美国药学科学家协会(AAPS) 2015年海报系列 - 多因子检测与Biomarker筛选

美国药学科学家协会(AAPS) 2015年会海报系列
Fit-for-Purpose多因⼦子检测与⽣生物标志物筛选
Fit-for-Purpose Multiplex Panels and
Their Utility in Biomarker Screening
（1）Abstract
⽬目的：
以筛选Biomarker为⽬目的的探索性实验对于药物研发和临床诊断⾮非常重要，可能会涉及到100多种Biomarkers。

然⽽而，⼤大规模多因⼦子检测产⽣生的信号⼲干扰问题，会误导筛选结果。

在此研究中，选择部分多因⼦子检测衡量其筛选的效果。

⽅方法：
使⽤用MSD的MULTI-ARRAY专利技术，仅1mL样品即可检测122个指标。

这些⽅方法使⽤用了15个不同的多因⼦子检测组合，并遵循fit-for-purpose原则。

针对稀释倍数，稀释液成分，以及试剂的特异性均进⾏行了优化。

检测组合⾥里包含MSD的经过验证的V-plex Human Biomarker 40-plex，检测指标涉及炎症，免疫，⾎血管⽣生成，⾎血管创伤等；还包含10种不同的多因⼦子检测组合。

结果：
为便于进⾏行⽅方法学的优化及确保性能，多因⼦子组合使⽤用10-plex的形式，即每孔检测10个因⼦子。

检测⽅方法学展现出低于1%的⾮非特异性结合。

每个10因⼦子组合的的线性范围横跨3-4个数量级，以便于同时检测出正常样本和疾病样本。

疾病样本组选择了⾎血清，EDTA⾎血浆，脑脊液，尿液。

每个检测⽅方法在不同板⼦子之间有良好的重复性。

在定量检测范围以内的样本中，⼤大多数⽅方法学的板内差异均值（CV）低于10%。

结论：
使⽤用⽆无偏差的⽅方法学进⾏行Biomarker筛选，确保了快速鉴定出有临床重要意义的标志物。

不同多因⼦子组合的检测辅助了病⼈人群体的区分，并能⽤用于监控疾病活动。

这种多因⼦子检测技术对于使⽤用少量样本筛选⼤大量指标的项⽬目⼗〸十分理想。

（2）Methods
样本检测使⽤用MSD MULTI-ARRAY技术的Biomarker检测组合。

根据fit-for-purpose的⽅方法学，122个biomarker划分为15个不同的多因⼦子检测组合。

针对稀释倍数，稀释液成分，以及试剂的特异性均进⾏行了优化。

其中5个组合是MSD的经过验证的V-plex Human Biomarker 40-plex试剂盒，剩下的使⽤用了10个多因⼦子组合。

使⽤用少于1mL样品即可检测全部122个指标。

电化学发光技术：
1)最⼩小化⾮非特异性背景信号，
获得⾼高信号反应，从⽽而产⽣生
极⾼高的信号背景⽐比例。

2)激发机制（电）与信号（光）
分离，最⼩小化了基质干扰。

3)只有在电极表⾯面处的结合标
记被激发，从⽽而可以建⽴立
non-washed⽅方法。

4)标记稳定，⽆无放射性，并容
易偶联到⽣生物分⼦子。

5)620nm激发光消除了颜⾊色衰
减问题。

6)每个标记的多重激发循环提
⾼高光信号级别，并提升灵敏
度
7)⽯石墨电极板表⾯面的结合能⼒力
⽐比普通聚苯⼄乙烯⼤大10倍
8) 可以定制表⾯面的包被物体。

（3）Specificity
为确认检测抗体的特异性，混合的校准液与单个检测抗体⼀一起测试。

15个多因⼦子组合都进⾏行了这种测试。

我们发现绝⼤大多数的⾮非特异⼲干扰低于1%。

代表性数据如下：
（4）Sensitivity
LLOD（最低检测下限）是⼀一种计算出的浓度，其基于空⽩白的2.5标准偏差。

最少重复检测6次以⽤用于计算平均LLOD。

ULOD（最⾼高检测上限）是最⾼高的校准液浓度。

在以下表格中罗列了本研究中的检测极限，并标注了稀释⽐比例。

⼤大多数⽅方法针对所有样本基质采⽤用了相同的稀释倍数。

CRP，ICAM-1, SAA 和VCAM-1的⾎血清⾎血浆稀释了1000倍，脑脊液和尿液稀释了5倍。

（5）Sample Testing
20份⼈人⾎血清，20份EDTA⾎血浆，8份尿液，8份脑脊液，使⽤用15个多因⼦子组合检测。

⼤大多数测试中，样本都被检测出来。

IL-17B，IL-17D和IL-21在普通⼈人样本中并未检测出来。

检测浓度在前⼀一页表格中。

（6）Reproducibility
根据在检测范围内的样本计算出平均CV。

V-PLEX Human Biomarker 40-Plex的⽅方法，从COA中即可获得其定量检测上下限（LLOQ和ULOQ）。

其他⽅方法可以估计其定量极限。

LLOQ估为平均LLOD的5倍，ULOQ估为ULOD的80%。

在⾎血清，EDTA⾎血浆，脑脊液中，⾄至少90%⽅方法的平均CV低于10%。

在尿液中，70%的平均CV低于10%。

⼀一些较⾼高CV经常和低内源性浓度（见本⽂文第5节）。

以下⽅方法的平均CV ⼤大于20%。

> ⾎血清 - IL-2，IL-13，IL-17，PYY（total）, Osteopontin.
> EDTA⾎血浆 - Eotaxin-3
> 脑脊液 - IL-2，IL-4，IL-13， RANTES
> 尿液 - IL-1a, VEGF-A, IL-16, C-Peptide, E-Selectin, NT-proBNP, cTnT, Myl3, CKMB, Myoglobin, Osteoprotegerin, MCP-2, MET。

这些标准曲线的平均CV也计算了。

98%的标准5浓度的平均信号CV低于10%。

CKMB ⽅方法的平均CV⼤大于20%。

这个⽅方法已经进⼀一步优化并延长了动态范围。

（未在此列出数据）
重复性（精确度）使⽤用基于基质的对照，并在⼀一天内⽤用6块板测试。

代表数据如下：
（7）Conclusion
MSD的Biomarker筛选试剂盒包含了性能稳定的定量⽅方法。

这些⽅方法线性范围⼴广，使科研⼈人员容易获得精确的定量数据。

对于⼤大部分⽅方法，多种不同的样本类型可以使⽤用⼀一个稀释浓度检测。

这些试剂盒使⽤用了简单的操作流程，可以在⼀一个板上检测10个biomarker。

这122个biomarker只使⽤用了不到1mL的样本。

这些试剂盒可以⽤用于定量不同基质样本（如⾎血清，⾎血浆，脑脊液，尿液）的biomaker。

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