数较小，分布于2个相邻的遗传聚类群中，同时，2个来自同一寄主品种不同地理来源的分离物间，显示出高达0.82353的相异系数。
说明分子多样性同地理来源之间具有一定的相关性，但与寄主来源无关。
关键词：甘蔗；黑穗病菌；RAPD ;分子多样性；UPGMAPrimary Analysis of Molecular Diversity in Populations of theFungusSyd.QUE You-Xiong XU Li-Ping**ZOU Tian-Tang CHEN Ru-Kai(Key Laboratory of Eco-physiology &Genetics Improvement for Sugarcane,Ministry of Agriculture,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)Eighteen isolates were obtained from sugarcane smut fungus (Syd).cultivated in six differentprovinces or regions including Fujian Province.On the basis of isolation of single spore and the acquisition of series of the isolates,13random primers of 10bp were occupied in analysis of genetic diversity by RAPD.The largest dissimilarity coefficient was 0.89474,being observed in two isolates with codes of 7and 9originated from Fujian and Guangxi,respectively;the smallest value of 0.25217was observed in two isolates originated in Fujian.Dendrogram of UPGMA cluster analysis revealed that 18isolates ofSyd.were divided into 6groups according to the dissimilarity coefficient of 0.75.Because of small dissimilarity coefficient,seven iso-lates obtained from sugarcane in Fujian Province belonged to two adjacent groups of cluster Ⅰand cluster Ⅱ.High dissimilarity coef-ficient of 0.82353was observed in two isolates collected from same host origin but with different geographical origin.The results of cluster suggested that the molecular diversity was associated with geographyic origins in some degree,but not related to hostorigin.sugarcane （spp ）;Syd;RAPD;molecular diversity;UPGMA由黑粉菌（Syd.）引起的甘蔗黑穗病是一种世界性病害，也是危害我国甘蔗生产的最主要真菌性病害[1]。
甘蔗属亚热带作物，广西、云南、广东、海南、福建和江西是我国大陆甘蔗的主要种植地，对来自以上主要产区的甘蔗黑穗病病原分离物的遗传分化情况进行研究，无疑对甘蔗抗病育种具有重要意义。
有关该菌小种分化的最新研究认为迄今除了中国台湾存在3个小种外，其余各地均只有2个小种，命名为A 和B [2]。
长期以来，对于甘蔗黑穗病菌生理小种的划分，均采用鉴别寄主法，我国大陆唯一有关该病原菌的研究也是采用鉴别寄主法，认为存在小种1和小种2[2，3]。
近年来，随着分子生物学技术的发展，应用PCR 方法检测甘蔗黑穗病菌存在与否的研究也有报道[4]。
本研究在获农业生物技术学报2004年得系列病菌分离物的基础上，借助RAPD技术，对来自福建等6个省区的18个甘蔗黑穗病菌分离物的DNA多态性进行研究，以初步了解这些不同地理来源或不同抗性水平甘蔗寄主来源的分离物所存在的遗传分化情况，丰富该真菌的遗传多样性，并为甘蔗抗黑穗病育种研究提供有关病原的信息，还可为抗病性鉴定中病原菌的选择提供理论依据。
1材料和方法1.1分离物来源供试的真菌为甘蔗黑穗病菌（Syd.），18个分离物分别来源于我国6个主要甘蔗产区。
单个鞭子采集，分装于纸袋，经太阳晒干或风干后密封，储存在4℃冰箱中，待使用时取出[5]。
18个供试分离物的来源见表1。
1.2DNA的提取以离心收集菌丝体代替传统利用棉花过滤收集菌丝体，采用SDS法提取基因组DNA，-20℃保存备用，具体操作步骤见文献[6]。
在含有0.1%EB的1%琼脂糖凝胶上电泳检测判断其质量。
1.3RAPD反应选用的13条10bp随机引物是从100条随机引物中通过预备实验筛选出来的，而这些备择引物是参考国内外有关病原真菌的RAPD研究文献挑选的[5，7~9]，它们都具有对某种病原真菌的DNA片段多态性和特异性好的特点。
10bp随机引物购自Operon和Sangon公司，PCR引物序列见表2。
实验所用的DNA聚合酶购自上海生工，PCR反应总体积为20μL，各组成成分如下：10×Buffer(含15 mmol/L MgCl2) 2.0μL，dNTPs（10mmol/L）0.3μL，DNA聚合酶3U，Mg2+(10mmol/L)0.3μL，随机引物(5pmol/μL)1.0μL和40ng模板DNA。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；40个循环扩增（94℃变性1min，37℃退火1min，72℃延伸1.5min）；最后在72℃延伸8min。
PCR结束后，在含有0.1%EB的1%琼脂糖凝胶上电泳，用VILBER LOVERMLAT公司凝胶成像系统照相。
所有RAPD图谱均重复2次。
1.4数据处理每个RAPD条带都看作一个性状，以某一DNA片段在样品中出现赋值“1”，不出现赋值“0”，组成“0-1”数据表。
将所得数据输入DPS数据处理系统，采用Nei-Li（Czekanows）聚类距离中的类平均法（UPGMA）进行聚类，自动生成各供试菌株的遗传聚类图和相异系数表。
相异系数：=1-2y/(+)分别代表个体和个体经RAPD扩增反应产生的条带数，为个体和个体经RAPD 扩增产生的共有条带数。
2结果和分析2.1引物筛选和基因组RAPD分析以来自福建（分离物1）和广西（分离物9）的两个甘蔗黑穗病菌分离物基因组DNA为模板，对100个随机引物进行筛选，从中选出13条扩增条带清晰、多态性较好的引物，用于甘蔗黑穗病菌分离物的遗传多样性分析。
用筛选出的13个引物对18个分离物的基因组DNA进行RAPD扩增（重复2次），共扩增出937条较为清晰的DNA条带，13条引物对单一分离物进行扩增所获得的条带数在36~62之间，平均每个分离物所扩增出的条带数为52，其中918条片段大小在0.2~3.0kb之间，同时还扩增出了19条大于5kb的多态性片段。
在所扩增出的DNA条带中，表1用于RAPD分析的甘蔗黑穗病菌分离物Table1Isolates of used in RAPD analysis686表2RAPD 所用引物及其序列Table 2Sequences of primers occupied in RAPD没有一条是18个供试分离物所共有的，且所有扩增条带都是多态性条带，条带多态率为100%。
在供试分离物中，无论是地理来源相同还是寄主来源相同（如来自桂糖94-119）的分离物，没有任何2个分离物扩增出完全一样的DNA 指纹图谱。
但相对而言，地理来源相同的分离物其DNA 带型差异较小，而地理来源不同的分离物其DNA 带型差异较大。
此外，2个寄主来源相同的分离物（分离物7和13）所扩增出的条带数和条带分布也不相同。
说明了在供试各分离物间存在差异的基础上，还表现出同地理来源的一定程度的相关性，但并未表现出同寄主来源的相关性。
图1为RAPD 扩增产物电泳图谱。
2.2供试分离物间的相异性和聚类分析从表3中可以看出，各分离物间的相异系数在0.25217~0.89474之间不等，不同地理来源的分离物间的相异系数较大，来自福建的几个分离物之间的相异系数较小，表明甘蔗黑穗病菌分离物间的相异程度同其地理来源具有一定程度的相关性。
来自同一寄主桂94-119的两个分离物之间的相异系数高达0.82353，并没有表现出分离物的寄主特异性。
同时，一个来源自江西的分离物（13），同来自云南（14）、福建（1）和海南（17）的分离物之间的相异系数较小，分别为0.35354、0.48214和0.46000，这可能是由于品种交换和与之相关的病原菌携带引起的不同地理来源（省份间）分离物实际上同属于一个生理小种，同时，病原菌DNA 之间的相互扩散和重组也会造成相异系数变小。