人同型半胱氨酸(Hcy)ELISA试剂盒说明书

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同型半胱氨酸速率法检测说明书

同型半胱氨酸速率法检测说明书I. 介绍同型半胱氨酸（Homocysteine，简称Hcy）是体内一种重要的氨基酸，它在蛋氨酸代谢过程中形成。

近年来，研究发现Hcy与多种心血管疾病、神经系统疾病以及某些遗传代谢病的发生发展密切相关。

因此，准确、快速地检测Hcy的水平对于疾病诊断与治疗具有重要意义。

II. 检测原理同型半胱氨酸速率法检测基于同型半胱氨酸在特定条件下与酶的催化作用，通过测定反应体系中底物和产物的生成速率来间接测定Hcy的浓度。

该方法的原理简单，操作方便，能够准确地测定Hcy的水平。

III. 检测设备与试剂1. 检测设备：同型半胱氨酸速率法检测仪2. 试剂：- 试剂A：同型半胱氨酸标准品- 试剂B：底物溶液- 试剂C：酶溶液IV. 检测步骤1. 样本处理：- 取适量样本，加入适量去蛋白液混匀，沉淀离心，取上清液作为待测样本。

2. 准备工作：- 分别将试剂A、试剂B和试剂C室温静置至室温。

- 预热同型半胱氨酸速率法检测仪至37°C。

3. 检测步骤：a. 取一定体积的底物溶液加入反应池中。

b. 加入一定体积的试剂A并混匀。

c. 加入一定体积的待测样本混匀。

d. 加入一定体积的试剂C并立即混匀。

e. 将反应池放入预热好的同型半胱氨酸速率法检测仪中进行反应。

f. 按照仪器指示记录一定时间内反应速率的变化。

g. 通过与同型半胱氨酸标准品的比对，计算出待测样本中Hcy的浓度。

V. 结果解读根据检测结果得出的Hcy浓度，可以用作评估患者的心血管疾病和神经系统疾病的风险。

一般来说，Hcy的浓度越高，表示患相应疾病的风险越大。

但具体的标准值要根据医生的指导和临床实际情况来确定。

VI. 注意事项1. 检测前应严格按照说明书的要求储存试剂及设备，避免高温、湿度等不利因素。

2. 操作过程中应注意实验室内无任何污染物干扰，避免误差。

3. 操作时需穿戴个人防护装备，做好安全防护工作。

4. 检测结果仅供医生参考，不能用于自我诊断和自我治疗。

人同型半胱氨酸(Hcy)ELISA试剂盒说明书

本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断人（Human）同型半胱氨酸（Hcy）ELISA检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。

往预先包被同型半胱氨酸（Hcy）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。

用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的同型半胱氨酸（Hcy）呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

样品收集、处理及保存方法1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。

3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。

3000转离心10分钟取上清。

5.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3.37℃恒温箱操作注意事项1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。

从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。

4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5.所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL3mL无检测抗体-HRP10mL5mL无20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释底物A6mL3mL无底物B6mL3mL无终止液6mL3mL无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、1、2、4、8、16μmol/L试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

同型半胱氨酸测定试剂盒(酶循环法)产品技术要求九强生物

注：不同批号的校准品、质控品赋值有差异。

1.1 包装规格包装规格见表1。

1.2 主要组成成分主要组成成分见表2。

表2 主要组成成分注：不同批号的校准品、质控品赋值有差异。

2.1 外观试剂1为无色至淡黄色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物；试剂2为无色至淡黄色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物；校准品为无色至淡黄色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物。

质控品为无色至淡黄色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物。

试剂盒标签标识清晰，外包装完整无损。

2.2 净含量试剂的净含量应不少于标称量。

2.3 试剂空白2.3.1试剂空白吸光度A340nm下测定空白吸光度应≥0.8000。

2.3.2试剂空白吸光度变化率A340nm下测定空白吸光度变化率≤0.0100。

2.4 准确度用国际参考物质NIST SRM1950，对试剂盒进行测试，相对偏差应不超过±15%。

2.5 分析灵敏度样本浓度为10.0 μmol/L时，其吸光度变化率应≥ 0.0100。

2.6 线性线性区间在[1.5,50.0]μmol/L，线性相关系数r应≥0.995，在[1.5,10.0]μmol/L区间内测定的绝对偏差应不超过±1.0μmol/L，在(10.0,50.0]μmol/L范围内测定的相对偏差应不超过±10%。

2.7 测量精密度2.7.1重复性使用高、低不同浓度的样本重复测定10次，其测定值的变异系数（CV％）应不大于3％。

2.7.2批间差随机抽取三批试剂盒的批间相对极差（R）应不大于10%。

2.8质控品赋值有效性使用质控品进行测定，所得结果应在质控范围内。

2.9 稳定性试剂盒在2℃～8℃密封避光保存，有效期为12个月。

取到效期后试剂盒进行检测，检测结果应符合2.1、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7.1、2.8的要求。

2.10校准品溯源性按照GB/T 21415-2008《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》的要求，提供所用产品校准品的来源、赋值过程以及测量不确定度，试剂盒校准品溯源至ID-LC/MS/MS参考方法。

人同型半胱氨酸(Hcy)ELISA试剂盒说明书

人同型半胱氨酸（Hcy）酶联免疫分析试剂盒使用说明书厦门慧嘉生物科技有限公司本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中同型半胱氨酸（Hcy）的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人同型半胱氨酸（H cy）水平。

用纯化的人同型半胱氨酸（H cy）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入同型半胱氨酸（H cy），再与HRP标记的羊同型半胱氨酸（H cy）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的同型半胱氨酸（H cy）呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人同型半胱氨酸（H cy）浓度。

试剂盒组成：样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。

通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。

加入一定量的PBS，PH7.4。

用液氮迅速冷冻保存备用。

同型半胱氨酸检测试剂盒产品技术要求

同型半胱氨酸检测试剂盒产品技术要求同型半胱氨酸(Homocysteine, HCY)是一种重要的氨基酸，它在体内的代谢过程中，参与甲硫酸盐和硫酸葡萄糖胺的形成以及尿苯丙氨酸的代谢。

正常情况下，体内HCY的浓度较低，但如果HCY的产生量过高或清除速度减慢，就会导致HCY浓度升高，从而引发多种健康问题，如心血管疾病、新生儿缺陷、神经系统疾病等。

1.灵敏度：该检测试剂盒的灵敏度应足够高，能够准确测量HCY浓度的变化。

测量的线性范围应广泛，能够覆盖普通人群和高危人群的HCY浓度范围。

2.准确性：检测试剂盒应具有较高的准确性，能够在不同样本中精确测量HCY的浓度。

它应可靠地区分正常浓度和异常浓度，并提供准确的浓度结果。

3.精密度：检测试剂盒应具有较高的精密度，能够重复测量同一样本以获得一致的结果。

它应具有较低的内部和外部变异性，以确保可靠的实验重复性和结果比对性。

4.反应速度：检测试剂盒应能够在合理的时间内完成反应，并提供可靠的测量结果。

反应时间不宜过长，以节省实验时间。

5.操作简便性：检测试剂盒应具有操作简便的特点，使实验操作人员能够方便、快速地使用该试剂盒进行测量。

试剂盒应包含清晰明确的使用说明书，以便用户能够正确操作和解读结果。

6.安全性：检测试剂盒应符合安全性要求，不含有有害物质或重金属等对操作人员和环境有害的成分。

同时，应提供必要的标识和保护措施，以确保使用过程中的安全性。

7.长期稳定性：检测试剂盒应具有较长的稳定性，可以长期保存而不会失去活性。

试剂盒应提供有效期和储存条件等相关信息，以便用户能够合理储存和使用。

8.适用范围：检测试剂盒应适用于不同类型的样本，如血液、尿液等，以满足不同场景下HCY测量的需求。

总之，同型半胱氨酸检测试剂盒(酶法)的技术要求包括灵敏度、准确性、精密度、反应速度、操作简便性、安全性、长期稳定性和适用范围等方面，以确保该产品能够准确、可靠地测量HCY浓度，为相关疾病的诊断和治疗提供科学依据。

同型半胱氨酸测定检测操作程序【范本模板】

概述血清同型半胱氨酸(Hcy)是人体内含硫氨基酸的一个重要的代谢中间产物，可能是动脉粥样硬化等心血管疾病发病的一个独立危险因子。

Hcy水平升高被认为是动脉粥样硬化性疾病独立的渐进性致病因素,血浆中同型半胱氨酸含量与遗传因素、营养因素、雌激素水平、年龄因素等有关,同型半胱氨酸又称为高半胱氨酸，Hcy的正常参考值随测定方法和种族人群的不同而有所不同，一般正常空腹血浆总Hcy水平为5-15μmol/L。

研究表明：Hcy每升高5umol/L脑卒中风险升高59％，缺血性心脏病风险升高32%；Hcy每降低5umol/L脑卒中风险降低24％，缺血性心脏病风险降低16%。

Hcy水平与心血管事件风险呈正相关.1 目的规范血清同型半胱氨酸检测测试，确保检测结果准确性和重复性。

2 检测方法和原理2.1检测方法：速率法2。

2检测原理：本产品基于一种新型酶法，样本中的氧化型Hcy被转化为游离型Hcy后，进行一系列循环反应，这种基于共价底物转化产物的酶循环反应系统大大提高了检测的灵敏度，主要是利用S—腺苷同型半胱氣酸（SAH)水解酶反应原理，在该反应中SAH被水解酶水解成腺苷和Hcy，腺苷立即水解成氨和次黄嘌呤,氨在谷氨酸脱氢酶的作用下,NADH 转化为NAD,样本中Hcy浓度与NADH转化速率成正比。

3 标本采集与保护新鲜无溶血血清或EDTA、肝素抗凝血浆遵守以下推荐的血清标本处理，运行和储存步骤3。

1用真空采样管采集血液标本时须遵守常规注意事项3.2离心前使标本完全自然形成凝块3.3全程保证样品管的密闭状态3.4尽快分离血清，并及时测定3.5如果标本不能在24小时内检测或运送标本时，将标本保存在4℃或更低温度的环境中：3。

6冷藏标本室温放置20分钟后再测定；3。

7冷冻标本室温解溶后放置20分钟后再测定3.8不符合标本处理3.8。

1溶血和乳糜血标本在报告单的备注栏注明3.8。

2标本量过少的标本，严重溶血和乳糜血标本与临床沟通并将标本退回，填写不合格标本拒接登记。

同型半胱氨酸检测试剂盒(酶法)产品技术要求

医疗器械产品技术要求编号：同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法）1.产品型号/规格及其划分说明序号规格1R1：2×50ml、R2：2×5ml、R3：2×9ml（2×250Tests）2R1：2×50ml、R2：1×10ml、R3：1×18ml3R1：1×50ml、R2：1×5ml、R3：1×9ml2.性能指标2.1外观试剂R1溶液应呈粉红色、无颗粒、无杂质；试剂R2溶液应呈黄色、无颗粒、无杂质；试剂R3溶液应呈淡黄色、无颗粒、无杂质。

2.2净含量试剂盒各试剂装量应不小于标示值。

2.3试剂空白吸光度应为≤0.20。

用蒸馏水作为样品加入试剂测试,试剂空白吸光度A660nm2.4分析灵敏度测试40μmol/L被测物时，吸光度差值（△A）应不小于0.02。

2.5线性范围在（0～40）μmol/L范围内，其线性相关系数r≥0.990；浓度≥6μmol/L时，相对偏差≤20%；浓度＜6μmol/L时，绝对偏差≤1μmol/L。

2.6测量精密度2.6.1重复性用控制血清重复测试所得结果的重复性（变异系数，CV）应≤10.0%。

2.6.2批间差批间差应≤10.0%。

2.7准确度用参考物质进行测试，其相对偏差应≤20.0%。

3.检验方法仪器基本要求a）波长：660nm；温度：37℃±1℃。

b）全自动生化分析仪。

测试方法按说明书规定，因不同机型使用试剂最终浓度相同。

在此推荐以本公司BECKMAN或HITACHI全自动生化分析仪进行测试。

3.1外观和性状目测检查，试剂R1、R2、R3溶液性状应符合2.1的要求。

3.2净含量用通用量具进行测量，应符合2.2的要求。

3.3试剂空白吸光度用蒸馏水作为样品测试试剂（盒），在测试波长660nm下，记录测试启动时的吸光度（A1）和约5min(t)后的吸光度（A2），A2测试结果即为试剂空白吸光度测定值，应符合2.3的要求。

hcy综述资料

同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法）综述资料1、产品的预期用途：1.1产品的预期用途同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法）用于定量测定人体血清或血浆中同型半胱氨酸的含量。

1.2与预期用途相关的临床适应症背景情况同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）又称高半胱氨酸，是蛋氨酸去甲基后形成的一种含硫氨基酸，属于蛋氨酸循环的中间产物。

有关其代谢紊乱的报道最早来源于先天性胱硫醚合成酶缺乏导致出现同型半胱氨酸尿患者的观察。

此后，又相继发现其他几种参与HCY代谢的酶或辅酶改变所引起的代谢紊乱。

近几年来，随着测定技术方法的改进，已经能够对正常人血浆中以各种形式存在的HCY进行测定，并且发现在心、脑及外周血管疾病、慢性肾功能不全、牛皮癣、维生素B12缺乏等疾病的患者中存在HCY的代谢紊乱。

对同型半胱氨酸的研究始于20世纪70年代，1969年首次提出高同型半胱氨酸血症可致动脉粥样硬化并可形成血栓后，人们逐渐发现人体血清中同型半胱氨酸的含量与冠心病、脑血管疾病、外周血管疾病和静脉血栓的发生和发展有着密切的关系，而且随着同型半胱氨酸含量的增加发生血管疾病的危险也呈递增趋势。

高同型半胱氨酸通过氧自由基介导引起血管内皮损伤，不同浓度的血清Hcy还可通过抑制内皮细胞DNA的合成，影响内皮功能及细胞形态改变，并促使血管平滑肌细胞增殖，导致动脉粥样硬化。

血清Hcy可使血小板受损，使血小板的黏附性和聚集性增加。

血清HCy尚能改变花生四烯酸代谢，使血栓素A2合成增加，血栓素A2具有收缩血管和促血小板聚集的作用。

血清Hcy还通过抑制凝血酶调节蛋白在内皮细胞表面的表达及活性，进一步抑制蛋白C的激活，影响凝血酶的灭活。

血清Hcy还能增加组织因子的活性，激活凝血酶，导致血管系统的血栓少形成。

目前越来越多的资料显示Hcy与脑血管病有着紧密的联系。

甚至有人认为Hcy水平升高是脑血管病的一项独立危险因素和重要危险因子。

研究分析表明，随着血浆Hcy水平的增高，患缺血性脑血管病的相对危险度逐渐增加，与非Hcy患者相比，Hcy患者患缺血性脑血管病相对危险度增加。

同型半胱氨酸HCY检测

同型半胱氨酸HCY检测1 检验目的指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。

2 实验原理同型半胱氨酸（Hcy）是蛋氨酸代谢产生的一种含硫氨基酸，80%在血中通过二硫键与蛋白结合，只有很少一部分游离同型半胱氨酸参加循环。

同型半胱氨酸经过一系列的反应后，生成340nm波长检测吸收光度值变化与HCY浓度呈线性关系。

3 标本：3.1 病人准备:应禁食12小时抽血.3.2 类型：新鲜不溶血的血清3.3 标本存放留取标本后请尽快分离血清。

在冰箱保存的条件下（2～8℃）稳定3天，-20℃保存至少可以稳定3个月。

3.4 标本运输室温条件下运输3.5 标本拒收标准细菌污染的不能做测定。

4 实验材料4.1 试剂:北京万泰德瑞诊断技术有限公司HCY测定试剂盒（京械注准20152401106）4.1.1 试剂组成乳酸脱氢酶 >35KU/L 丝氨酸 0.76mmol/lNADH 0.47mmol/l 胱硫醚合成酶>20KU/L胱硫醚裂解酶>10KU/L4.1.2 试剂准备：试剂为即用式。

4.1.3 试剂稳定性与贮存：2～8℃密闭保存，效期为12个月；开盖2～8℃保存，可稳定28天。

4.1.4 变质指示：当试剂有看得见的微生物生长，有浊度，或者未开盖的液体有沉淀时，表明试剂已变质，不能继续使用。

4.2 校准品：使用北京万泰德瑞诊断技术有限公司提供的HCY标准品血清进行校准操作。

4.3 质控品：使用正常值、病理值复合控制品。

5 仪器AU2700生化分析仪，罗氏P800生化分析仪, 西门子ADVIA-2400生化分析仪，东芝TBA-120生化分析仪6 操作步骤6.1 样品的准备：将标好号的样品离心后放到仪器规定的位置。

6.2 试剂的检测：仪器开机后，检查各种试剂的位置，体积等确认无误后方可进行测定。

6.3 项目基本参数：参见生化检验AU2700生化分析仪，罗氏P800生化分析仪，西门子ADVIA-2400生化分析仪，东芝TBA-120生化分析仪项目测定参数。

同型半胱氨酸测定检测操作程序

同型半胱氨酸测定检测操作程序同型半胱氨酸（Homocysteine, Hcy）是一种非常重要的氨基酸，它在人体中有着重要的代谢作用。

高水平的同型半胱氨酸与多种疾病的发展有关，包括心血管疾病、神经系统疾病等。

因此，同型半胱氨酸的测定对于临床诊断和治疗非常重要。

下面是同型半胱氨酸测定的操作程序。

1.实验前准备1.1准备所需试剂和仪器设备。

1.2温度、湿度和光照条件要符合实验要求。

1.3检查设备和仪器是否处于正常工作状态。

2.样品处理2.1收集需要测定的样品，如血浆、血清等。

2.2将样品置于冰盒中，迅速送至实验室进行处理。

3.样品准备3.1取一个新的离心管，加入适量的样品。

3.2加入适量的稳定剂，用于防止同型半胱氨酸的分解。

3.3 用离心机进行离心，离心条件为xxx g，离心时间为xxx min，将上清液倒入新的离心管中。

4.同型半胱氨酸测定4.1准备标准曲线：取不同浓度的同型半胱氨酸标准品，加入相同体积的稳定剂，得到一系列浓度的标准溶液。

4.2取相应体积的样品上清液和稀释液，加入反应体系中。

4.3预测反应管中加入酶、底物等反应物，根据实验方案中的测定方法进行操作。

4.4将反应混匀后，置于恒温水浴中保持适当温度进行反应。

4.5反应结束后，加入止反应剂停止反应。

4.6使用比色计或荧光检测仪器，测定反应液的吸光度或荧光强度。

4.7根据标准曲线，计算样品中同型半胱氨酸的浓度。

5.数据处理和结果分析5.1将测得的吸光度或荧光强度值与标准曲线进行对应，得到同型半胱氨酸的浓度值。

5.2根据实验设计和需求，对数据进行统计分析，如平均值、标准差等。

6.质控措施6.1在实验过程中，加入质控样品进行比对和验证。

6.2根据实验方案的要求，进行对照组和实验组的比较。

7.结果报告和分析7.1根据实验结果，生成报告。

7.2根据实验要求，对结果进行分析和解释。

以上就是同型半胱氨酸测定的操作程序。

在进行该实验过程中，需要保持操作规范，遵守实验室安全操作规程，确保实验结果的准确性和可靠性。

同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒(酶循环法)产品技术要求科美

同型半胱氨酸（HCY）测定试剂盒(酶循环法)适用范围：本试剂盒用于体外定量测定人血清中同型半胱氨酸（HCY）的浓度。

1.1包装规格1.2主要组成成分2.1.外观2.1.1试剂1应为无色或淡黄色透明溶液，无混浊，无未溶解物；2.1.2试剂2应为无色或淡黄色透明溶液，无混浊，无未溶解物；2.1.3校准品应为无色透明溶液，无混浊，无未溶解物；2.1.4质控品应为无色透明溶液，无混浊，无未溶解物；2.2.净含量液体试剂的净含量应不少于标示值。

2.3.试剂空白HCY试剂盒在波长340nm处测定空白样品的吸光度值，应不小于0.8000。

2.4.分析灵敏度HCY试剂盒测试10.0μmol/L HCY时，吸光度变化率（ΔA/min）应不小于0.0100。

2.5.准确度测定有证参考物质SRM1955，相对偏差应不大于15%。

2.6精密度2.6.1重复性重复测试（10.0±2.0）μmol/L的样本，所得结果的变异系数CV应不大于5%；重复测试（20.0±4.0）μmol/L的样本，所得结果的变异系数CV应不大于3%；2.6.2批间差测试（10.0±2.0）μmol/L的样本，所得结果的批间相对极差应不大于10%；2.7.线性范围HCY试剂盒在[3，50] μmol/L范围内，线性相关系数（r）应不小于0.995；在[3.0，10.0] μmol/L区间内，线性绝对偏差应不超过±1.0μmol/L；在(10.0，50.0] μmol/L区间内，线性相对偏差应不超过±10%。

2.8.质控品赋值有效性重复测定质控品，测定结果应在质控范围内。

2.9.稳定性原包装的试剂盒在2～8℃密封避光保存，有效期为12个月。

原包装校准品与质控品在2～8℃密封避光贮存，有效期为18个月。

在有效期满后2个月内，试剂性能应符合2.1、2.3、2.4、2.5、2.6.1、2.7、2.8的要求。

同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒(酶循环法)产品技术要求beiaotaikang

同型半胱氨酸（HCY）测定试剂盒（酶循环法）适用范围：本试剂盒用于体外定量检测人血清中同型半胱氨酸的浓度。

1.1 产品规格1.2 组成成份该试剂盒由试剂1（R1）、试剂2（R2）、校准品（选配）和质控品（选配）组成。

1.2.1试剂1（R1）主要组分：S-腺苷甲硫氨酸（SAM） 0.1mmol/LNADH 0.3mmol/ L三（2羧乙基）膦氯化氢（TCEP） 0.5mmol/L1.2.2试剂2（R2）主要组分：α-酮戊二酸 5.0mmol/L 同型半胱氨酸甲基转移酶（HMT）≥5.0KU/L谷氨酸脱氢酶（GLDH）≥10.0KU/LS-腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAH）≥3.0KU/L腺苷胶氨酶（ADA）≥5.0KU/L1.2.3校准品(CaL)的组成PBS缓冲液 50mmol/L同型半胱氨酸：包含2个水平水平1：0.0-20.0μmol/L，具体浓度见瓶签；水平2：20.0-50.0μmol/L，具体浓度见瓶签。

1.2.4质控品(QC)的组成牛血清中添加同型半胱氨酸，稳定剂＜1%。

定值范围：（8-16）μmol/L，（16-30）μmol/L。

2.1 外观a) 液体双试剂：试剂1应为透明溶液，无混浊，无未溶解物；试剂2应为透明溶液，无混浊，无未溶解物。

b) 校准品：无色至淡黄色溶液。

c) 质控品：无色至淡黄色液体。

2.2 净含量液体试剂的净含量不得低于标示体积。

2.3 试剂空白吸光度试剂空白吸光度应≥0.800，试剂空白吸光度变化率应不大于0.050/min。

2.4 分析灵敏度HCY试剂盒测定浓度20.0μmol/L的被测物时，吸光度变化率（ΔA/min）应在0.010-0.200范围内。

2.5 线性范围在[3,50]μmol/L范围内，线性相关系数r应≥0.9900；在[3.0,20.0]μmol/L范围内线性绝对偏差应不超过2.0μmol/L，在(20.0,50.0]μmol/L范围内线性相对偏差应不超过±10%。

同型半胱氨酸测定试剂盒产品技术要求科美

同型半胱氨酸测定试剂盒产品技术要求科美同型半胱氨酸(HCY)是一种由半胱氨酸和甲硫氨酸经酶引起的脱氨作用产生的一种氨基酸。

其水平的增高与多种疾病的发病和发展密切相关，因此准确测定体内同型半胱氨酸的水平具有重要的临床意义。

为此，同型半胱氨酸测定试剂盒(酶循环法)被广泛应用于临床诊断和疾病研究。

产品技术要求1.灵敏度：同型半胱氨酸测定试剂盒的灵敏度应该达到或超过临床测量所需的水平。

灵敏度越高，能够检测到更低浓度的同型半胱氨酸，可以提高对疾病早期诊断的准确性。

2.精确度：试剂盒测定结果应该具有高度的准确性，即在重复测量中具有较小的变异性。

使用同一样本进行多次测量时，测定结果之间的差异应该尽可能小。

3.特异性：试剂盒测定方法应该具有高度的特异性，即不受与同型半胱氨酸结构相似的其他化合物的干扰。

特异性越高，测定结果越可靠。

4.稳定性：试剂盒的试剂和试剂原液应该具有良好的稳定性，能够在常规存储条件下保持其活性和性能的一致性。

这样可以减少试剂对环境条件的敏感性，并延长试剂盒的使用寿命。

5.操作简便性：试剂盒的操作步骤应该简洁明了，不需要繁琐的调样和稀释，以节省实验时间并降低实验操作的难度。

6.自动化程度：试剂盒应该能够适应自动化分析系统的要求，能够与常见的自动化分析设备无缝集成，实现更高的样本处理效率和分析准确性。

7.包装规格：试剂盒的包装规格应该根据实际需求进行选择，以满足不同规模实验室的使用要求。

8.临床应用：试剂盒的性能和结果应该符合临床应用的要求，可以用于各种人群的同型半胱氨酸测定，提供高质量的临床数据支持。

总结：同型半胱氨酸测定试剂盒(酶循环法)的产品技术要求包括灵敏度、精确度、特异性、稳定性、操作简便性、自动化程度、包装规格和临床应用等方面。

满足这些技术要求的试剂盒能够广泛应用于临床诊断和疾病研究，并为相关领域的科研人员提供可靠的实验工具。

同型半胱氨酸测定试剂盒(酶循环法)产品技术要求haifeng

同型半胱氨酸测定试剂盒(酶循环法)适用范围：本产品适用于体外定量测定人血清中的同型半胱氨酸（HCY）含量。

1.1 产品规格1.2 主要组成成分注：校准品、质控品具有批间、赋值特异性，具体值详见靶值单。

2.1 外观2.1.1试剂盒标签标识清晰，外包装完整无破损；2.1.2试剂1为无色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物；2.1.3试剂2为无色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物；2.1.4校准品：无色液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物；2.1.5质控品：无色液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物。

2.2 净含量净含量不低于标示值。

2.3 空白吸光度2.3.1 空白吸光度测定待检试剂在主波长340nm、副波长405nm、37℃条件下：A≥0.8；2.3.2 空白吸光度变化率空白吸光度变化率≤0.020/min(1cm,340nm/405nm 37℃)。

2.4 线性范围[3,50]μmol/L，相关系数r≥0.995；[3,10]µmol/L范围内绝对偏差≤±1.0µmol/L；（10,50]µmol/L范围内相对偏差应≤±10%。

2.5 分析灵敏度在产品说明书规定参数设定条件下，测定浓度为10.0μmol/L校准血清，△A/min≥0.01。

2.6 精密度2.6.1批内重复性CV≤5%。

2.6.2 批间差相对极差R≤10.0%。

2.7 准确度与已上市产品比对：[3,50]µmol/L范围内相关系数r≥0.990；[3,10]µmol/L范围内绝对偏差≤±1.0µmol/L；（10,50]µmol/L范围内相对偏差应≤±10%。

2.8 校准品均一性CV≤5%；2.9 质控品2.9.1赋值有效性测定值在质控靶值范围内。

2.9.2均一性CV≤5%。

2.10 稳定性未开封试剂2℃～8℃储存，可稳定12个月。

同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒(酶循环法)产品技术要求lideman

同型半胱氨酸（HCY）测定试剂盒（酶循环法）适用范围：本产品用于体外定量测定人体血清中同型半胱氨酸的含量。

1.1规格试剂1（R1）：1×48mL、试剂2（R2）：1×13mL；校准品（选配）：低值1×1mL、高值1×1mL；低值质控品（选配）：1×1mL；高值质控品（选配）：1×1mL。

1.2 组成试剂盒由试剂、校准品（选配）和质控品（选配）组成。

试剂1（R1）：腺苷甲硫氨酸（SAM）:0.1 mmol/L；NADH :0.2 mmol/L；三乙羧乙基膦(TCEP) :0.5 mmol/L。

试剂2（R2）：α-酮戍二酸：5.0 mmol/L；HCY甲基转移酶 (HMTase) ：5.0 KU/L；谷氨酸脱氢酶：10 KU/L；S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHase)：3.0 KU/L；腺苷脱氨酶：5.0 KU/L。

校准品的组成：2个水平的液体校准品，在人血清基质添加同型半胱氨酸（纯度＞99%），添加人血清的比例为5%，稳定剂<0.1%；定值范围： (7.0～11.0) μmol/L、(26～38) μmol/L。

质控品的组成：2个水平的液体质控品，在人血清基质中添加同型半胱氨酸（纯度＞99%），添加人血清的比例为5%，稳定剂<0.1%；定值范围：(10.0～17.9) μmol/L、(18.0～25.0) μmol/L。

2.1 外观液体双试剂：试剂1（R1）及试剂2（R2）：无色至浅黄色澄清液体。

校准品：无色至浅黄色澄清液体。

质控品：无色至浅黄色澄清液体。

2.2 净含量液体试剂的净含量不得低于标示体积。

2.3 溯源性：根据GB/T 21415及有关规定提供校准品的来源、赋值过程及测量不确定度等内容，该校准品溯源至参考物质（SRM1955，NIST）。

2.4 空白吸光度在37℃、340nm波长、1cm光径条件下，用去离子水或（生理盐水）作为样品加入试剂测试时，试剂空白吸光度应>0.80 ABS。

同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒（酶循环法）说明书

同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒（酶循环法）说明书【产品名称】同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒（酶循环法）【包装规格】a)试剂1：1×18mL试剂2：1×5mLb)试剂1：1×33mL试剂2：1×9mLc)试剂1：2×66mL试剂2：2×18mLd)试剂1：1×66mL试剂2：1×18mL【预期用途】用于体外定量测定人血清中同型半胱氨酸的含量。

高HCY水平可导致动脉血管壁内皮片状脱落，同时刺激平滑肌细胞增生，引起血管损伤，出现类似动脉粥样硬化性病理改变。

测定同型半胱氨酸常用于冠心病、中风、高血压、老年痴呆等疾病的辅助诊断[1]。

【检验原理】同型半胱氨酸被转化为游离型后，通过与共价底物反应，同时产生腺苷。

腺苷立即水解成氨和次黄嘌呤，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性（NADH）转化为NAD+，样本中的同型半胱氨酸的浓度与NADH的变化率成正相关。

【主要组成成分】试剂1主要组分磷酸盐缓冲液100mmol/L S-腺苷甲硫氨酸盐（SAM）0.1mmol/L β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性（NADH）0.2mmol/L 三（2羧乙基）磷氯化氢（TCEP）0.5mmol/L α-酮戊二酸 5.0mmol/L 修饰化的HCY甲基转移酶（HMTase） 5.0KU/L 谷氨酸脱氢酶（GLDH）10.0KU/L ProClin300适量试剂2主要组分磷酸盐缓冲液100mmol/L 修饰化的S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）水解酶 3.0KU/L 腺苷脱氨酶（ADA） 5.0KU/L ProClin300适量注：不同批号试剂盒中各组分未经试验不可互换。

【储存条件及有效期】1.试剂原包装在2～8℃储存，有效期为12个月，生产日期、有效期见标签。

2.开口后的试剂在仪器仓中（2～8℃）可稳定30天。

【适用仪器】艾威德AS-420/AS-660/AS-1200；日立HITACHI7020型/7060型/7180型/7600型/LABOSPECT008AS型；贝克曼AU400/AU480/AU640/AU680/ AU2700/AU5400/AU5800/AU5811/AU5821；佳能TBA-FX8/TBA-120FR/ TBA-2000FR；罗氏cobas8000c702/cobas8000c701/cobas8000c502；西门子SIEMENS ADVIA1800/ADVIA2400；雅培ABBOTT ARCHITECTc8000/ARCHITECT c16000/ARCHITECT ci8200；西森美康SYSMEX BM6010/C；科华KHB卓越310/卓越330/卓越400/卓越450/ZY-1200/ ZY-1280；迪瑞CS-240/CS-T300/CS-300B/CS-380/CS-400A/CS-400B/ CS-600A/CS-600B/CS-800A/CS-800B/CS-1200/CS-1200ISE/CS-1300B/ CS-1400；迈瑞MINDRAY BS-220/BS-330/BS-350E/BS-380/BS-390/ BS-400/BS-430/BS-600/BS-800/BS-2000M；颐兰贝ES-200/ES-380/ES-480；赛诺迈德SUNMATIK-9050型；雷杜Chemray420；英诺华D280；特康TC6010L；锦瑞GS400；普康6066。

同型半胱氨酸（HCY）测定试剂盒（酶循环法）产品技术要求sainuopu

同型半胱氨酸（HCY）测定试剂盒（酶循环法）产品技术要求sainuopu同型半胱氨酸（HCY）测定试剂盒（酶循环法）适⽤范围：⽤于体外定量测定⼈体⾎清中同型半胱氨酸的含量。

1.1 试剂盒包装规格试剂1：1×20ml，试剂2：1×5ml；试剂1：2×40ml，试剂2：2×10ml；试剂1：3×40ml，试剂2：3×10ml试剂1：4×60ml，试剂2：4×15ml；试剂1：2×400ml，试剂2：1×200ml；试剂1：1×8L，试剂2：1×2L。

校准品（选配）：2×1ml(两⽔平)。

质控品（选配）：2×1ml(两⽔平)。

1.2试剂盒主要组成成分2.1 外观试剂盒各组分应齐全，完整，液体⽆渗漏。

包装标签⽂字符号应清晰。

液体双试剂：试剂1⽆⾊⾄浅黄⾊澄清液体；试剂2⽆⾊⾄浅黄⾊澄清液体。

校准品：⽆⾊⾄淡黄⾊澄清液体。

质控品：⽆⾊⾄浅黄⾊澄清液体。

2.2 净含量液体试剂的净含量不得低于标⽰体积。

2.3 试剂空⽩吸光度在37℃、340nm波长、1cm光径条件下，试剂空⽩吸光度应不⼩于0.8。

2.4 分析灵敏度测定浓度为10µmol/L样本时，吸光度变化值（ΔA）应不⼩于0.02。

2.5 线性范围在(2.5，50) µmol/L范围内，线性相关系数∣r∣不⼩于0.995。

在（2.5，10]µmol/L区间内的线性偏差不超过±1.0µmol/L，(10，50) µmol/L区间内线性偏差不超过±10%。

2.6 重复性重复测试（10.0±2.0）µmol/L的样本，所得结果的变异系数（CV）应不⼤于5%。

重复测试（20.0±4.0）µmol/L的样本，所得结果的变异系数（CV）应不⼤于3%。

同型半胱氨酸检测试剂盒(酶循环法)简化说明书

包装规格：试剂一：21ml×1 瓶试剂二：6ml×1 瓶
储存条件及有效期：本试剂盒 2-8℃可以稳定一年。夏季运输注意冷藏，不得冷冻。打开包装后，2-8℃开瓶避光
可稳定 7 天。
适用仪器：本试剂适用于日立，奥林巴斯，贝克曼，东芝和杜邦生化分析仪。
样品要求：新鲜血清或血浆。样本可在室温下稳定 4 天，2-8℃稳定几周，-20℃稳定数月或数年。不可以使用含有氟化钠的血清或血浆。溶血，浑浊，严重脂血样本不适宜做 Hcy 检测。采血前尽量避免
同型半胱氨酸-甲基转移酶催化下与 S-腺苷同型半胱氨酸（SAM）反应生成甲硫氨酸和 S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）。SAH 被 SHA-水解酶水解形成腺苷和 Hcy。生成的 Hcy 进入 Hcy-甲基转移酶催化的催化反应，形成循环反应。这个循环反应导致了检测信号的明显放大。形成的腺苷立即脱氢转化为次黄苷和氨，氨进一步在谷氨酸脱氢酶催化下和 NADH 反应，将 NADH 转化变为 NAD。在 340.nm 处检测 NADH 减少造成的吸光度下降量与样品同中性半胱氨酸的浓度成比例。
同型半胱氨酸检测试剂盒（酶循环法）简化说明书
检测意义：本试剂通过测定人血清同型半胱氨酸的浓度，辅助相关疾病的诊断。同型半胱氨酸主要作为
心血管疾病，尤其是冠状动脉粥硬化和心肌梗死的危险指标，它的浓度升高程度与疾病的危险性成正比，是诱发心血管疾病的一个独立危险的因素。
测定原理：氧化性的同型半胱氨酸（Hcy）被还原为游离态的同型半胱氨酸，游离态的同型半胱氨酸在
高蛋白饮食，可导致 HCY 升高。血清样本检测结果常比抗凝血浆检测结果高 5-10%。
检测方法：
1、试剂配制：本试剂为液体，可直接使用。
2、测定条件：
主波长

1、ELISA 试剂盒使用说明书（5 孔板格式）

ELISA kitInstruction Manual5-plate formatJuly, 2006For research use only.Not for use in diagnostic or therapeutic procedures.ContentsAbbreviations 2 Introduction 3 Contents of the kit 4 Hazard information 4 Materials and reagents required but not provided 4 Working solutions 4 General procedure 5 Coating antibodies 5 Blocking 5 Test samples and standards 5 Biotinylated detector antibodies 5 SPP conjugate 5 Substrate 5 Cytokine standards 6 Storage kit reagents 6 Directions for washing 7 Trouble shooting 7 References 8AbbreviationsAPC Antigen presenting cellsBSA Bovine serum albuminCD Cluster of differentiationCSB Cytokine stabilization bufferDMSO Dimethyl sulfoxideELISA Enzyme linked immunosorbent assayGM-CSF Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor IFN InterferonIL InterleukinMHC Major histocompatibility complexOD Optical densityPB Phosphate bufferPBS Phosphate buffered salinePBST PBS containing 0.05% Tween-20PBST-B PBST containing 0.5% bovine serum albuminSPP Streptavidin-HRP polymerT h T helper subsetTMB TetramethylbenzidineTNF Tumor necrosis factorIntroductionCytokines are a group of regulatory proteins critically involved in many physiological processes such as immune recognition, cell differentiation and cell proliferation. They have been identified in many vertebrate species and are produced by a variety of different cell types. Cytokines are usually produced transiently and locally, acting in a paracrine or autocrine manner. They interact with high affinity cell surface receptors specific for each cytokine or cytokine group and are active at very low concentrations mostly in the picogram range.It is well known now that the type of an antigen-specific immune response largely depends on the selection or preferential activation of defined CD4+T cell subsets (i.e. T h1 and T h2). Activation of these subsets is characterized by the secretion of distinct patterns of cytokines. T h1, but not T h2 cells, primarily secrete IL-2 and IFN-γ while T h2, but not T h1 cells, produceIL-4, IL-5, IL-6, IL-10 and IL-13. Other cytokines, such as TNF-α and GM-CSF are produced by both T h subsets. In addition, the production of IL-12 and IL-10, produced by antigen presenting cells (APC) such as macrophages and dendritic cells, critically contributes to the preferential expansion of T h1- or T h2-type of cells. For instance, early production of IL-12 is considered essential for the development of T h1 cells. On the other hand, the absence or low concentrations of IL-12 and IFN-γ in the early phase of an immune response and concomitant production of IL-4 by cells of the mastcell/basophil lineage or T cells themselves is known to favor the development of T h2 cells. In addition to their regulatory effects on T h subset differentiation, the cytokines released by the two types of T h cells also produce distinct effector functions. For instance, IL-4 and IFN-γhave differential or antagonistic activities on immunoglobulin isotype selection or MHC class II expression. Therefore, the properties of an immune response can be best studied by determining the amounts of cytokines produced by the responding T cells and APC.Contents of the kitItemsQuantity(5-plate format)StorageconditionsCoating antibodies 1 vial 4ºC (39ºF)Cytokine standard 5 vials 4ºC (39ºF)Biotinylated detector antibodies 1 vial 4ºC (39ºF)SPP conjugate (Streptavidin-HRP polymer) 1 vial ≤ -20ºC (-4°F)TMB substrate tablets 5 4ºC (39ºF)Substrate buffer capsules 5 Rt*BSA stock solution (10%) 2 vials (24 ml) 4ºC (39ºF)Cytokine stabilization buffer (CSB)** 1 vial (5 ml) 4ºC (39ºF)Tween-20 1 vial (5 ml) Rt*ELISA plates8 Rt*Adhesive cover slips 10 Rt** Room temperature** For serum and plasma samples only; see under “Test samples and standards”Materials and reagents required but not provided•PB stock: dissolve 96.0 g Na2HPO4.2H2O plus 17.5 g KH2PO4in 1.0 L distilled water and adjust pH to 7.4•Sterile distilled water•H2SO4•Dimethyl sulfoxide (DMSO)•Pipetting devices for the accurate delivery of volume required for the assay performance •Plate washer: automated or manual (squirt bottle, manifold dispenser, etc)•Reading device for microtiter-plate set to 370, 450 and/or 655 nmWorking solutions•PBS: add 10 ml PB stock and 8.8 g NaCl to 1 L distilled water. Adjust pH to 7.4.Alternatively, use commercially available liquid PBS from Invitrogen or other suppliers.Do not use commercially available PBS tablets for the preparation of the coating solution (the filler in the tablets interferes with the coating process).•PBST: 0.5 ml Tween-20 dissolved in 1 L PBS.•PBST-B: 2 ml BSA stock solution (10%) added to 38 ml PBST.•Blocking buffer: 2 ml BSA stock solution (10%) added to 18 ml PBS (for 1 ELISA plate). •Substrate buffer: the contents of one capsule is dissolved in 100 ml distilled water (takes approximately 5 minutes). For optimal performance, the buffer solution should be used within60 minutes.•Stopping solution: 2 M H2SO4TMB (tetramethylbenzidine) and sodium perborate (in substrate buffer)General procedureCoating antibodies•Reconstitute the lyophilized antibodies by injecting 250 µl of sterile distilled water into the vial. Mix the solution gently for approximately 15 seconds and allow it to stand for 2 minutes at room temperature. Avoid vigorous shaking. To coat 96 wells of an ELISA plate 50 µl is pipetted out of the vial (or use a frozen aliquot of 50 µl; see "Storage kit reagents") and added to 5 ml PBS. Mix gently.•Add 50 µl of diluted antibody solution to each well of the ELISA plate and fill up to 100 µl with PBS.•Seal the plate to prevent evaporation.Incubate overnight at 4ºC or alternatively 1 to 2 hours at 37ºC.Blocking•Remove the coating antibody solution and wash the wells at least six times with PBST. •Add 200 µl of blocking buffer.•Seal the plate and incubate at 37ºC for 1 hour.Test samples and standards•Remove the blocking buffer but do not wash.•Add 1/20 volume of CSB to serum or plasma samples but not to other samples such as cell culture supernatants; CSB inhibits the degradation of cytokines in pure serum or plasma. •Dilute standards and test samples in an appropriate diluent (see “Cytokine standards”). •Add 100 µl to each well.•Seal the plate and incubate at 37ºC for 2 hours or overnight at 4ºC.Biotinylated detector antibodies•Remove test samples/standards and wash the wells at least six times with PBST. •Reconstitute the lyophilized antibodies by injecting 0.5 ml of sterile distilled water into the vial. Mix the solution gently for approximately 15 seconds and allow it to stand for 2 minutes at room temperature. Avoid vigorous shaking. Hundred microliter is pipetted out of the vial (or use a frozen aliquot of 100 µl; see "Storage kit reagents") and added to 10 ml PBST-B.Mix gently.•Add 100 µl of diluted antibody solution to each well.•Seal the plate and incubate at 37ºC for 1 hour.SPP conjugate•Remove detector antibody solution and wash the wells at least six times with PBST. •Reconstitute the contents of the vial by injecting 0.5 ml of sterile distilled water into the vial.Mix the solution gently for approximately 15 seconds and allow it to stand for 1 minute at room temperature. Avoid vigorous shaking. Hundred microliter is pipetted out of the vial (or use a frozen aliquot of 100 µl; see "Storage kit reagents") and added to 10 ml PBST-B. Mix gently.•Add 100 µl to each well.•Seal the plate and incubate at 37ºC for 1 hour.Substrate•Remove SPP conjugate and wash the wells at least six times with PBST.•Dissolve one TMB tablet in 1.0 ml DMSO (vortex at high speed for 5 minutes for complete dissolution)and than add 10 ml substrate buffer.•Mix thoroughly and immediately dispense 100 µl into each well. Leave the plate on the laboratory bench at room temperature (color development between 10 and 30 minutes).The substrate produces a soluble end-product that is blue in color and can be read spectrophotometrically at 370 or 655 nm. The reaction can be stopped by adding 50 µl of2 M H2SO4 (resulting in a yellow solution which can be read at 450 nm).Cytokine standardsFor maximum recovery, the vial with lyophilized cytokine standard should be reconstituted in 0.5 ml distilled water and allowed to stand for 1 minute at room temperature. Thereafter, the reconstituted cytokine standard (stock solution) is placed on melting ice and is immediately diluted as indicated below (preferentially within one hour). Use vials with cytokine standards only once.Please note that temperature of buffers and standard solution(s) should now be kept at 0-4ºC until use in the ELISA.The total amount of cytokine standard is indicated on the label of the vial (ng/vial). After reconstitution in 0.5 ml water, the concentration (ng/ml) will become twice the amount on the label [e.g. amount on label is 4.8 ng/vial; after reconstitution, the concentration becomes9.6 ng/ml = 9600 pg/ml].The standard stock solution is diluted to 320 pg/ml in PBST-B (highest concentration cytokine to be used in the standard range).The linear region of the cytokine standard curve is now obtainable in a series of two-fold dilutions in PBST-B ranging from 320 to 5 pg/ml. Always include a blank control (PBST-B only) in the standard range.Before establishing the standard curve, the OD value of the blank control (OD.bl) is subtracted from the measured OD values of the different standard solutions. The standard curve is now plotted as the standard cytokine concentration versus the corresponding (measured) OD value minus OD.bl. In addition, the actual OD values of the test samples are determined by subtracting OD.bl from the measured OD values.The concentration of the cytokine in the test sample can then be interpolated from the standard curve. It is useful to prepare a series of dilutions of the unknown test sample to assure that the OD will fall in the linear portion of the standard curve.Note 1: The OD value measured for the blank control (OD.bl) must be below 0.2.Note 2: for measuring cytokines in cell culture supernatant, samples should be diluted inPBST-B. However, when measuring cytokines in pure serum or plasma, the diluent for the standard and blank control should preferentially be control serum or plasma originating from the same species.Storage kit reagentsThe vials with lyophilized coating antibodies and biotinylated detector antibodies can be safely stored in a refrigerator for a defined length of time (expiry date indicated on the vial). After reconstitution, the antibodies remain fully active for minimal 6 months at 4ºC (39ºF) when kept sterile. However, it is strongly recommended to divide the reconstituted antibody solutions into small aliquots for single use. These aliquots should be stored at ≤-20ºC. Under these conditions the antibodies are stable for at least one year.Upon arrival, the vial with lyophilized SPP conjugate should be stored at ≤ -20°C. Storage of the vial at room temperature or at 4ºC for several months may lead to lower OD readings in the ELISA. After reconstitution, the SPP solution is stable for 2 months at 4°C but rapidly looses activity when stored at room temperature. It is strongly recommended that after reconstitution, the solution is immediately divided into small aliquots for single use and stored at ≤-20°C. Under these conditions SPP is stable for minimal 12 months.Directions for washing•Incomplete washing will adversely affect the assay. All washing must be performed with wash buffer (PBST).•Washing can be performed manually as follows: completely aspirate the liquid from all wells by gently lowering an aspiration tip (aspiration device) into each well. After aspiration, fill the wells with at least 300 µl wash buffer. Let soak for 10 to 20 seconds, then aspirate the liquid. Repeat as directed under "General procedure". After washing, the plate is inverted and tapped dry on absorbent paper.•Alternatively, the wash buffer may be put into a squirt bottle. If a squirt bottle is used, flood the plate with wash buffer, completely filling all wells. After washing, the plate is inverted and tapped dry on absorbent paper.•If using an automated washing device, the operating instructions should carefully be followed.Trouble shooting•Poor consistency of replicates can be overcome by increasing the stringency of washes particularly after the incubation step with detector antibody.•High values of the blank control (optical density > 0.2) can be overcome by shortening the incubation time with the substrate solution or is caused by improper washing procedures. •Inconsistent replicates may be due to cross-contamination of wells by improper pipetting procedures.•If no signal is observed in the wells with the standards•try a new vial with cytokine standard•check the pH of the substrate solution (between 5.0 and 5.5)•verify whether the antibody, SPP conjugate and standardpreparations were properly diluted•Avoid sodium azide in wash buffers and diluents, as this is an inhibitor of peroxidase activity.•Storage of reconstituted SPP at room temperature for several days can lead to a significant loss of SPP activity and consequently low OD readings.ReferencesBooks:•Practice and theory of enzyme immunoassays 1985In: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology, Vol.15 (eds R.H.Burdon and P.H. van Knippenberg)Science Publishers bv, Amsterdam, The Netherlands•ELISA and other Solid Phase Immunoassays.Theoretical and Practical Aspects 1988(eds D.M.Kemeny and S.J.Challacombe)John Wiley & Sons Ltd, Chichester, UK• A practical guide to ELISA 1991(ed D.M.Kemeny) Pergamon Press, Oxford, UKReview of U-CyTech ELISA references:Human cytokines:•Arend, S.M. et al. 2000 J. 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