单克隆抗体制备技术.

合集下载

单克隆抗体制备流程

单克隆抗体制备流程1.鼠标免疫：选择合适的抗原，并将其注射到小鼠或其他啮齿动物的体内。

这样可以激发小鼠体内的免疫系统产生特异性的抗原抗体。

2.细胞融合：在小鼠免疫周期结束后，收集其脾细胞，并将其与癌细胞（如骨髓瘤细胞）进行融合。

这一步骤将产生一组称为杂交瘤细胞的细胞群体，具有免疫系统的特异性。

3.筛选和扩增：将融合细胞在含有抗生素的培养基中进行筛选，以去除非融合细胞和未融合的B细胞。

然后，将融合细胞转移到含有较低抗生素浓度的培养基中，以扩增单克隆细胞株。

4.克隆：通过稀释稀释法或限稀稀释法，将单个细胞分离成单个细胞，并将其分别培养在微孔板中。

培养一段时间后，进行测序和酶联免疫吸附试验（ELISA）等测试，以筛选出产生特异性抗体的克隆。

5.生产和纯化：确定产生特异性抗体的克隆后，可以进行大规模的生产和纯化。

将克隆细胞移植到大容量培养器中，进行大规模培养。

然后，通过收集和离心等步骤收集细胞上清液，获取抗体。

6.特性和稳定性测试：对生产的抗体进行特性和稳定性测试，以确定其特异性、亲和力、稳定性和纯度等参数。

这些测试通常包括ELISA、Western blot、免疫组织化学（IHC）等。

7.应用：将制备好的单克隆抗体用于特定的应用，如免疫组化、免疫印迹、流式细胞术等。

根据需要，可能需要对抗体进行标记，如荧光标记或酶标记，以便在特定实验中进行检测。

总之，单克隆抗体制备流程是一个复杂而耗时的过程，需要经过多个步骤来获得特异性和高亲和力的抗体。

这些抗体可以用于研究、诊断和治疗等领域，对于科学研究和临床应用有着重要的意义。

制备单克隆体常用的技术

制备单克隆体常用的技术制备单克隆体常用的技术其实就像一场科学的魔术秀，让我们看看这些技术是如何发挥神奇的作用的。

大家听说过单克隆抗体吗？那可是免疫学界的明星！它们是由一群小小的B细胞生产出来的，每一种都是独一无二的，专门对付某一种特定的抗原，简直像是打击罪犯的专职警察。

想要制备这些单克隆抗体，首先得从小白鼠、兔子或者其他动物身上开始，给它们注射一些抗原，让它们的免疫系统“惊呼不已”。

然后就开始了一场细胞的狂欢，科学家们会在实验室里将这些免疫细胞收集起来，就像挖掘金矿一样兴奋。

接下来就到了令人激动的融合技术。

这一步就像在做美食，把两种不同的细胞混合在一起。

科学家们会把免疫细胞和癌细胞融合，这样就能产生一种新的细胞，叫做杂交瘤细胞。

这个过程就像是在组建一支超级战队，融合的细胞既能产生抗体，又能不断繁殖，真是一举两得。

然后，科学家们就可以在培养皿里养着这些杂交瘤细胞，等它们长大，简直就像在养小宠物一样。

之后，就要进行筛选了。

这个步骤就像是在找宝藏，科学家们需要筛选出那些能够产生目标抗体的细胞。

这可不是随便找找就能找到的，得用上不同的技巧。

通过ELISA （酶联免疫吸附实验）和其他方法，科学家们能够确定哪些细胞是真正的抗体生产大户。

找到这些细胞后，就像是中了大奖，欢呼雀跃！科学家们会把这些“明星细胞”培养起来，让它们在实验室里繁衍生息，数量越来越多。

然后是抗体的纯化过程。

这里可有些麻烦，得把那些“杂质”去掉，留下真正的好东西。

就像是在做果汁，得把果肉过滤掉，只留下纯正的果汁。

科学家们会用不同的技术，比如亲和层析法，把抗体从培养液中分离出来，确保最终得到的单克隆抗体是纯的、有效的。

经过一番努力，最终得到的抗体就可以用在临床治疗、诊断等各个领域了，真是功德无量。

整个过程可不是一帆风顺，难免会遇到一些小插曲。

有时候细胞不太合作，或者抗体的质量不够好，这时候就需要科学家们耐心调试，继续实验。

就像是打怪升级，每一次失败都是为了下一次的成功积累经验。

单克隆抗体的制备流程

单克隆抗体的制备流程单克隆抗体是通过从一个单一的B细胞克隆中获得的抗体，具有高度特异性和亲和力。

单克隆抗体制备流程主要包括以下几个步骤：免疫原选择、免疫动物注射、细胞融合、筛选和鉴定、扩大培养和纯化。

1. 免疫原选择选择一个适当的免疫原对于获得高质量的单克隆抗体非常重要。

免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类或其他小分子。

在选择免疫原时，需要考虑其特异性、稳定性以及是否能够激发机体产生免疫应答。

2. 免疫动物注射选择适当的实验动物（如小鼠）作为宿主，将免疫原与佐剂混合后注射到动物体内，激发机体产生特异性抗体。

通常情况下，需要进行多次注射以增强机体对免疫原的应答。

3. 细胞融合在动物免疫后，需要从其体内获得抗体产生的B细胞。

一种常用的方法是选择脾细胞作为B细胞的来源。

将脾脏取出并制备成单细胞悬液，然后与骨髓瘤细胞（如SP2/0或NS0）进行细胞融合。

这一步骤通过加入聚乙二醇（PEG）等化合物来促进细胞融合。

4. 筛选和鉴定在细胞融合后，需要对混合细胞进行筛选和鉴定，以筛选出产生特异性抗体的杂交瘤细胞。

常用的筛选方法包括限稀稀释法、ELISA法和免疫组化等。

将混合细胞进行适当稀释，使每个孔中只包含一个杂交瘤细胞，并培养在含有高浓度免疫原的培养基中。

然后使用特异性检测方法检测孔中是否存在特异性抗体。

5. 扩大培养一旦筛选出产生特异性抗体的杂交瘤细胞，需要将其扩大培养。

培养条件需要提供适当的营养物质和生长因子，以确保细胞的生长和抗体的产生。

扩大培养一般采用无血清培养基，如Hybridoma-SFM，并在合适的温度和CO2浓度下进行。

6. 纯化在获得足够量的单克隆抗体后，需要对其进行纯化以去除杂质。

常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等。

通过这些方法可以将单克隆抗体从细胞培养基中纯化出来，并得到高纯度的抗体样品。

7. 鉴定和验证需要对制备的单克隆抗体进行鉴定和验证。

鉴定主要包括检测抗体的特异性、亲和力和稳定性。

单克隆抗体制备

单克隆抗体制备1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。

3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。

每次免疫使用50-100µg免疫原。

4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。

抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。

每个区域大约用1/8的免疫原。

接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。

以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。

5. 第0星期预采血完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。

第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。

第3星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。

第4星期溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。

第5星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。

第X星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。

6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。

用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。

ELI SA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。

7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。

用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。

8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。

亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。

因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。

单克隆抗体制备步骤及注意事项

单克隆抗体制备步骤及注意事项一、脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。

无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。

2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。

3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。

再以同样的方法洗涤离心一次。

4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。

注意事项：➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。

二、骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。

2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。

3.制备细胞悬液，计活细胞数。

4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。

注意事项：➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。

➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。

➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。

小牛血清的浓度一般在10～20%。

细胞的最大密度不得超过106个/mL。

➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。

细胞的倍增时间为16～20小时。

➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。

➢保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。

三、细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。

2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。

单克隆抗体的制备方法与应用

单克隆抗体的制备方法与应用一、前言单克隆抗体是指一种具有高度特异性和亲和力的抗体，其来源于单个B细胞克隆。

相比多克隆抗体，单克隆抗体更加纯净、稳定和可靠，因此在生物医学研究、诊断和治疗等方面有着广泛的应用。

本文将介绍单克隆抗体的制备方法与应用。

二、单克隆抗体的制备方法1. 免疫动物首先需要选取适当的动物进行免疫，通常选择小鼠或大鼠。

在进行免疫前需要对动物进行预处理，例如注射低剂量的抗生素来消除潜在的感染。

2. 免疫原选择选择合适的免疫原是制备单克隆抗体的关键步骤。

常见的选择包括蛋白质、多肽、细胞表面分子等。

在选择时需要考虑到其特异性、稳定性和可重复性等因素。

3. 免疫程序在进行免疫前需要对动物进行预处理，例如注射低剂量的抗生素来消除潜在的感染。

接着，将免疫原注射到动物体内，通常需要多次免疫以增强免疫效果。

在免疫过程中需要对动物进行监测，例如采集血样检测抗体水平。

4. 融合细胞的制备在获得足够的抗体后，需要从动物体内采集B细胞并与骨髓瘤细胞进行融合。

常用的骨髓瘤细胞包括SP2/0和NS0等。

5. 单克隆抗体筛选通过限稀法或单一细胞分离法等方法将融合细胞分离为单个克隆，并通过ELISA、免疫印迹等方法筛选出特异性较高的单克隆抗体。

接着对筛选出的单克隆抗体进行扩增和纯化等处理。

三、单克隆抗体的应用1. 生物医学研究单克隆抗体在生物医学研究中有着广泛的应用，例如作为特定蛋白质或分子的检测工具、用于药物开发和治疗等。

2. 诊断单克隆抗体在诊断方面也有着重要的应用，例如用于肿瘤标志物的检测、病原体的检测等。

3. 治疗单克隆抗体在治疗方面也有着广泛的应用，例如用于治疗癌症、自身免疫性疾病等。

其中一些单克隆抗体已经被批准为药物并用于临床治疗。

四、总结单克隆抗体是一种具有高度特异性和亲和力的抗体，在生物医学领域中有着广泛的应用。

其制备方法包括适当动物选择、合适免疫原选择、多次免疫程序、融合细胞制备和单克隆抗体筛选等步骤。

单克隆抗体的制备

⑷离心，800rpm,6min；⑸弃上清，用含 20％小牛血清HAT选择培养液重悬；⑹ 将上述细胞加入已有饲养细胞的96孔培养板内，每孔100ul ，放入37℃ 5％CO2 培养箱培养
（三）选择杂交瘤细胞及抗体的检测

HAT培养液：次黄嘌呤（H)、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶（T)，氨基蝶呤可阻断DNA的合成。胸腺嘧啶激酶（TK）、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）。如细胞含有此两种酶则可启动补救途径。在HAT培养液中，骨髓瘤细胞缺乏TK或 HGPRT而不能生长，而脾细胞能生长但不能长期增殖而死亡，只有杂交瘤细胞具有以上两种酶故能生长。抗体的检测：RIA、ELISA等。
项目
McAb和常规免疫血清抗体的比较
常规免疫血清抗体多克隆性特异性识别多种抗原决定簇不均一性，质地混杂批与批之间不同低 McAb 单克隆性特异性识别单一抗原决定簇同一类属，质地纯一特异性高，抗体均一高
抗体产生细胞抗体的结合力免疫球蛋白类别及亚类特异性与亲和力有效抗体含量
原理

酵母菌可通过旁路途径激活补体，产生 C3b，酵母菌与C3b结合形成了Y- C3b复合物。若将此复合物与巨噬细胞共育，因巨噬细胞表面有C3b受体，则此复合物可结合到巨噬细胞表面形成Y-C花环。
操作方法

取小白鼠一只，于腹腔内注射1640培养基10ml， 5—10分钟内处死小白鼠抽取腹腔液。吸0.5ml腹腔液滴于洁净玻片上，然后置于湿盒内，放置37℃水浴箱半小时。半小时后取出，用清水冲去玻片上多余的腹腔液（巨噬细胞黏附于玻片上），然后加0.5ml Y-C复合物，置于4℃冰箱20分钟（这个温度巨噬细胞的吞噬作用最弱，而不影响其结合能力）。20分钟后取出染色（瑞姬氏染色），油镜下观察Y-C花环。

单克隆抗体的制备过程及原理

单克隆抗体的制备过程及原理单克隆抗体（monoclonal antibody，简称mAb）是指使用浓度较高的、单种类且结构恒定的抗体，它是具有特定抗原性和可重复使用的特殊免疫球蛋白分子。

单克隆抗体由于特异性、可重复使用、界限清晰等具有重要的理论意义和重要的经济意义，在生物分子的研究、疾病的检测和治疗中已经发挥出重要作用。

单克隆抗体制备的方法有奥托尔·米勒法、佩泰法和融合细胞法等。

其制备过程通常包括以下7个步骤：生物反应物的提取、细胞培养，抗体浓度的上升、表达工艺的改进、纯化工艺的筛选、反应物的表达和功能检测。

（1）生物反应物的提取。

抗体制备过程的第一步是提取有用的生物反应物，例如鼠、猴、牛等动物的血液或淋巴液中的B细胞，或者细菌中的免疫球蛋白定量因子（immunoglobulin，Ig）分子等。

（2）细胞培养。

细胞培养就是将这些细胞表现成抗体制备所需的反应物，而培养方法又分为实验室筛选（laboratory selection）和大规模培养（large-scale production）。

（3）抗体浓度的上升。

在细胞培养过程中，抗体浓度也会随着增加，完成这一步后可以得到单克隆抗体。

（4）表达工艺的改进。

表达工艺是抗体分离纯化的关键步骤。

一般来说，可以采用谷氨酸免疫池（Glu-immune pool）、数字筛选技术（digital selection）、高通量测序技术（high-throughput sequencing）和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）等方法来筛选合适的抗体表达体。

（5）纯化工艺的筛选。

纯化工艺的筛选主要是为了分离抗体的原子或分子结构。

一般采用配体结合、离子交换和溶剂萃取等方法来实现这一步骤。

（6）反应物的表达。

在单克隆抗体表达之前，反应物需要进行细胞系建立和表达调控，以确保抗体的品质和产量。

（7）功能检测。

最后，需要进行单克隆抗体表达体的功能检测，以确定抗体是否具有良好的抗原性和稳定性。

单克隆抗体的制备(详细材料)之欧阳美创编

单克隆抗体的研制一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。

常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。

一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。

即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。

因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。

由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。

因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。

随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。

1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。

这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。

与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。

单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。

Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。

二、杂交瘤技术（一）杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。

单克隆抗体制备

单克隆抗体
monoclonal antibod
单抗：因单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗原分子某一特定决定
簇的特异性抗体。
由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。
1．材料
大鼠神经胶质细胞株瘤杂交瘤细胞株大鼠神经胶质细胞株瘤杂交瘤细胞株（1）经高压灭菌的降植烷。（2）Balb/c鼠：5~8周龄。（3）杂交瘤细胞：取对数生长期的细胞。（4）RPMI—1640培养液（5）新生牛血清
大鼠神经胶质细胞株瘤杂交瘤细胞株
2．操作方法
(1)于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后1～9周内种植细胞。 (2)收取对数生长期的杂交瘤细胞，用5%FCS—1640液洗涤一次， 1000r/min离心10min。 (3)取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用5%FCS—1640液配成 1.0×107细胞/ml的悬液。 (4)给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射1ml（含 1.0×107个细胞/ml）。 (5)接种后10天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔 1~3天取1次，可取10次。血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。
5、单克隆抗体的大量制备
单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。 (1)体内诱生法取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。 (2)体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。

(整理)单克隆抗体的制备技术和纯化及鉴定

单克隆抗体的制备技术和纯化及鉴定一、实验目的：单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。

了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。

二、实验原理：骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。

将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。

经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。

只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。

经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。

三、试剂与器材：细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。

四、操作方法：1、抗原制备；一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。

A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。

一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，杀死小鼠取脾做融合用。

B. 颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。

例如用羊红血球免疫小白鼠，以１％浓度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。

单克隆抗体制备资料

2 阳性克隆转移到24孔细胞培养板中，细胞长满后，上清再检测一次
3 筛选方法应在细胞融合前建立好，一部筛选特异单抗的方法最好
七、杂交瘤细胞克隆
在分泌特异性单抗的杂交瘤细胞中，可能混有不分泌单抗的细胞克隆；另外分泌单抗的克隆在初代不稳定，有一部分细胞染色体常丢失，为了防止不分泌抗体的细胞过度生长，在早期应对细胞进行克隆。常用有限稀释法，一般来说，杂交瘤经过3-4次克隆后就稳定了。
3 融合的细胞要处于对数生长期
三、饲养细胞的制备
1 取清洁级ICR小鼠2只，断颈椎杀死小鼠，置 70%酒精溶液中浸泡10min
2 将小鼠四肢固定，腹部朝上 3 在生物安全柜内，无菌打开小鼠腹部皮肤 4 用20mL注射器吸取15mLMEM营养液，注入小鼠腹腔
5 轻轻挤压小鼠腹腔，并用注射器来回抽吸几次，将小鼠腹腔内的巨噬细胞吸出，置细胞瓶内待用
9 将细胞悬液加至96孔细胞培养板中，每孔23滴，约0.1-0.15mL
10 将细胞培养板置37℃ 饱和湿度的CO2 培养箱中培养
11 培养3天后可取出细胞板在倒置显微镜下观察细胞融合情况
12 培养置第5天时用HAT培养基换液，换1/2 13 7-8天用HT培养基换液，全部换液 14 10-14天后，杂交瘤细胞占孔底1/3以上，
4 一个克隆需亚克隆3-4次，才稳定
5 如有孔污染，可向感染孔及临近孔滴加 1mol/mL的Cu SO4溶液
七、实验室规模抗体制备
体外上清液培养 1 杂交瘤细胞先在25mL 的细胞培养瓶中培养 2 细胞长满瓶底后转至50或100mL的细胞培养瓶中培养 3 当细胞液变黄后，收集上清液，再加新鲜的培养液，并重复收集上清2次 4让细胞长至饱和状态，直至死亡，并收集上清

单克隆抗体的制备技术

单克隆抗体的制备技术单克隆抗体是一种特定的抗体，由同一种克隆的B细胞产生，并具有相同的抗原结合特异性。

这种抗体制备技术是通过将B细胞与瘤细胞融合而形成的杂交瘤细胞来实现的。

以下是关于单克隆抗体制备技术的详细解释。

1. 免疫原制备：要制备单克隆抗体，首先需要准备免疫原。

免疫原可以是蛋白质、多肽、糖脂或其他小分子化合物。

免疫原的选择基于所需抗体的特异性。

一般来说，免疫原应具有较高的纯度，并且能够激发免疫系统产生特定的抗体。

2. 免疫动物免疫：接下来，将免疫原注射到实验动物体内，以激发其免疫系统产生抗体。

常用的实验动物包括小鼠、大鼠或兔子。

在注射过程中，免疫原通常与佐剂混合以增强免疫反应。

注射免疫通常在一段时间内进行多次，以确保充分激发免疫系统产生抗体。

3. B细胞的筛选和融合：在动物免疫后，从其脾脏或骨髓中收集B细胞。

这些B细胞是产生抗体的主要细胞类型。

通过在培养基中培养，可以增加B细胞的数量。

然后，将这些B细胞与一种名为骨髓瘤细胞的癌细胞融合。

这种骨髓瘤细胞有着无限增殖的能力，而B细胞则提供了抗体生产所需的特定性。

4. 杂交瘤细胞的筛选：融合后的细胞形成了杂交瘤细胞。

这些细胞具有两个来源的特性，具有骨髓瘤细胞的无限增殖能力和B细胞的抗体产生能力。

为了筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞，可以使用细胞培养基中的特定抗原进行筛选。

只有与特定抗原结合的杂交瘤细胞才能存活和增殖。

5. 克隆的建立：经过筛选后，单个杂交瘤细胞被分离并单独培养，以建立纯化的单个细胞克隆。

这些克隆细胞会持续产生与免疫原结合的特定抗体。

这些单克隆抗体可以通过培养细胞并收集培养上清液来获取。

6. 单克隆抗体的纯化和特性分析：单克隆抗体的纯化是将其从其他细胞产物和杂质中分离出来。

这通常包括离心、过滤和亲和层析等步骤。

纯化后的抗体可以进行各种特性分析，如亲和性测定、特异性测定和功能性分析等。

这些测试可以验证抗体的特异性和效能。

总结：单克隆抗体的制备技术是一种通过将免疫的动物B细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞的方法。

单克隆抗体制备实验报告

一、实验目的1. 了解单克隆抗体制备的基本原理和实验流程；2. 掌握单克隆抗体制备过程中各步骤的操作方法；3. 通过实验，获得特异性单克隆抗体。

二、实验原理单克隆抗体是由单个B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。

制备单克隆抗体的基本原理是杂交瘤技术，即将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，进而培养出单克隆细胞，最终获得单克隆抗体。

三、实验材料1. 实验动物：Balb/c小鼠；2. 细胞：SP2/0骨髓瘤细胞；3. 抗原：待筛选的抗原；4. 试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、氢氧化铝佐剂、细胞培养液、抗生素、无菌操作器具等。

四、实验步骤1. 动物免疫（1）首免：将抗原与弗氏完全佐剂混合，通过多点注射法注射给Balb/c小鼠，剂量为150-200g/只。

（2）加强免疫：在首免后2-3周，重复首免过程。

2. B细胞提取（1）无菌操作，处死小鼠，取脾脏，制成单细胞悬液。

（2）用细胞分离液分离B细胞。

（3）洗涤、计数，调整细胞浓度。

3. 细胞融合（1）将B细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按一定比例混合，加入聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合。

（2）将融合细胞在含有抗生素的细胞培养液中培养。

4. 杂交瘤细胞筛选（1）在培养液中加入抗原，筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。

（2）将筛选出的杂交瘤细胞进行克隆化培养，获得单克隆细胞。

5. 单克隆抗体制备（1）将单克隆细胞在培养液中扩大培养，收集上清液。

（2）对上清液进行抗体检测，鉴定抗体特异性。

（3）采用适当方法纯化抗体，如亲和层析、离子交换层析等。

五、实验结果1. 成功获得特异性单克隆抗体。

2. 抗体特异性经ELISA等方法验证，与待筛选抗原具有高度特异性。

3. 抗体亲和力良好，可用于后续实验。

六、实验总结本次实验成功制备了特异性单克隆抗体，掌握了单克隆抗体制备的基本原理和实验流程。

在实验过程中，应注意以下几点：1. 动物免疫时，抗原与佐剂的混合比例、注射剂量、注射次数等要严格控制。

单克隆抗体制备简要流程

单克隆抗体制备简要流程
单克隆抗体制备是指由经过严格筛选的单一B淋巴细胞克隆所产生的免疫球蛋白。

与
多克隆抗体相比，单克隆抗体具有更高的特异性和亲和力，常用于临床诊断、治疗和生物
学研究等领域。

1. 免疫原制备
选择适当的免疫原，如蛋白质、多肽、糖类、细胞表面标志物等，制备纯度高的免疫原。

2. 动物免疫
将免疫原注射到小鼠、大鼠、兔子、山羊等动物体内，使其产生抗体。

多次免疫可提
高抗体产量。

3. 获得脾细胞
动物免疫一定时间后，取获得抗体最高的动物的脾脏，制备成脾细胞悬液。

4. 杂交瘤细胞的制备
将获得的脾细胞与哺乳动物体系中的恶性肿瘤细胞进行杂交并筛选得到杂交瘤细胞。

杂交细胞的特点是具有脾细胞的免疫能力和长时间的生长能力。

5. 筛选单克隆抗体
使用ELISA、免疫印迹等技术检测杂交瘤细胞是否产生抗体。

筛选出产生单一种抗体
的细胞克隆。

将筛选得到的细胞克隆大量培养，并收集其分泌的单克隆抗体。

通过某些纯化技术，
如蛋白A、蛋白G亲和层析，将单克隆抗体制备成较纯的制剂。

7. 鉴定和应用
对制备好的单克隆抗体进行活性和特异性的检测，鉴定其性质和效力。

通过结构修饰
或复合其他物质，制备具有更高效能和生物学适应性的单克隆抗体，用于临床诊断、治疗、疫苗开发和科学研究等领域。

以上就是单克隆抗体制备的主要流程，这一技术的发明与发展给医学和生物科技领域
带来了重大的推动和创新。